Name: In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 내피세포를 분화시키고 유체칩에서 기계적 자극을 적용하는 방법을. 이 프로토콜은 발달 기계생물학 연구에 활용할 수 있는 효과적인 시험관내 모델을 제공합니다.

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이 연구는 유럽 혈액학 협회(European Hematology Association)의 2021년 연구 고급 보조금(Research Advanced Grant 2021), 미국 혈액학회(American Society of Hematology)의 2021년 글로벌 연구상(Global Research Award 2021), 웰컴 트러스트(Welcome Trust)와 에든버러 대학교(University of Edinburgh)가 자금을 지원하는 내부 전략 지원 기금 ISSF3의 지원을 받았습니다. 유세포 분석 분석을 지원해 주신 유세포 분석 시설의 Fiona Rossi에게 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해, 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.

hiPSC 유래 내피 세포의 분화 및 기계적 자극

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<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
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<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
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<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에서 설명하는 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 기계에 민감한 내피 세포를 생성하고 제어된 전단 응력에 의해 매개되는 기계적 자극에 대한 반응을 연구할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 완전히 사이토카인 기반이며 세포 치료용 세포 생산으로 전환될 수 있는 GMP 시약과 완벽하게 호환됩니다.
hiPSC의 유도는 과학자들에게 배아 발달의 초기 단계를 위한 도구 모델을 제공하여 생체 내에서 연구하기 어려운 과정을 연구할 수 있도록 합니다 24. 사실, 연구에 사용할 수 있는 인간 배아 조직은 순환이 부족한 배아에서 수집되며, 이는 기계적 신호에 의해 제어되는 분자 서명에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 설명된 접근 방식을 통해 전단 응력에 대한 세포 반응의 실시간 이미징 및 실시간 연구가 가능합니다. hiPSC와 유체 공학의 조합은 순환 개시가 심혈관 및 혈액 시스템의 확립을 리모델링하고 제어할 때 발달 중인 태아 조직의 제한된 가용성과 접근 불가능성을 극복하는 연구 모델을 제공합니다 3,9,10,25.
프로토콜의 한계는 이 프로토콜로부터 유도된 내피 세포가 발달 조직에 존재하는 상이한 내피 세포의 다양한 정체성을 반영하지 않을 수 있다는 것이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 원하는 동일성 또는 조직-특이적 표현형을 얻기 위해 유체 자극에 선행하는 분화 과정 동안 사이토카인의 특정 조합이 필요할 수있다 26. 내피 서브세트의 분리는 분리 단계 동안 보다 정제된 면역표현형을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 CD34의 발현만을 기반으로 내피 세포를 분리하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 대신 컬럼 분리를 허용합니다. 이를 통해 세포 사멸과 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 층류에 의해 매개되는 전단 응력의 역할을 연구하기 위해 특별히 설계되었습니다. 스트레칭 또는 압축과 같은 다른 기계적 단서 또는 교란 또는 교란된 흐름과 같은 다른 유형의 흐름의 영향을 연구하기 위해 대체 유체 접근 방식을 사용해야 합니다.
우리는 이전에 iPSC-유래 내피 세포가 태아 등쪽 대동맥(28,29,30)에서 관찰된 것과 유사한 이질적인 동정맥 세포 정체성(27)을 모방한다는 것을 보여주었다. 이는 혈관 발달 및 세포 사양의 맥락에서 특히 중요하며, 혈액 순환에 의해 조절되는 것으로 알려져 있습니다. 다른 모델에 대한 연구는 순환 부족으로 인해 동정맥 사양이 변경된다는 것을 보여주었습니다11,14,31. 기계적 단서와 세포 사양을 연결하는 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며 여기에 설명된 파이프라인을 통해 생체 내에서 테스트할 수 없는 정교한 기능 연구를 수행할 수 있습니다.
이 파이프라인은 상업적으로 이용 가능한 유체 채널을 사용하여 hiPSC로부터 유래된 내피 세포의 생산 및 자극을 설명하며, 널리 사용되는 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치(12)와 같이 장치를 주조할 필요가 없습니다. 또한 PDMS 칩을 사용하면 자극된 세포를 수집하기가 특히 까다로워지는 반면, 이 프로토콜을 사용하면 채널에서 세포를 쉽게 검색할 수 있습니다. 이를 통해 분석 성능이 크게 향상되어 단백질체 및 전사체 분석, 유세포 분석 및 기능 분석과 같은 후속 분석이 가능하며, 추가 배양 또는 생체 내 분석이 필요할 수 있습니다.

배아 발달 과정에서 심장은 기능을 확립하는 첫 번째 기관이며1, 심내막 형성 초기 단계부터 수축이 감지된다2. 혈액 순환은 혈관 내 혈액 흐름에 의해 매개되는 기계적 신호와 함께 초기 발달의 많은 중요한 측면을 제어합니다. 태아 순환 확립 전에 혈관 조직은 1 차 모세 혈관 신경총으로 구성됩니다. 심장 기능에 따라 이 신경총은 정맥 혈관과 동맥 혈관으로 재편성된다3. 동정맥 사양에서 기계적 단서의 역할은 혈류가 시작되기 전에 동맥 및 정맥 표지자의 범내피 발현에 의해 반영된다4.
혈류역학적 힘은 혈관 자체의 발달을 제어할 뿐만 아니라 혈액 세포 형성을 제어하는 데 근본적인 역할을 합니다. 조혈모세포 와 전구세포(HSPC)는 혈원성 내피 5,6,7,8이라고 하는 특수 내피 세포에서 나오며, 발달 초기 단계에서만 배아의 다른 해부학적 영역에 존재합니다. 심장 결핍 모델은 체외 모델과 함께 기계적 단서가 혈구 내피 9,10,11,12,13,14에서 HSPC 생성을 지시하고 증가시킨다는 것을 입증했습니다.
상이한 유형의 유동 역학은 세포 주기(15)를 차등적으로 제어하는 것으로 나타났으며, 이는 혈원성 내피(16,17) 및 동맥 세포 사양(18) 모두에서 중요한 것으로 알려져 있다. 전체적으로, 기계적 신호는 발달 중 세포 정체성과 기능을 결정하는 중요한 요소입니다. 새로운 체외 유체 장치를 통해 생체 내 인간 혈액 발달 중 발달 역학 연구와 관련된 한계를 극복할 수 있습니다.
이 원고에 있는 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)에서 체외 에서 유래한 인간 내피 세포에 대한 전단 응력의 영향을 연구하기 위한 실험 파이프라인을 단계별로 설명하는 것입니다. 이 프로토콜에는 hiPSC를 내피 세포로 분화하고 자극 프로토콜을 위해 유체 칩으로 후속 파종하는 방법에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 이를 사용하여 다양한 체외 유래 내피 세포가 흐름에 반응하여 방향을 분석하여 전단 응력을 감지하는 능력을 테스트할 수 있습니다. 이를 통해 다른 실험실에서는 전단 응력에 대한 반응과 다양한 내피 세포 식별에 대한 기능적 결과에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.6 Luer 코팅되지 않은 슬라이드</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>해리 시약으로 인용</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>흡인 피펫</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>신경 세포 배양 보충제로 인용 (50x)</td></tr> <tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>버전 8.0.1</td><td>유세포 분석 소프트웨어로 인용</td></tr> BD <tr><td>LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 마이크로비드 키트</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE 클론 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 클론 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 세포 방충 표면 6-웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Cayman Chemicals CHIR99021 세포 방충 플레이트로 인용됨</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; 세포 동결 보존</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>냉동 보존 용액으로 인용</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td>로 인용 <td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>EASY 스트레이너 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Version 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Version 10.7.1</td><td>Cited as flow cytometry sanalysis oftware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>유체 단위</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>L-글루타민 보충제</td></tr><tr><td>Ham F-12로 인용됨&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi 펌프 시스템</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>펌프 시스템으로 인용</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>도립 인큐베이터 현미경으로 인용</td></tr><tr><td>동결 건조 BSA&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>자기 분리기</td></tr><tr><td>MS 컬럼</td>으로 인용 <td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>마그네틱 컬럼</td></tr><tr><td>MTG</td>로 인용 <td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충</td> 펌프 <td></td> 시스템 ibidi <td>용 Life Technologies</td> 17502048 <td></td></tr><tr><td>노트북</td><td></td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>관류 세트 YELLOW/GREEN: 50cm, ID 1.6mm, 10mL reservoirs</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>관류 세트로 인용</td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td></td><td>352008 유세포 분석 튜브로 인용</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>펌프 제어 소프트웨어</td><td>ibidi</td><td>버전 1.6.1</td><td>펌프 소프트웨어로 인용</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기 세포 구조학</td><td>5872</td><td>분리 솔루션으로 인용</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>은 Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td> R&로 인용되었습니다<td>. D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT 용해 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>시리얼 커넥터 &마이크로;-슬라이드: 멸균, 멸균</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM 미디어</td><td>생명 기술</td><td>10639011</td><td>CD34+ 세포용 무혈청 미디어로 인용됨 (SFM-34)</td></tr> <tr><td>StemPro-CD34 영양 보충제&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>34가지 영양 보충제로 인용</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>문화 매체로 인용&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN-N) 재조합 인간 단백질, 잘린</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr>로 인용</tbody></table>

in vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

심장은 발달 과정에서 기능적으로 확립되는 첫 번째 기관으로, 임신 초기에 혈액 순환을 시작합니다. 태아의 성장을 보장하기 위해 산소와 영양분을 운반하는 것 외에도 태아 순환은 기계적 신호를 통해 내피층 내에서 발생하는 많은 중요한 발달 사건을 제어합니다. 생체역학적 신호는 혈관 구조 변화를 유도하고, 동정맥 사양을 확립하며, 조혈모세포의 발달을 조절합니다. 발달 중인 조직에 접근할 수 없다는 것은 초기 인간 발달에서 순환의 역할에 대한 이해를 제한합니다. 따라서 in vitro 모델은 혈관 기계생물학 연구를 위한 중추적인 도구입니다. 이 논문은 내피 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포와 구별하고 기계적 신호에 대한 반응을 연구하기 위해 유체 장치에 파종하는 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 기계적 자극 하에서 내피 세포를 장기간 배양한 후 표현형 및 기능적 특성 분석을 위해 내피 세포를 회수할 수 있습니다. 여기에서 확립된 시험관 내 모델은 궁극적으로 인간 태아의 생애 동안 혈관 발달을 조율하는 기계적 신호에 의해 매개되는 신호를 전달하는 세포 내 분자 메커니즘을 설명하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

여기서는 기계적 신호에 대한 반응을 연구할 수 있는 hiPSC에서 유래한 내피 세포의 분화 및 기계적 자극을 위한 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 기능적으로 기계에 민감한 내피 세포를 생산합니다. 여기에 대표적인 결과를 제공하고 분화 중에 세포가 사이토카인 자극에 어떻게 반응하는지 평가하기 위해 예상되는 표현형을 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> 그림 1: 차별화 및 기계적 자극 프로토콜의 개략도. 사이토카인의 다양한 혼합물, CD34+ 세포 분리, 유체 칩 파종 및 기계적으로 자극된 세포의 최종 분석의 타이밍을 보여주는 분화 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
hiPSC의 배양 자가 갱신 조건에서 올바르게 성장하는 hiPSC에서 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 문화의 질을 나타내는 좋은 지표는 성장 속도입니다. 해동 후 세포는 좋은 분화를 보장하는 올바른 성장 단계에 도달하는 데 2-3주가 필요할 수 있습니다. 세포가 일주일에 두 번 1:6의 비율로 거의 완전한 밀도에 도달하여 통과할 수 있을 때, 이것은 세포가 통과해야 하는 당일에 분화할 준비가 된 시간입니다.
hiPSC를 내피세포로 분화 배아체(EB)의 형성으로 구성된 분화의 첫 번째 단계는 세포주에 따라 다르며 사용 중인 특정 세포주에 대해 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 단계 1.3.2.2-1.3.2.4에 설명된 해리는 해리 시약을 사용한 배양을 줄이거나 연장하고 파스퇴르 피펫을 사용한 후속 해리를 통해 수정할 수 있습니다. 또한, 절삭 공구 또는 P100 피펫 팁을 사용한 콜로니의 물리적 해리 외에도 다른 해리 시약을 이 단계에 사용할 수 있습니다. 좋은 품질의 EB는 분화 2일차에 정의된 가장자리를 나타내며 현미경을 사용하여 관찰할 때 선명하고 밝게 나타납니다. 어두운 영역은 EB 내의 세포 사멸을 나타낼 수 있습니다(그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> 그림 2: 배아체 형태. (A) 잘 정의된 바깥쪽 가장자리와 일관된 크기를 보여주는 2일차 배아체. (B) 구조의 분해를 초래하는 광범위한 세포 사멸을 보여주는 품질이 좋지 않은 2일차 배아체. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2일째에 EB에 CHIR99021을 추가하면 GSK-3 단백질이 억제되어 Wnt 경로가 활성화됩니다. 세포주마다 CHIR 처리에 대한 반응이 다르기 때문에 다른 농도를 사용하여 8일째에 얻은 CD34+ 세포의 수를 정량화하여 테스트해야 합니다(그림 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> 그림 3: 다양한 CHIR 처리를 사용한 내피 세포 분화. CD34 막 발현에 의한 분화 8일차에 유세포 분석으로 정량화한 내피 세포 투입, (A) 3μM, (B) 5μM 및 (C) 7μM에서 2일차에 CHIR 처리 후. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
CD34+ 세포 분리 마그네틱 비드를 사용한 CD34+ 농축이 컬럼 용출 후 최소 80%의 CD34+를 제공하는지 검증하는 것이 중요합니다. 충분한 순도를 보장하기 위해 자기 분리에서 얻은 세포의 부분 표본을 유세포 분석으로 분석하여 자기 농축에 사용된 것과 다른 항체 클론을 사용할 수 있습니다. 여기서, 4H11 클론을 사용하였고 농축 후 ~85%의 순도를 달성하였다(도 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> 그림 4: 자기 분류에 의한 농축 전후의 CD34 막 발현. 8일째 해리된 배아체(회색)와 자기 농축 후 세포(녹색)를 CD34 발현을 위해 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 성공적인 농축 후 분류를 보여주었습니다. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
유체 채널에 세포 파종 유체 채널에서 세포를 파종할 때 내피 세포의 접착 및 증식을 추적하는 것이 중요합니다. 파종 후 세포가 채널에 완전히 부착되는 데 ~5시간이 걸립니다(그림 5A). 이 단계에서 접착력을 향상시키기 위해 대체 코팅 용액을 테스트할 수도 있습니다. 테스트된 세포가 기계에 민감하여 기계적 자극에 반응할 수 있는지 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 세포 방향을 테스트할 수 있습니다. 자극 전의 세포는 무작위 배향을 나타내고(그림 5A 및 그림 5C) 흐름 방향과 평행하게 방향을 바꿉니다(그림 5B, C). 여기에 설명된 프로토콜은 채널에서 세포를 수집하여 막 면역표현형을 연구하기 위한 다운스트림 분석(예: 유세포 분석)을 수행할 수 있도록 하여 자극된 세포의 내피 식별을 제공합니다(그림 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> 그림 5: hiPSC 유래 내피 세포의 기계적 반응성 . (A) 파종 후 48시간 동안 분리된 CD34+ 세포의 합류층. (B) 동적 배양 하에서 3일 동안 내피 세포의 방향 전환된 층. (C) 동적 배양 5일 후 내피 세포의 방향 분석. (D) 5일 동안 유동 상태에서 배양된 세포의 CD34 발현 프로파일. (E) 유체 채널에서 회수된 세포 집단의 CD34+ 세포의 백분율. 이미지는 도립된 인큐베이터 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). 스케일 바 = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>재고 집중</td>
			<td>볼륨 추가됨</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>Iscove의 수정된 Dulbecco's Medium(IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>함의 F-12 영양 혼합물 (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2 서플리먼트(×100)</td>
			<td>100 배</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td>B-27 서플리먼트(×50)</td>
			<td>50 배</td>
			<td>10mL</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td>아스코르브산</td>
			<td>10mg/mL</td>
			<td>1.25 mL</td>
			<td>25μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-모노티오글리세롤(MTG)</td>
			<td>11.5 미터</td>
			<td>19.5 μL</td>
			<td>448.5 마이크로미터</td>
		</tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td>
			<td>100mg/mL</td>
			<td>2.5 mL</td>
			<td>0.5mg/mL</td>
		</tr><tr><td>홀로-트랜스페린</td>
			<td>100mg/mL</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>150μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 500mL의 무혈청 분화(SFD) 배지의 조성 및 제조법.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>차별화의 시대</td>
			<td>사이토카인 믹스</td>
			<td>사이토카인(Cytokine)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>0 - 2일차</td>
			<td>믹스 1</td>
			<td>BMP4 시리즈</td>
			<td>20ng/mL</td>
		</tr><tr><td>2일차</td>
			<td>믹스 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM의</td>
		</tr><tr><td>3일차부터</td>
			<td rowspan="2">믹스 3과 4</td>
			<td>베지에프</td>
			<td>15ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF (비FGF)</td>
			<td>5ng/mL</td>
		</tr><tr><td>6일째부터</td>
			<td rowspan="8">믹스 4</td>
			<td>IL6 시리즈</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L 시리즈</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1 (IGF1)</td>
			<td>25ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11 시리즈</td>
			<td>5ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>50ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>유럽 특허청(EPO)</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO (TPO)</td>
			<td>30ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>일리노이3</td>
			<td>30ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 내피 세포 분화에 사용되는 사이토카인의 혼합물, SFD 배지에 첨가된 일수 및 최종 농도.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>전단 응력(dyn/cm2)</td>
			<td>시간(h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>실험이 끝날 때까지</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 동적 배양 및 적용 길이에 대한 전단 응력 값.
보충 그림 S1: 이 프로토콜에 사용되는 칩 및 튜브의 형상 및 치수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 각 단계에 대한 설명과 함께 공기 펌프를 제어하는 소프트웨어에 대한 단계별 가이드입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: FIJI를 사용한 방향 분석 가이드는 셀 모양, 타원 피팅 및 최종 측정의 도면을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S1: 분화 프로토콜에 사용되는 사이토카인에 대한 단위 크기, 재현탁 부피 및 스톡 농도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

우리의 연구는 발달 과정에서 기계적 단서가 내피 세포의 운명을 어떻게 지시하는지 탐구하며, 이를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 분화와 유체 매개 기계적 자극을 결합합니다. 내피 세포는 혈액의 움직임에 지속적으로 노출되기 때문에 정적 배양에서는 중요한 신호를 놓치기 때문에 전통적인 배양 시스템을 사용하여 내피 세포 생물학을 연구하는 데 있어 주요 과제가 됩니다. 실제로 기계적 신호는 정적 조건에서 배양된 세포에서 간과될 수 있는 많은 중요한 신호 전달 경로를 활성화합니다.당사의 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포를 분화하고 기계적으로 자극하는 방법에 대한 쉬운 단계별 가이드를 제공합니다. 이는 많은 실험실에서 열 배양을 채택하여 유동 중 내피 세포 거동에 대한 질문을 쉽게 해결하는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.

대동맥 벽의 생체 역학적 변형을 요약하기 위한 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델 구축

여기에서는 전폐절제술을 모방하도록 설계된 OOC(Organ-on-Chip) 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 글리코칼릭스 손상과 전폐절제술 후 합병증 사이의 잠재적 상관관계를 조사합니다.

3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

이 기사는 제브라피시 배아에서 기계적 혈관 손상을 일으키는 방법을 설명합니다. 이 부상 모델은 실시간 현미경 검사에 이상적으로 적합한 유기체에서 지혈, 부상 관련 염증 및 상처 치유를 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 내피세포를 분화시키고 유체칩에서 기계적 자극을 적용하는 방법을. 이 프로토콜은 발달 기계생물학 연구에 활용할 수 있는 효과적인 시험관내 모델을 제공합니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

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