Name: 성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 골격근 재생을 연구하기 위한 냉동 손상 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 배우세요 성인 제브라피쉬 꼬리 꽃자루에서 냉동 손상을 이용한 골격근 재생 연구 방법을. 이 기법은 조직 복원 메커니즘과 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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물고기 관리에 대해 V. Zimmermann과 이 프로젝트의 시작과 예비 결과에 대해 Thomas Bise 박사, Catherine Pfefferli 박사 및 Lea Gigon에게 감사드립니다. 이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (Swiss National Science Foundation)의 보조금 번호 310030_208170의 지원을 받았습니다.

이 연구는 모든 관련 윤리 규정에 따라 수행되었습니다. 제브라피쉬는 유럽 실험동물과학협회 연맹(FELASA) 가이드라인25에 따라 사육, 사육 및 유지되었다. 동물 사육장과 모든 실험 절차는 스위스 프리부르(Fribourg)의 주 수의과 사무실에서 승인했습니다.
1. 장비 및 설정
<ol><li>연구용 기기를 제조할 수 있는 기술 작업장에서 스테인리스강 극저온 탐침 생산을 준비합니다. 알림: 특정 치수로 기기 설계를 제공하십시오(그림 1A).</li>
	<li>시술 중 프로브를 취급하는 동안 동상을 방지하려면 핸들을 피펫 팁에 삽입하고 테이프로 감쌉니다.</li>
	<li>마취 작업 용액을위한 비커, 물고기를 다루기위한 숟가락, 촉촉한 스폰지 및 시술 후 물고기가 회복 될 수 있도록 시스템 물이 담긴 탱크를 준비하십시오.</li>
	<li>모든 실험 전에 작업 용액을 새로 준비하십시오. 작업 용액을 준비하려면 비커에 있는 시스템 물 100mL에 Tricaine 원액 4mL를 추가합니다. 참고: 마취 원액은 980mL의 증류수에 용해된 4g의 Tricaine으로 구성됩니다. 1 M Tris-HCl로 pH를 7로 조절한 후, pH 9로 용액을 1 L로 증류수로 채운다. 원액은 빛에 민감하며 호박색 병에 4°C에서 보관해야 합니다.</li>
</ol>2. 근육 냉동 손상 절차
<ol><li>프로브를 액체 질소에 최소 3분 동안 담그는 것으로 절차를 시작합니다. 스폰지를 시스템 물에 적시고 평평한 표면에 놓습니다.</li>
	<li>성인 제브라 피쉬 한 마리를 Tricaine 작업 용액으로 옮기고 1 분 또는 2 분 후에 숟가락으로 물고기를 부드럽게 만져 반응이 없는지 확인하십시오. 물고기가 여전히 반응이 있으면 조금 더 기다리십시오.</li>
	<li>마취 된 물고기를 젖은 스폰지에 놓습니다. 꼬리 지느러미의 뒤쪽과 꼬리 지느러미의 앞쪽에 꼬리 꽃자루를 찾습니다.</li>
	<li>액체 질소에서 cryoprobe를 제거합니다. 팁에 잔류 액체 질소가 남아 있지 않도록 프로브를 부드럽게 흔듭니다.</li>
	<li>주걱의 가장자리를 꼬리 꽃자루의 몸체에 수직으로 놓습니다 (그림 1C). 압력을 가하지 않고 프로브를 6초 동안 이 위치에 유지합니다(그림 1D). 알림: 크라이오프로브의 무게는 기기와 조직 사이의 접촉을 보장하기에 충분합니다.</li>
	<li>조직에서 cryoprobe를 방출하고 시스템 물이 있는 수조에 물고기를 옮깁니다.</li>
	<li>마취에서 깨어 난 후 호흡과 수영을 재개하는 동안 물고기를 모니터링하십시오. 30 초 후에 수술 운동이 일어나지 않으면 동물이 스스로 호흡을 시작할 때까지 시스템 물을 아가미에 피펫 팅하여 물고기를 자극하십시오. 알림: 물고기는 회수 탱크에서 몇 분 안에 수영을 재개해야 합니다. 알림: 다음 날에는 물고기를 촬영하여 수영 활동을 모니터링할 수 있습니다(비디오 1 및 비디오 2). 비디오 녹화 전에 대조군과 부상당한 물고기를 반투명 짝짓기 탱크로 옮기고 최소 1분 동안 습관화하도록 합니다.</li>
</ol>3. 꼬리 꽃자루 수집 및 고정
<ol><li>후속 분석에 적합한 4% 포르말린 또는 기타 고정액 2mL, 페트리 접시, 겸자 및 수술용 가위를 준비합니다.</li>
	<li>지역 수의과 사무소의 법적 허가에 따라 냉동 손상 후 선택된 시점에 물고기를 안락사시킵니다. 참고: 안락사는 트리카인 용액(300mg/L)을 약 10분 동안 과다 복용하여 수행됩니다. 아가미 움직임의 상실과 꼬리 지느러미 꼬집음 반사는 죽음을 확인합니다. 안락사 시점은 재생 단계에 따라 선택해야 합니다: 예를 들어, 냉동 손상 후 1일(dpci)에서 상처 제거를 위한 3dpci까지; 근육 재생의 시작을 위해 3 dpci에서 10 dpci까지; 재생 진행을 위해 10 DPCI에서 30 DPCI까지; 조직 복원을 완료하기 위해 30 DPCI 후. 따라서 근육 변성 및 재생의 다양한 단계와 생물학적 과정을 평가하기 위해 냉동 손상 후 다양한 시점에서 물고기 그룹을 안락사시켜야 합니다.</li>
	<li>안락사된 물고기를 탈이온수가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 가위를 사용하여 꼬리 꽃자루의 앞뒤쪽을 절단합니다(그림 1E). 페트리 접시의 탈 이온수에서 조직이 흘러 나오게하십시오.</li>
	<li>꼬리 꽃자루를 모으고 집게로 미세 원심 분리기 튜브에 준비된 고정 용액으로 옮깁니다. 알림: 튜브를 조심스럽게 여러 번 뒤집고 4 °C에서 밤새 보관하십시오.</li>
</ol>4. 꼬리 꽃자루 장착
<ol><li>고정된 티슈를 1x PBS로 로커에서 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 4°C에서 탈이온수에 미리 냉각된 30% 자당이 있는 2mL 미세원심분리 튜브로 옮기고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집습니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 똑바로 세운 상태로 24°C에서 최소 4시간 동안 그대로 두십시오. 참고: 꼬리 꽃자루는 자당 용액 위에 떠 있고 조직이 탈수됨에 따라 가라앉기 시작합니다.</li>
	<li>5mm 층의 O.C.T. 장착 매체로 임베딩 몰드를 채웁니다. 집게를 사용하여 매체의 꼬리 꽃자루를 조정하십시오. 금형 바닥에 놓고 횡단면 또는 관상 단면의 방향을 조정합니다(그림 1F).</li>
	<li>매체를 드라이 아이스 상자에서 얼리십시오. 조직이 원하는 위치에서 안정화되자마자 OCT가 완전히 얼기 전에 나머지 금형을 채웁니다. 금형을 -80°C에서 최소 1시간 동안 보관하십시오. 참고: 이러한 조건에서 조직은 수개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 저온 유지 장치로 섹션 절단
<ol><li>절단 두께가 25μm인 저온 유지 장치를 설치합니다. 챔버 온도를 -26°C로, 시편 온도를 -24°C로, 절단 각도를 12°로 조정합니다.</li>
	<li>시편과 함께 얼어붙은 블록을 저온 유지 장치에 넣고 블록 바닥과 평행하게 절단하기 위해 방향을 고정합니다. 표본에 도달할 때까지 자른 다음 블록을 다듬어 시료 수집을 용이하게 합니다.</li>
	<li>6 개의 접착 슬라이드를 준비하십시오. 샘플의 복제를 준비하기 위해 슬라이드에 연속된 숫자로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>절단을 시작하고 라벨이 붙은 접착 슬라이드에서 조직 부분을 수집합니다. 추가 실험 요구 사항에 따라 슬라이드의 섹션을 정렬합니다.</li>
	<li>슬라이드를 실온에서 1시간 동안 건조시키십시오. -20 °C에서 밀폐된 상자에 보관하십시오. 알림: 슬라이드는 이 상태에서 최대 1년 동안 안전하게 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>

성인 제브라피쉬의 꼬리 꽃자루 냉동 부상

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제브라피쉬는 근육 재생 메커니즘을 연구하기 위해 anamniote 척추동물 모델 유기체를 제공합니다. 레이저 절제술 또는 찔린 상처와 같은 현존하는 대부분의 부상 방법은 비교적 경미한 조직 파괴를 초래한다20,21,22,23. 외안근26에 대한 주요 절제술이 시행되었습니다. 그러나 이 외과적 접근은 체벽 절단의 건강상의 위험 때문에 외측 근육계에 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 침습적 절차를 피하기 위해 이 프로토콜은 꼬리 꽃자루에 심각한 손상을 초래하는 경미한 형태의 부상을 설명합니다. 이 접근법은 신체의 한쪽에 있는 몇 개의 근섬유를 매우 정밀하게 표적화할 수 있는 피상적인 조작에 의존합니다. cryoinjury 모델의 강점은 재현성과 광범위한 근육 퇴행을 생성하는 능력에 있습니다. 이러한 강점을 바탕으로 이 모델은 신체가 상당한 근육 손실에 어떻게 반응하는지 연구할 수 있는 새로운 경로를 제공합니다.
극한의 추위가 가해지면 열 충격이 일어나 영향을 받는 근육 조직의 원형질막과 세포 소기관이 파괴됩니다(27). 결과적으로, 손상된 근섬유는 "우발적인" 세포 사멸을 겪는다28. 결과적으로, 손상된 조직은 상처 제거의 자연적 메커니즘에 의해 재 흡수 될 수 있습니다. Zebrafish는 사전 냉각된 프로브가 정확한 기간 동안 신체에 올바르게 배치되었다는 점을 감안할 때 이 연구의 생존율이 거의 100%였기 때문에 냉동 손상 절차를 잘 견뎌냅니다. 그러나 상처가 너무 광범위하면(예: 너무 많은 압력이 가해지거나 냉동 손상 기간이 너무 긴 경우) 물고기는 시술 직후 비정상적인 수영 동작을 보일 수 있으며 동물은 인도적 종점으로 안락사되어야 합니다. 다른 어종의 경우 cryoprobe에 대한 노출 시간은 신체의 크기에 따라 조정되어야 합니다.
냉동 손상 후 물고기는 비정상적인 움직임의 증상없이 수영 활동을 재개 할 수 있습니다. 그러나 냉동 부상당한 물고기는 대조군 물고기보다 덜 역동적으로 헤엄치며 이는 약간의 경미한 장애를 나타냅니다. 냉동 손상 후 다른 시점에서 물고기 행동의 추가 정량화는 수영 성능의 시간적 변화를 결정하는 데 필요합니다.
꼬리 꽃자루의 다른 비근육 조직에 대한 냉동 손상 방법의 효과는 아직 밝혀지지 않았습니다. 분명히, 가장 바깥쪽의 체층(즉, 피부)은 절차에 의해 손상됩니다. 이러한 맥락에서 냉동 손상 방법은 상처 치유, 비늘 재생 및 색소 침착 패턴의 복원을 연구하는 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 또한, 자궁 내막의 혈관 구조와 신경 분포도 냉동 손상의 영향을받을 수 있으며 이러한 주제는 추가 조사가 필요합니다.
cryoinjury 모델은 이전에 제브라피쉬 심장 재생13,14,15,29를 조사하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 콜라겐이 풍부한 흉터의 일시적인 침착으로 인해 심실 절제법(10)에 비해 몇 가지 이점을 보여주었으며, 이는 인간30의 경색 치유 반응을 더 잘 모방한다. 놀랍게도, 제브라피쉬는 여러 번의 냉동 손상 후에 심장을 재생할 수 있습니다31. 흥미롭게도, cryoinjury는 제브라 피쉬 지느러미에도 적용되어 조직 분해 과정을 초래했다12. 고전적인 지느러미 절단과 달리 나머지 냉동 손상 그루터기에는 죽은 물질과 건강한 세포가 혼합된 왜곡된 가장자리가 있습니다. 제브라피쉬 기관인 심장과 지느러미를 모두 대상으로 한 연구에 따르면 제브라피쉬가 광범위한 조직 손상 후에도 원래의 기능적 구성 요소를 복원하는 강력한 능력이 밝혀졌습니다. 냉동 손상된 골격근이 회복 과정과 재생 과정 사이의 상호 작용을 활성화하는지 여부는 향후 연구를 보증합니다.

척추 동물에서 다양한 조직의 손상된 부분은 평생 동안 항상성 재생 및 복원을 거칩니다. 이러한 재생 및 회복 능력은 전형적으로 유능한 줄기 세포의 존재 또는 성숙한 세포의 증식 능력에 달려 있다 1,2. 골격근은 위성 세포라고 불리는 국소 줄기 세포와 관련된 유사분열 후 근섬유로 구성됩니다 3,4,5,6. 따라서,이 조직에는 연속성이 중단 된 영역을 효율적으로 밀봉하거나 경미한 상처를 복구하기위한 세포 공급원이 포함되어 있습니다. 그러나 포유류 골격근의 체적 손실이 커지면 섬유증(fibrosis)과 같은 비재생 복구가 뒤따르는 경우가 많다7. 동물 모델은 광범위하게 손상된 장기의 재생을 촉진하는 생물학적 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
제브라피쉬는 높은 재생 능력을 가진 잘 정립된 모델 유기체입니다. 성체 제브라피쉬는 꼬리 지느러미의 절단된 부분이나 심장 심실의 절제된 정점을 재생할 수 있습니다 8,9,10,11. 또한, 제브라피쉬12,13,14,15의 지느러미와 심장 재생을 연구하기 위해 냉동 손상 방법이 이전에 적용되었습니다. 내부 장기의 경우, 냉동 손상 방법은 장기 무결성을 방해하지 않고 세포 사멸을 유도하여 생리적 조건을 모방하는 이점이 있습니다16,17. 조직 파편은 상처 치유 중 자연 제거에 의해 분해되고 회복 과정이 뒤 따른다. 그러나 이 방법이 골격근에 적용될 수 있는지 여부는 아직 확립되지 않았습니다.
물고기의 경우, 측면 근육은 수영하는 동안 몸통을 좌우로 구부릴 수 있게 한다18. 골격근은 결합 조직 5,19에 의해 분리되는 자궁 내막이라고 불리는 metameric 단위로 구성됩니다. 제브라피쉬는 레이저 절제나 찔린 상처 20,21,22,23,24와 같은 경미한 조직 파괴 후에 근육을 재생할 수 있지만 광범위한 손상 후에 전체 자궁근이 재생될 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 이러한 지식의 격차는 아마도 적절한 부상 모델이 없기 때문일 것입니다. 이 프로토콜은 여러 자궁 근막에 걸쳐 골격근의 광범위한 손상을 유도하는 새로운 접근 방식을 설정합니다. 설명된 cryoinjury 방법은 사전 냉각된 스테인리스 스틸 기기를 사용하여 근섬유를 급속 동결 및 해동하는 것을 기반으로 합니다. 광범위한 피해에도 불구하고 물고기의 안녕은 심각하게 손상되지 않았습니다. 전체 자궁 내막이 복원 될 수 있으며,이 연구는 성인 제브라 피쉬의 근육 재생 메커니즘을 연구하기위한 새로운 모델 시스템을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 버전 23.5.3</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material/ Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35/10 mm Petri Dish</td><td>Greiner Bio-one</td><td>제품 번호: 627102</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Sony</td><td>/</td><td>HDR-PJ410</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Histcom</td><td>HRA C50</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 ~36%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47630</td><td></td></tr><tr><td>Macro 50 mm f/2.8 EX DG 렌즈</td><td>Sigma</td><td>/</td><td>단종 렌즈</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 임베딩 잘린 금형 T8</td><td>Polyscience, Inc.</td><td>18985</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>스폰지</td><td>모든</td><td></td><td>플랫 스폰지, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 크라이오 프로브</td><td>주문 제작</td><td>/</td><td>세부 사항</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Any</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica</td><td>/</td><td>Discontinoued product</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Anestethic)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Dyes and Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Sigma</td><td>10236276001</td><td>농도: 1/2000</td></tr><tr><td>Phalloidin-Atto-565 (F-actin)</td><td>Sigma</td><td>94072</td><td>농도 : 1 / 500</td></tr><tr><td>Tropomyosin (TPM1)</td> <td>DHSB</td><td>CH1</td><td>농도 : 1 / 50</td></tr><tr><td>Recipies / Solutions </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>123 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1.8 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>AFOG 용액</td><td>3 g Fuchsin</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 g 오렌지 G</td><td>시그마</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 g Anilin blue</td><td>Fulka AG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>200 ml 증류 H2O (pH 1.1)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 골격근 재생을 연구하기 위한 냉동 손상 모델

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

골격근은 위성과 같은 줄기 세포의 활성화를 통해 경미한 손상 후 재생 및 회복을 거칩니다. 근육 조직의 심한 부상은 종종 인간의 섬유증을 유발합니다. 포유류에 비해 제브라피쉬는 장기 재생에 대한 타고난 능력이 더 높기 때문에 장기에 대한 광범위한 손상 후 조직 복원을 연구하기 위한 강력한 모델을 제공합니다. 여기에서 냉동 손상 모델은 성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 4개 자궁근에 심각한 손상을 유도하는 것으로 설명됩니다. 맞춤형 크라이오프로브는 체형에 맞게 설계되었으며 피부에서 정중선까지 측면 근육을 재현성 있게 손상시킵니다. 중요한 것은 신체의 완전성이 손상되지 않았으며 물고기는 수영 활동을 계속했습니다. 골격근의 변화는 조직 절편에서 육종 단백질의 조직학적 염색 및 형광 염색에 의해 평가되었습니다. 이 방법은 골격근의 퇴행이 어떻게 회복 반응을 유도하여 성인 제브라 피쉬에서 근 형성 프로그램의 재 활성화를 유도하는지 이해하는 것을 목표로하는 새로운 연구 길을 열어 줄 것입니다.

냉동 손상 후 물고기 모니터링 동물에 대한 자궁근막 냉동 손상의 영향을 확인하기 위해 냉동 손상 후 1일(dpci) 및 5dpci에 대조군 및 냉동 손상된 물고기의 비디오 녹화를 수행했습니다. 각 그룹에는 5 마리의 물고기가 들어있었습니다. 1dpci에서 냉동 부상을 입은 물고기는 덜 활동적으로 헤엄치고 있었지만 소용돌이, 회선 또는 평형 감소와 같은 비정상적인 움직임을 나타내지 않았습니다(비디오 1). 축산 시스템에서, 탱크에서의 위치와 음식 섭취량은 부상 당하지 않은 물고기의 위치와 비슷했습니다. 5dpci의 비디오(비디오 2)에서 볼 수 있듯이 정상적인 동작은 다음 날 동안 지속되었습니다. 결론적으로, 꼬리 꽃자루의 냉동 부상 절차는 동물의 건강에 심각한 영향을 미치지 않았습니다.
꼬리 꽃자루 부분의 조직 학적 분석 손상 정도를 평가하기 위해 근섬유 파편이 상처에 완전히 재흡수된 시점인 4dpci의 시점을 선택했습니다. 신체의 등-복부 및 전후-후축을 따라 냉동 손상의 영향을 분석하기 위해 두 그룹의 물고기(즉, 각각 꼬리 꽃자루의 관상 및 횡단 부분)를 사용했습니다(그림 1F).
절편은 아닐린 블루(Aniline Blue), 애시드 푹신(Acid Fuchsin) 및 오렌지 G(Orange G, AFOG)로 구성된 삼색 염색으로 분석되었습니다. 이 시약 조합을 사용하여 손상되지 않은 근육은 주황색으로, 척수는 진한 빨간색으로, 콜라겐 매트릭스는 파란색으로 표시되었습니다. 물고기 근육 조직의 metameric 단위 인 손상된 myomeres의 수를 결정하기 위해 일련의 섹션을 분석했습니다 (그림 2). myocommata라고 불리는 Myomere 경계는 청색으로 검출 된 콜라겐 침착에 의해 확인되었습니다. 손상된 부위는 주황색 얼룩이 없어서 결정되었습니다. 명백한 근종마가 있는 표본을 면밀히 조사한 결과 주황색 염색이 없는 것으로 추론할 수 있듯이 약 4개의 연속적인 자궁근체가 손상된 것으로 나타났습니다(n, 물고기 수 = 4; 그림 3A,A'). 같은 물고기의 다치지 않은 쪽이 내부 참조 역할을 했습니다.
몸체 축에 수직 인 상처의 깊이를 조사하기 위해, 4 dpci 및 7 dpci에서 제브라 피쉬를 사용하여 횡단 절편을 준비하였다. 후자의 시점은 근 형성 프로그램의 활성화와 근육 재생의 시작에 해당합니다. 이 표본의 AFOG 염색은 신체의 동결 손상을 입은 측면에 주황색 염색이 광범위하게 부족하여 퇴행성 골격근의 영역을 구분했습니다(그림 3B, C). 4 dpci 및 7 dpci에서 상처 부위는 피부에서 수직 중격을 향해 조직에 걸쳐 있습니다. 이는 냉동상해법이 시술 후 7일 동안 기능성 근육이 없는 꼬리꽃자루의 측면 절반을 깊이 표적으로 삼았음을 보여줍니다. 종합하면, 꼬리 꽃자루의 한쪽에 4 개의 자궁 내막이 심하게 손상되었습니다.
횡단 절편의 면역형광 분석 근육 재생의 역학을 평가하기 위해 물고기의 실험 그룹을 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci 및 30 dpci에서 안락사시켰다. 꼬리 꽃자루의 횡단면은 Phalloidin(필라멘트 액틴[F-액틴]에 결합), 육종 단백질을 검출하는 Tropomyosin-1 항체 및 핵을 표지하는 DAPI를 사용하여 다색 형광 염색으로 표지되었습니다. 모든 시점에서 신체의 부상 당하지 않은 절반은 내부 통제를 제공했습니다. F-액틴과 트로포미오신 1은 모두 손상되지 않은 대조군 부위에서 강력하게 검출되어 손상되지 않은 조직을 나타냅니다(그림 4).
4 dpci에서, 꼬리 꽃자루의 손상된 쪽에는 풍부한 DAPI 양성 세포가 포함되어 있었지만, F-액틴 및 트로포미오신 1 면역형광은 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 퇴행성 근육이 있는 상처 영역을 나타냅니다(그림 4A-B'). 7 dpci에서 Tropomyosin 1과 F-actin은 수직 신체 정중선에 가까운 상처 부분에서 검출될 수 있습니다(그림 4C-D'). 이 표현 패턴은 꼬리 꽃자루에서 새로운 근섬유의 형성이 시작되는 위치를 구분합니다. 10dpci에서 두 근육 마커는 신체 표면을 향해 확장되어 골격근의 재생이 진행되고 있음을 시사합니다(그림 4E-F'). 30dpci에서 신체의 양쪽은 유사한 F-액틴 염색 분포를 나타냈습니다(그림 4G-H'). 이 발견은 꼬리 꽃자루의 냉동 손상 후 골격근이 효율적으로 회복되었음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig01.jpg"> 그림 1: 자궁근막 냉동 손상에 대한 실험 설정 . (A) 스테인리스 스틸로 만든 맞춤형 cryoprobe의 치수. 악기의 말단 부분은 제브라피쉬 몸체의 곡률을 설명하기 위해 1mm 깊이의 오목한 가장자리가 있는 주걱으로 구성됩니다. 도구의 중간 부분은 추 역할을 하는 실린더와 절차 중에 주걱의 낮은 온도를 유지하기 위한 저장소로 구성됩니다. 악기의 근위 끝은 얇은 금속 손잡이 형태입니다. (나,씨) 꼬리 꽃자루에 cryoprobe와 함께 촉촉한 스폰지에 마취 된 성인 물고기. 프로브는 실온에 있었다. (B) 탐침의 가장자리는 꼬리 꽃자루 근처에 수평으로 배치되어 물고기와 도구 사이의 상대적인 크기를 표시합니다. (C) 냉동 손상의 경우 도구 끝이 물고기에 수직으로 위치합니다. (D) 포괄적인 방식으로 조작을 보여주기 위해 물고기의 복부 쪽에서 냉동 손상 절차의 개략도. cryoprobe를 액체 질소에서 예냉하고 즉시 6초 동안 물고기의 한쪽에 놓았습니다. (E) 냉동 손상 후 특정 시점에서 물고기를 안락사시키고 꼬리 꽃자루를 수집하여 고정했습니다. (F) 고정된 물질은 조직학적으로 처리되고 관상 또는 횡단면을 따라 절편되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig02.jpg"> 그림 2: 몸의 등쪽에서 복부 위치까지 꼬리 꽃자루의 손상된 자궁 근체의 조직학적 분석. 냉동 손상 후 4일째 일련의 관상 절편의 AFOG 염색(dpci). 섹션은 첫 번째와 마지막 패널의 상단에 표시된 대로 등쪽에서 복부 쪽을 향합니다. 섹션은 인접하지 않으며 그 사이의 간격은 약 150μm입니다. 손상되지 않은 근육은 근육의 주황색 염색으로 감지되는 반면, 손상된 조직은 이 염색이 없고 회색으로 보입니다(점선으로 둘러싸인 영역). 피부와 같은 콜라겐 함유 조직은 파란색으로 염색됩니다. 척수는 막대 모양의 구조로 나타나며 빨간색으로 염색됩니다. 물고기의 수, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig03.jpg"> 그림 3: AFOG 염색을 사용한 꼬리 꽃자루의 손상 깊이 평가. (ᅡ,ᅡ') 관상 동맥 부분은 척수 (붉은 색으로 얼룩진 수평 막대)의 수준에 있습니다. 아래쪽 이미지는 위쪽 이미지에서 프레임으로 둘러싸인 확대된 영역을 보여줍니다. 순차적인 자궁 내선 경계는 척수에 비스듬히 위치한 콜라겐 줄무늬(파란색)로 나타납니다(확대된 이미지 A'의 빨간색 화살표). (나,씨) 단면은 주황색으로 얼룩진 근육이 있는 손상되지 않은 옆구리와 회색빛이 도는 얼룩이 있는 냉동 부상을 입은 옆구리를 표시합니다. 손상된 영역은 검은색 점선으로 둘러싸여 있습니다. 수직 중격(빨간색 점선으로 표시됨)은 신체를 대조군과 냉동 손상 측면으로 세분화합니다. 물고기의 수, n = 시점 당 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig04.jpg"> 그림 4: 냉동 손상 후 근육 단백질의 면역형광 검출. 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci 및 30 dpci에서 단면의 형광 염색(패널의 왼쪽과 상단에 라벨이 붙어 있음)(A-B'). 4dpci에서 손상된 조직(점선으로 둘러싸여 있음)은 DAPI 양성(파란색)이지만 팔로이딘 염색(녹색) 또는 트로포미오신-1 면역반응성(빨간색)이 없어 냉동 손상 후 근육 섬유의 퇴행을 시사합니다. (C-D') 7 dpci에서 두 근육 마커가 상처 부위에 점진적으로 나타나 재생 과정을 나타냅니다. Tropomyosin-1은 새로 형성된 섬유에서 F-액틴보다 더 강렬하게 나타납니다. (E-F') 10dpci에서 손상 영역은 F-액틴에 비해 더 높은 강도의 Tropomyosin-1 면역반응성을 나타내는 새로운 근섬유로 채워집니다. (G-H') 30dpci에서 유사한 패턴의 근섬유가 신체의 양쪽에서 감지됩니다. 패널 A, C, E 및 H의 프레임은 오른쪽에 인접한 이미지에서 확대된 영역을 포함합니다. 자궁 내막 외부에서 형광을 발산하는 피부 비늘은 Adobe Photoshop을 사용하여 이미지에서 지워졌습니다. 물고기의 수, n = 시점 당 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 성인 제브라피쉬에서 여러 꼬리 근소체의 심각한 손상을 유도하는 냉동 손상 모델을 설명합니다. 이 방법은 비포유류 척추동물에서 심각한 조직 손실 후 골격근 재생을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

제브라피쉬 모델은 효율적인 장기 재생의 자연적 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리 실험실은 이전에 제브라피쉬가 심장과 체력을 회복하는 방법을 연구하기 위한 냉동 부상 방법을 확립했습니다. 이 새로운 프로토콜을 통해 우리는 연구를 다른 기관, 즉 근육 조직으로 확장하는 것을 목표로 합니다.우리는 왜 장기 재생이 인간보다 제브라피쉬에서 더 효율적인지 아직 이해하지 못했습니다. 이 프로토콜은 물고기 몸의 비교적 큰 상처 크기에도 불구하고 근육 조직의 성공적인 복원을 연구하는 유망한 접근 방식을 제공합니다. 이 냉동 부상 모델에는 적어도 세 가지 장점이 있습니다.첫째, 근육 조직은 신체의 완전성을 손상시키지 않고 빠르게 손상됩니다. 둘째, 상처는 자연 치유에 의해 재현 가능하고 제거됩니다. 마지막으로, 물고기는 냉동 손상 후 정상적으로 수영 할 수 있으며,이 절차가 동물에게 경미한 영향을 미친다는 것을 암시합니다.우리의 발견은 제브라 피쉬 꼬리 꽃자루를 재생 생물학 분야에 도입했습니다. 이 연구 경로는 성인 제브라피쉬의 복잡한 근육조직을 재구성하기 위한 근형성 프로그램을 안내하는 분자 메커니즘을 해독하는 데 기여할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Zebrafish는 척추 동물에서 심장 중생의 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 모델을 나타냅니다. 여기서는 cryoinjury를 사용하는 성인 zebrafish에있는 심장 경색의 유도를위한 프로토콜을 제시한다. 포유류의 infarcts에서 관찰하는 것과 비슷한 심실 벽의 20 % 이내 거대한 세포 죽음이 방법은 결과를.

성인 Zebrafish에서 심근 경색의 유도는 Cryoinjury 사용

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

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여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

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성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

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Xenopus tropicalis 는 많은 기관이 놀라운 재생 능력을 가지고 있기 때문에 재생 연구에 이상적인 모델입니다. 여기에서는 정점 절제술을 통해 X. tropicalis 에서 심장 손상 모델을 구성하는 방법을 제시합니다.

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배우세요 성인 제브라피쉬 꼬리 꽃자루에서 냉동 손상을 이용한 골격근 재생 연구 방법을. 이 기법은 조직 복원 메커니즘과 재생 의학 연구에 활용됩니다.

성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 골격근 재생을 연구하기 위한 냉동 손상 모델

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