Name: 눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 학습하세요 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터를 검출하는 ddPCR 분석법을. 이 검증된 프로토콜은 임상 시험에서 바이러스 바이오셰딩을 정량화하여 유전자 치료 연구의 신뢰성을 높입니다.

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이 방법을 개발하는 동안 유용한 토론을 해주신 Bio-Rad의 Nick Russell과 Brandon McKethan에게 감사드립니다.

바이오셰딩 연구를 위해 ddPCR을 사용한 눈물 내 바이러스 벡터의 정량화

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모든 저자는 이 프로토콜에 설명된 대로 AAV 기반 분석 지원을 포함하여 조기 발견 지원부터 제품 등록에 이르기까지 포괄적인 Good Laboratory Practices/Good Clinical Practices 준수 개발 서비스를 제공하는 계약 연구 기관인 KCAS Bioanalytical and Biomarker Services의 직원입니다. KCAS는 이 프로젝트와 이 프로토콜의 출판에 자금을 지원했습니다. 이 백서에 제시된 실험의 설계 및 검증에 대한 현재 FDA 지침은 없지만 KCAS에서 이러한 연구를 개발하는 전문가 및 사고 리더는 이 접근 방식을 기본 접근 방식으로 채택했습니다. 추가 기준 및 매개변수는 프로젝트별로 논의되며 의도된 용도에 따라 포함될 수 있습니다.

분석의 적절한 수행에 중요한 ddPCR 프로토콜의 여러 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 프라이머와 프로브의 설계 및 최적화입니다. 일반적으로 전임상 또는 임상 환경에서 염료 기반 화학(예: SYBR Green)보다 가수분해 프로브 기반 화학을 사용하는 것이 우수하기 때문에 권장됩니다. 또한 증폭 대상의 선택은 매우 중요합니다. 전형적으로, 벡터의 관심있는 도입 유전자가 표적화된다. 그러나, 초기 전임상 단계 또는 벡터 이식유전자 대 게놈 DNA를 구별하는 것이 불가능할 수 있는 벡터에서는 표준화된 벡터 표적을 사용하는 것이 적절할 수 있습니다. 예를 들어, 반전된 말단 반복 영역, 프로모터, poly-A 꼬리 또는 이러한 벡터 구성 요소 사이의 세그먼트 간 접합부를 대상으로 할 수 있습니다. 타겟 선택은 벡터 설계에 따라 달라집니다. 기존의 qPCR 프라이머 및 프로브 설계 전략과 소프트웨어는 일반적으로 ddPCR에 적합합니다. 일관된 어닐링 온도(예: 60°C)를 생성할 것으로 예상되는 설계 매개변수를 선택하여 필요한 최적화의 양을 줄여야 합니다. 또한 각 대상에 대해 최소 3개의 서로 다른 세트를 설계, 주문 및 평가하는 것이 좋습니다. 그런 다음 가장 큰 특이성(음성 대조군 웰 또는 관련 표적 DNA 매트릭스에서 증폭 없음)과 민감도(즉, 검출 한계)를 나타내는 세트를 선택해야 합니다20.
qPCR과 ddPCR 사이에서 분석을 전환할 수 있는 것이 유리한 경우 먼저 qPCR을 사용하여 분석 조건을 최적화하고R2 ≥ 0.98로 증폭 효율이 90%-110%인 선택된 세트에 대한 조건을 식별하는 것이 좋습니다. 그러나 종말점 방법으로서의 ddPCR은 증폭 효율의 차이로 인해 일반적으로 qPCR보다 덜 민감합니다. 최소한 어닐링/확장 단계에서 열 온도 구배를 실행하여 예상 어닐링 온도보다 높거나 낮은 온도를 커버하고 온도의 함수로 음과 양의 액적 클러스터 사이의 비 및 형광 진폭 분리를 평가하는 것이 좋습니다. 작업 공간이 허용하는 경우 마스터 믹스 준비, 템플릿 추가 및 증폭을 위한 개별 전용 워크스테이션을 사용하는 것이 좋습니다. 가능한 경우, 교차 오염 및 오탐의 위험을 줄이기 위해 제어된 접근 및 차동 공기압과 같은 내장된 엔지니어링 제어 기능이 있는 단방향 워크플로에 의해 물리적으로 분리되어야 합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 교차 오염을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.
이 프로토콜에는 qPCR 분석 개발에 더 익숙한 사람들에게 이상하게 보일 수 있는 두 단계가 있습니다. 첫 번째는 PCR 마스터 믹스에 제한 효소를 포함시키는 것입니다. ddPCR 증폭 동안 각 액적은 종말점까지 열순환됩니다. 적절하게 최적화된 분석에서 두 개의 입자 집단이 생성되는데, 한 세트는 일관되게 높은 수준의 형광 신호(양성)를 표시하고 다른 세트는 낮은 수준의 형광 신호(음성)를 일관되게 표시합니다. PCR 간섭이 발생하면 PCR 증폭의 시작을 비동기화하여 액적이 증폭 고원에 도달하지 못하여 형광 종말점이 일관되지 않을 수 있습니다. 이 경우 물방울이 음성과 양성 사이에 분포되어 ddPCR 비라는 현상이 발생합니다. 이로 인해 목표의 부정확한 정량화가 발생하고 임계값이 일관되지 않고 주관적으로 적용될 수 있습니다. 임계값을 NTC의 신호보다 약간 높게 설정하는 것이 좋으며, 이는 모든 물방울이 종점으로 완전히 순환되지 않더라도 여전히 양수로 간주되므로 최종 정량화에서 비의 영향을 최소화해야 합니다. AAV는 증폭 대상에 따라 프라이머와 프로브에 대한 접근성을 감소시켜 PCR 간섭을 일으켜 비가 내릴 수 있는 매우 복잡한 2차 구조를 가지고 있습니다. 마스터 믹스에 제한 효소를 포함시키면 이 2차 구조가 절단되어 프라이머와 프로브의 접근이 증가하여 비가 줄어들어 분석의 정확도가 향상될 수 있습니다. ddPCR 반응에 제한 효소를 포함시키는 효과는 이전에25,32에 기재되어 있다. 임의의 제한 효소는 표적 증폭 영역 내에서 절단되지 않는 것으로 확인되는 한 사용될 수 있다. 소화 전 단계나 대체 완충액 조성이 필요하지 않습니다.
두 번째 특이한 단계는 AAV를 함유한 눈물 샘플을 준비하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 1:10(또는 그 이상)의 눈물 비율을 활용한 후 샘플을 가열했습니다. 전형적으로, 눈물이 모세관을 통해 수집될 때, 이는 널리 이용되는 수집 방법이며, 평균적으로 약 10.0 μL가 수집될 수 있다33. 희석은 제한된 샘플 부피를 해결하고 중복 웰 테스트를 위한 충분한 재료를 제공하는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 이론적인 검출 한계가 줄어들지만 ddPCR의 강력한 감도는 여전히 극소수의 벡터 입자를 제외한 모든 입자를 검출해야 합니다. 이 접근 방식은 예기치 않게 실패할 경우 "백업" 우물을 추가로 만듭니다. 이 경우 또는 두 개의 웰을 실행하기에 불충분한 샘플 부피의 경우 푸아송 오차를 사용하여 정밀도를 평가할 수 있습니다. 또한 농도가 검출 한계 미만인 경우 웰 데이터를 병합하여 농도를 결정할 수 있는 기회를 제공합니다. ddPCR 검출을 위해 바이러스 캡시드로부터 AAV 벡터를 유리시킬 필요가 있다. AAV의 정량화를 위한 몇몇 방법들은 바이러스 캡시드34,35,36을 제거하기 위한 프로테이나제 K 소화 단계를 포함하였다. 자연적으로 발생하는 모든 AAV 혈청형은 녹는 온도가 약 90°C 이하이며 대부분이 80°C 이하로 떨어집니다. 따라서 이것은 불필요한 포함으로 보입니다37. 가열만으로도 벡터 DNA를 방출하기에 충분한 것으로 보입니다.
또한, ddPCR은 일반적으로 qPCR 분석에 영향을 미칠 수 있는 샘플에 존재할 수 있는 PCR 억제제에 덜 민감합니다. 특정 DNA 분리 단계가 포함된 경우 특정 검증도 필요하며 이 프로토콜에서는 이를 피합니다. 샘플은 액체에서 벡터 게놈의 확산 동역학으로 인해 가열되기 전에 희석됩니다. 가열 및 후속 냉각 과정 동안, 단일 가닥 DNA 게놈의 양성 및 음성 센스 가닥은 농도가 충분히 높은 경우 함께 어닐링되어 이중 가닥 중간체를 생성할 수 있습니다. 가열 전 희석은 농도를 감소시키고 정량화의 정확도에 악영향을 미칠 만큼 충분한 이중 가닥 중간체가 형성될 가능성을 수학적으로 낮춥니다. 품질 관리로 사용되는 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드는 이러한 가열 단계를 거치지 않아야 한다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 이중 가닥이기 때문에 가열하면 단일 가닥 중간체로 전환됩니다. 이러한 단일 가닥 QC를 액적으로 독립적으로 분할한 후 공칭 농도에 비해 QC 농도가 2배 증가할 것으로 예상됩니다. 또는 방법을 표준화하기 위해 QC를 가열해야 하는 경우 이를 공칭 농도의 재구성 및 할당에 고려해야 합니다.
마지막으로, 샘플 준비와 관련하여 많은 프로토콜에서는 캡슐화되지 않은 벡터 DNA를 제거하기 위해 DNase 처리 단계를 포함할 것을 권장합니다. 이 단계는 벡터 제제와 관련된 유리 DNA를 정량화하는 것이 바람직하지 않은 경우(예: 투여 목적을 위한 정량화 중)에 중요합니다. 그러나 생체 분포 및 생물 흘리기 연구의 맥락에서 일반적으로 벡터 DNA가 캡슐화되었는지 여부에 관계없이 어디로 이동했는지 알고 싶어합니다. 따라서 일반적으로 이러한 연구 중에 DNase 처리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다. DNase 단계를 포함할 필요가 있다고 판단되는 경우, 이 단계는 희석 및 가열 전에 이루어져야 한다.
이 논문에서는 목적에 맞는 우수한 실험실 관행 준수 검증의 맥락에서 방법의 동적 범위, 감도, 정확도 및 정밀도를 평가하는 접근 방식을 나타내는 데이터를 제시합니다. 현재 이 주제에 대한 지침이 없기 때문에 검증 실험실은 현재 업계의 생각에 따라 자체적으로 표적 분석 기준을 결정해야 합니다. 다른 그룹은 이 연구에서 사용된 것보다 더 높은 목표 기준과 더 낮은 목표 기준을 모두 제시했습니다(19,20,21,22,23,24,25). 표적 분석 기준은 보다 엄격하게 정의될 때까지 방법의 의도된 임상 적용에 따라 검증 전에 선택해야 합니다. 데이터를 기반으로 내려지는 다운스트림 결정에 따라 더 높은 수준의 정확도와 정밀도가 필요할 수 있습니다. 반대로, 단순한 긍정 대 부정 결과만으로도 충분할 수 있습니다.
이 접근법은 또한 특이성 및 매트릭스 효과 평가에 대한 권장 사항을 다루었습니다. 치료받지 않은 개인으로부터 수집된 눈물 풀은 이 분석에서 긍정적인 결과를 생성하지 못한 반면, 벡터가 권장 회수율 내에서 높고 낮은 농도로 눈물에 스파이크되었을 때 표적을 검출할 수 있었습니다. 이상적으로는, 내인성 벡터를 함유하는 매트릭스(예를 들어, 바이러스 벡터로 처리한 후 수집됨)도 이러한 평가에 포함될 것이다. 그러나 이러한 샘플을 유효성 검사에 사용할 수 있을 가능성은 거의 없습니다. 검증의 견고성을 높이기 위해 여러 눈물 풀 또는 다양한 개인으로부터 수집한 눈물을 평가하여 환자별 매트릭스 효과가 발생하는지 확인할 수 있습니다. 마지막으로 안정성을 평가하는 것이 좋습니다. 생물학적 매트릭스에서 DNA 추출이 이루어지는 워크플로우에서는 샘플과 추출된 DNA의 안정성을 평가해야 할 수 있습니다. 이 워크플로우에서 샘플은 DNA 추출 없이 분석에서 직접 테스트됩니다. 따라서, 이 방법에 대한 안정성의 평가를 고려하여, 인열 샘플의 안정성을 평가해야 한다. 일반적으로 탁상용, 냉장고, 냉동/해동 및 장기 안정성 평가가 권장됩니다. 이는 이 연구의 일부로 수행되지 않았지만 여기에서 개발된 방법은 입력 샘플을 조작한 후 이 평가에 사용할 수 있습니다.
전반적으로, 이 방법은 눈물 샘플에서 AAV 기반 벡터를 검출하기 위한 강력하고 반복 가능하며 검증 가능한 분석임이 입증되었습니다. 임상 시험을 지원하기 위해 특정 벡터에 적용할 수 있는 플랫폼 역할을 할 수 있으며 우수한 실험실 관행과 일치하는 분석의 검증을 위한 기초를 제공합니다.

유전자 치료의 정의는 다양하지만, 일반적으로 유전자의 발현을 변형 또는 조작하거나 임상적 목적을 위해 살아있는 세포의 생물학적 특성을 변경하기 위해 세포 게놈의 특정 DNA 서열의 의도적이고 종종 예상되는 영구적인 교체를 유도한다 1,2. 바이러스 벡터는 형질도입의 효율성으로 인해 유전자 치료의 매개체로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 한 보고서에 따르면 현재 유전자 치료 임상 시험의 70% 이상이 바이러스 벡터를 활용한다고 합니다3. 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있습니다. 미국유전자세포치료학회(American Society of Gene and Cell Therapy)의 2022년 4분기 유전자, 세포 및 RNA 치료 환경에 대한 분기별 데이터 보고서에 따르면 2022년 전임상부터 사전 등록까지 유전자, 세포 및 RNA 치료 파이프라인이 7% 증가하여 개발 중인 총 치료법 수가 3,726개로 늘어났으며, 그 중 2,053개(55%)가 유전자 치료제였습니다4. 미국 식품의약국(FDA)은 현재 인간을 대상으로 한 임상용으로 27개의 세포 및 유전자 치료제를 승인했으며, 그 중 5개는 특히 바이러스 벡터를 활용한다5.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 유전자 치료의 매개체로 특별한 관심을 받고 있습니다. 최근의 메타 분석에 따르면 지난 20 년 동안 AAV의 사용을 조사하는 약 136 건의 임상 시험이 있었다6. 또한 미국 FDA 승인 유전자 치료제 5개 중 3개는 AAV 기반입니다. 이는 편집 가능성이 높은 특성, 특정 자연 발생 또는 인공 조작 벡터의 사용에 따라 조정할 수 있는 광범위한 숙주 범위, 인간에서 낮은 병원성 및 독성, 일반적으로 낮은 면역원성 7,8 때문입니다. AAV는 또한 승인된 임상 환경에서 안구 질환을 치료하는 데 성공적으로 사용되었습니다. Voretigene neparvovec-rzyl은 2017년 미국 FDA와 2018년 EMA(European Medicines Agency)에서 이중대립유전자 RPE65 돌연변이 관련 망막 이영양증을 치료하기 위해 승인한 AAV2 기반 요법입니다9.
AAV 기반 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 분석에 대한 규제 지침이 필요합니다. 모든 바이러스 벡터의 정확한 검출 및 정량화는 제품 개발의 발견, 제조 및 전임상/임상 테스트 단계에서 필수적인 부분입니다. 미국 FDA는 인간 유전자 치료 연구용 신약 신청을 위한 화학, 제조 및 제어10, 유전자 치료 투여 후 장기 추적 관찰11, 복제 적격 레트로바이러스 검사12, 유전자 치료에 사용되는 미생물 벡터에 대한 권장 사항13을 포함하여 유전자 치료에 대한 몇 가지 지침을 발표하기 시작했습니다. EMA는 또한 일반적으로 FDA 권장 사항에 부합하는 유전자 치료 제품 개발에 관한 일련의 지침을 발표했지만 몇 가지 차이점이 있습니다14. 이러한 지침은 특정 규정이 참조되는 경우를 제외하고 법적으로 집행 가능한 책임을 설정하지는 않지만 해당 주제에 대한 규제 기관의 현재 생각과 의약품 제출 및 규제 승인에 필요한 분석에 대한 기대치를 명확하게 제공한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
FDA는 특히 안구 및 비안구 조직, 안구내 및 혈액을 대상으로 투여 부위에서 벡터의 분포, 지속성 및 제거율을 평가하기 위한 연구를 수행할 것을 권장한다15. 이들은 생체 분포 및 흘리기 연구의 형태를 취합니다. 생체 분포 연구는 제품이 투여 부위에서 환자의 몸 전체에 어떻게 퍼지는지 조사하여 노출을 평가합니다. 쉐딩(Shedding)은 환자로부터 환경으로의 생성물의 방출을 구체적으로 평가하고, 치료받지 않은 개인에게 벡터가 전염될 가능성을 높인다(16). FDA는 샘플 수집 빈도, 샘플 수집 기간, 수집 된 샘플 유형 및 보관 조건과 관련하여 생체 분포 및 흘리기 연구 설계에 대한 권장 사항을 제시합니다.
또한 FDA는 성능 용이성, 고처리량 형식, 빠른 처리 시간 및 분석 민감성으로 인해 벡터 게놈의 정량적 검출을 위해 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR 또는 real-time PCR)을 사용할 것을 권장합니다. 그러나 소분자 및 대분자에 대해 존재하는 방법과 비교하여 분자 방법의 설계 및 성능 평가에 대한 권장 사항이 상대적으로 부족합니다. 이러한 연구에 대한 많은 지침은 제품과 분석 자체의 독특하고 복잡한 설계로 인해 분자 방법에 적용하기 어렵고, 권장 평가 및 분석 검증을 위한 적절한 방법에 사용할 수 있는 플랫폼의 적합성에 대한 의문을 제기합니다. 현재까지 FDA는 PCR 기반 분석에 대한 공식적인 검증을 요구하지 않았지만 EMA는 이 요구 사항을 부과했습니다17. 이러한 공백에 비추어 여러 그룹과 워크샵에서 제조업체와 계약 연구 기관이 18,19,20,21,22,23,24,25를 따르려고 노력한 백서와 권장 사항을 발표했습니다. 이러한 권장 사항의 대부분은 qPCR 분석을 염두에 두고 특별히 작성되었으며, 관련성이 있는 것으로 간주되는 경우에만 포함된 droplet digital PCR(ddPCR)과 같은 새로운 플랫폼에 대한 제안 또는 변경이 포함됩니다. 보다 최근의 권장 사항은 ddPCR 분석에 대한 고려 사항에 중점을 두었지만 바이오쉐딩 연구에서 발생하는 복잡한 생물학적 매트릭스보다는 제조 환경에서 벡터 게놈 정량화에 대한 적용에 주로 초점을 맞췄습니다.
임상 적용 및 목표에 따라 ddPCR은 qPCR에 비해 ddPCR의 향상된 감도와 매트릭스 간섭 처리 능력으로 인해 생체 분포 및 흘리기 연구를 지원하기 위해 qPCR보다 선호될 수 있습니다. 또한 시료를 약 20,000개의 액적으로 분할하기 때문에 포아송 통계를 사용하는 표준 곡선을 사용하지 않고도 복제 수를 정확하게 정량화할 수 있어 분석법 개발 및 검증이 간소화됩니다. 이 프로토콜의 목표는 임상 바이오셰딩 연구를 지원하기 위해 안구 표면에서 수집된 눈물에서 AAV 벡터를 검출하기 위한 ddPCR 기반 방법의 개발 및 검증을 위한 표준화된 접근 방식을 설명하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>AAV-eGFP Vector</td><td>Charles River Laboratories</td><td>RS-AAV2-FL</td><td>Lot AAV2-0720-FL, 원리 벡터</td></tr><tr><td>AutoDG Droplet Digital PCR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>대체 ddPCR 시스템은 다음 제조업체에 따라 사용될 수 있습니다. s 프로토콜.</td></tr><tr><td>AutoDG Oil for Probes</td><td>Bio-Rad</td><td>1864110</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr>프로브 <td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td>용 ddPCR 버퍼 제어</td><td>또는 ddPCR 시스템 및 PCR 화학과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>ddPCR 액적 판독기 오일</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>ddPCR 피어커블 포일 씰</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>ddPCR 플레이트 96-well, semi-skirted</td><td>bio-Rad</td><td>12001925</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023, 1863024 또는 1863025</td><td>프라이머/프로브 및 ddPCR 시스템과 호환되는 마스터 믹스를 사용합니다.</td></tr><tr><td>DG32 AutoDG Cartidges</td><td>Bio-Rad</td><td>1864108</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>액적 판독기</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>대체 ddPCR 시스템은 제조업체에 따라 사용할 수 있습니다. s 프로토콜.</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR Buffer</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080129</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr>AutoDG <td>Bio-Rad</td><td>1864120</td><td>용 피펫 팁</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 비이온 계면활성제</td><td>Gibco</td><td>24040</td><td>N/A</td></tr><tr><td>프라이머 및 가수분해 프로브</td><td></td> 프라이머/프로브 설계를 위한 일반적인 접근 방식을 사용하여 타겟 염기서열을 기반으로 <td>하는 다양한</td><td>설계. ddPCR 시스템과 호환되는 형광체 및 담금질제를 선택하십시오.</td></tr><tr><td>Restriction Enzyme</td><td>다양한</td><td>타겟</td><td>증폭 순서에 따라 다양합니다. 증폭 서열에서 절단되지 않는 제한효소 사용</td></tr><tr><td>전단 연어 정자 DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9680</td><td>N/A</td></tr><tr><td>합성 DNA 유전자 단편 또는 선형화 플라스미드</td><td>다양한</td><td></td><td>품질 관리로 사용하기 위해 표적 증폭 영역을 포함하는 합성 DNA 단편 다양한 설계</td></tr><tr><td>TE</td><td>Buffer Teknova</td><td>T0224</td><td>뉴클레아제가 없는지 준비하거나 구매하십시오. 10mM Tris-HCl, 1.0mM EDTA, pH=8.0</td></tr><tr><td>Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000</td><td>또는 ddPCR 시스템과 호환되는 재료를 사용하십시오.</td></tr></tbody></table>

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

유전 질환을 치료하기 위한 바이러스 벡터의 사용은 최근 몇 년 동안 크게 증가했으며 현재까지 2,000건 이상의 연구가 등록되었습니다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 voretigene neparvovec-rzyl의 승인에 의해 예시된 바와 같이 눈 관련 질병의 치료에서 특별한 성공을 발견했습니다. 새로운 치료법을 시장에 출시하기 위해 규제 기관은 일반적으로 벡터가 환경으로 방출되는 것을 평가하기 위해 적격하거나 검증된 바이오쉐딩 연구를 요청합니다. 그러나 미국 식품의약국(FDA)은 이러한 흘리기 연구를 지원하기 위한 분자 기반 분석 개발에 대한 공식 지침을 발표하지 않았으므로 개발자가 스스로 모범 사례를 결정해야 합니다. 이 프로토콜의 목적은 임상 바이오쉐딩 연구를 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 인간 눈물에서 AAV 벡터를 검출하기 위한 검증 가능한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이 원고는 분자 분석 검증에 대한 현재 업계의 접근 방식에 대해 논의하고 이 방법이 현재 백서에서 제안된 표적 분석 허용 기준을 초과함을 보여줍니다. 마지막으로, 응용 분야에 관계없이 모든 ddPCR 분석의 성능에 중요한 단계에 대해 설명합니다.

시연 목적을 위해, 품질 관리로 eGFP를 포함하는 합성 이중 가닥 DNA 단편을 사용하여 상업적으로 이용 가능한 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 발현 AAV2 벡터를 검출하도록 설계된 분석법이 개발되었습니다. 현재, 벡터 자체 또는 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드가 QC로서 사용하기에 가장 적합한지에 대한 논쟁이 진행 중이다. 일반적으로, 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드는 벡터에 대한 동등성이 방법 개발에서 입증되는 경우에 사용될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음). 프라이머와 프로브는 eGFP 이식유전자를 검출하도록 설계 및 최적화되었습니다. 이 작업에 사용된 시퀀스에 대해서는 보충 표 S1 을 참조하십시오. QC 단편 스톡의 농도는 ddPCR을 사용하여 경험적으로 결정되었습니다. 모든 검정은 프로토콜 섹션에서 예로서 주어진 농도 및 PCR 조건을 사용하여 수행하였다.
qPCR 분석의 경우 표준 곡선의 선형성, 감도, 동적 범위, 정확도 및 정밀도를 평가하는 것이 좋습니다. ddPCR은 표적 정량화를 위해 표준 곡선에 의존하지 않기 때문에 이러한 권장 사항을 수정해야 합니다. 대신, 푸아송 통계 모델링을 기반으로 ddPCR 반응의 예상 정량화 가능한 범위에 걸쳐 다양한 농도로 희석된 합성 이중 가닥 DNA 단편으로 구성된 QC를 29,30,31,32 동적 범위와 감도를 정의하고 정확도와 정밀도를 평가하기 위해 활용했습니다. QC 농도의 선택은 주로 주어진 농도에서 웰 내의 총 액적에 대한 양성 비율의 예상 비율을 기반으로 했습니다. 수학적으로 ddPCR은 파티션의 약 80%가 양으로 증폭될 때 이론적으로 가장 정확합니다. 총 액적 비율에 대한 양수 비율이 0.8 이상으로 증가하면 파티션의 포화로 인해 정확도가 감소하며 액적의 100%가 양수이면 정량화가 불가능합니다. 저가형에서는 이론적으로 하나의 양성 방울만 검출하고 정량화할 수 있지만 정확도는 더 낮고 분석은 낮은 수준의 위양성이 발생할 수 있습니다. 일반적으로 95% 신뢰도로 결과를 계산하려면 최소 3개의 물방울이 양수여야 하며, 이는 여기에서 사용한 농도를 계산하기 위한 임계값입니다.
표 5와 같이 일련의 5가지 다른 QC 농도를 준비했으며, 계산된 표적 복제 수/μL PCR 반응 부피는 ddPCR의 정량화 가능한 범위에 걸쳐 총 액적 비율에 대해 양성을 산출할 것으로 예상됩니다. 이들은 분석의 정확성과 정밀도를 평가하는 데 사용되었습니다. 여기의 평가에서 정량화의 상한 및 하한은 ddPCR에서 가능한 이론적 최대치로 밀려나지 않았습니다. 정확한 정량화는 여기에서 입증된 것보다 더 높은 수준과 더 낮은 수준에서 가능할 수 있습니다. 범위는 이 방법의 다운스트림 응용 프로그램에 맞게 개발되어야 합니다.
이러한 QC의 총 3개의 독립적으로 준비된 희석 시리즈를 각 배치에 대한 샘플 희석 완충액에서 준비하여 분석 내 정확도 및 정밀도를 평가했습니다. 각각의 QC 희석액의 중복 웰이 포함되었다. 실제 검증 프로토콜을 시뮬레이션하기 위해 여러 분석가가 여러 날에 걸쳐 총 6개의 정확도 및 정밀도 배치를 수행했습니다. 이 6 개의 배치의 결과를 분석하여 분석법의 분석 내 및 분석 간 정확도와 정밀도를 정의하고 분석의 동적 범위를 정의했습니다.
각 QC 수준에서 각 배치에 대해 분석 내 성능을 평가했습니다. 우리는 모든 QC 및 NTC 우물에 최소 10,000개의 물방울이 있을 것으로 예상했습니다. 이는 6개 배치 모두에서 테스트된 216개의 웰 중 216개에서 충족되었으며 평균 액적 수는 19,748개의 액적/웰이었습니다(표 6). 다음으로, 각 QC의 각 세트의 중복 웰의 웰 간 %CV는 ≤30.0%가 예상되는 상한 및 하한 QC를 제외하고 ≤25.0%로 예상되었습니다. 이는 QC에 대한 6개 배치 모두에서 테스트된 90개 웰 중 90개 세트에서 충족되었으며, 모든 QC 수준에서 평균 웰 간 %CV는 3.9%였습니다(표 7). 모든 QC는 위에서 설명한 예상 범위 내에서 총 액적 비율에 대해 평균 양성을 산출했습니다(표 6).
각 배치 내에서, 독립적으로 제조된 희석 계열 점들 각각에 대해 분석내 평균 및 표준편차를 계산하고, 이들을 사용하여 각 분석에서 각각의 농도에 대한 분석내 평균을 계산하였다. 이것은 분석의 정확도 및 정밀도를 평가하기 위해 사용되었다 (표 8). 정밀도는 정상적인 분석 조건에서 동일한 균질 샘플의 반복실험 데이터 변동성을 나타내며 포함된 여러 부분 표본의 %CV를 계산하여 평가합니다. 우리는 ≤30.0%가 예상되는 상한 및 하한 QC를 제외하고 각 배치 내에서 테스트된 3개의 분취액이 분석 내 %CV ≤25.0%를 산출할 것으로 예상했습니다. 이는 60개 배치 각각에서 5개의 QC 수준 모두에 대해 충족되었습니다(총 성능 30개 중 30개). 일반적으로 모든 QC 수준에서 평균 분석 내 %CV가 7.7%로 목표 기준보다 더 높은 분석 내 정밀도를 달성할 수 있습니다. 정확도는 실험적으로 결정된 값과 공칭 값 사이의 일치 정도를 나타냅니다. 이는 각 QC의 계산된 농도와 이론적으로 예상되는 공칭 농도 사이의 백분율 상대 오차(%RE 또는 %Bias)를 계산하여 평가됩니다. 3개의 분취액의 분석 내 평균은 ±30.0%가 예상되는 상한 및 하한 QC를 제외하고 공칭 농도의 ±25.0% RE일 것으로 예상되었습니다. 이는 60개 배치 각각에서 5개의 QC 수준 모두에 대해 충족되었습니다(총 성능 30개 중 30개). 일반적으로 모든 QC 수준에서 평균 절대 분석 내 %RE가 4.2%로 목표보다 더 높은 분석 내 정확도를 달성할 수 있습니다. NTC (총 30 개)의 모든 성능에서 양성 방울이 감지되지 않았습니다.
분석 간 정확도 및 정밀도는 또한 각 배치 내의 각 QC 수준의 분석 내 평균을 사용하여 계산되었습니다. 분석 간 정밀도는 ≤30.0%가 예상되는 상한 및 하한 QC를 제외하고 ≤25.0% CV로 예상되었습니다. 마찬가지로, 분석 간 정확도의 경우 ±30.0%가 예상되는 상한 및 하한 QC를 제외하고 ±25.0% RE가 예상되었습니다. 4.0%에서 8.5% 범위의 분석 간 정밀도와 1.0%에서 3.2% 범위의 분석 간 절대 정확도로 이러한 목표보다 훨씬 더 큰 분석 간 정확도와 정밀도가 관찰되었습니다(표 9). 종합적으로, 이러한 결과는 이 방법이 현재 산업 목표 내에서 충분한 분석 내 및 분석 간 정확도와 정밀도를 달성할 수 있음을 보여줍니다. PCR 반응 μL당 2,500-2.5 카피의 이 분석의 동적 범위는 이러한 결과를 기반으로 정의할 수 있으며, 전체 분석 민감도는 PCR 반응 μL당 2.5 카피입니다. 앞서 언급했듯이 더 넓은 다이내믹 레인지를 검증하는 것이 가능할 수 있습니다.
다음으로, 표적 매트릭스 내에서 분석 정확도와 정밀도를 평가할 필요가 있었습니다(이 경우 눈물). 일반적으로 분석은 임상 연구를 시작하기 전에 검증되며, 이는 벡터 처리 환자로부터 수집된 눈물이 검증 목적으로 사용될 가능성이 낮다는 것을 의미합니다. 이것은 매트릭스 스파이크 QC를 생성하기 위해 자원 봉사 기증자로부터 수집된 눈물에 표적 AAV 벡터를 스파이크하여 인위적으로 생성할 수 있습니다. 풀링된 인간 눈물은 제3자(BioIVT)에 의해 수집되었습니다. 원리 증명을 위해, 상업적 공급원으로부터 획득된 eGFP-발현 AAV2 벡터를 이용하였다. AAV2 벡터 스톡의 농도는 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, DNA 단리 단계를 사용하지 않고, ddPCR을 사용하여 경험적으로 결정하였다. 각 실행에서, AAV2는 높음(예상 1.41 x 10 3 카피/μL PCR 반응) 및 낮음(28.2 카피/μL PCR 반응) 수준에서3 개의 눈물 분취액에 독립적으로 스파이크되었다. 스파이크되지 않은 분취량은 방법의 특이성을 입증하기 위해 대조군으로 포함되었습니다.
인트라-분석 성능은 각각의 스파이크 레벨에서 각각의 배치에 대해 평가되었다. 모든 눈물 샘플에는 최소 10,000개의 물방울이 있을 것으로 예상되었습니다. 이는 6개 배치 모두에 걸쳐 테스트된 108개 웰 중 108개에서 충족되었으며, 평균 총 액적 수는 20,208개/웰이었습니다(표 10). 다음으로, 각 QC의 각 세트의 중복 웰의 웰 간 %CV는 높은 스파이크 수준 및 낮은 스파이크 수준에 대해 ≤25.0%인 것으로 예상되었습니다. 이는 QC에 대한 6개의 배치 모두에 걸쳐 테스트된 36개 웰 세트 중 36개에서 충족되었으며, 평균 웰 간 %CV는 3.2%였습니다(표 11).
각각의 배치 내에서, 독립적으로 제조된 눈물 스파이크 각각에 대해 분석내 평균 및 표준편차를 계산하고, 이들을 사용하여 각각의 분석에서 각각의 농도에 대한 분석내 평균을 계산하였다. 이를 매트릭스에서 분석의 정확도 및 정밀도를 평가하기 위해 사용하였다(표 12). 우리는 분석 내 %CV가 ≤25.0%이고 높고 낮은 스파이크 수준이 될 것으로 예상했습니다. 이것은 각 레벨에 대해 6 개의 배치 중 6 개에서 충족되었습니다. 일반적으로 매트릭스에서 목표보다 더 큰 분석 내 정밀도를 달성할 수 있으며, 평균 분석 내 %CV는 높은 수준에서 3.7%, 낮은 수준에서 12.2%(전체 8.0%)입니다. 또한 분석 내 %RE는 두 스파이크 수준 모두에서 ±25.0%가 될 것으로 예상되었습니다. 이것은 각 레벨에 대해 6 개의 배치 중 6 개에서 충족되었습니다. 마찬가지로, 일반적으로 낮은 수준에서 8.1%, 높은 수준에서 11.3%(전체 9.7%)의 평균 분석 내 절대 %RE로 목표보다 매트릭스에서 더 큰 분석 내 정확도를 달성할 수 있는 것으로 나타났습니다. 스파이크되지 않은 대조군의 경우, 분취량(표 12)에서 eGFP 신호가 검출되지 않았으며, 이는 인간 눈물 매트릭스에서 방법의 특이성을 입증합니다.
눈물 매트릭스의 분석 간 정확도 및 정밀도는 또한 각 배치 내의 각 스파이크 수준의 분석 내 평균을 사용하여 계산되었습니다. 분석 간 정밀도는 ≤25.0% CV가 될 것으로 예상되었고, 분석 간 정확도의 경우 ±25.0% RE가 예상되었습니다. 이러한 표적보다 유의하게 더 큰 분석 간 정확도 및 정밀도가 관찰되었으며(표 13), 분석 간 정밀도는 높은 수준에서 5.5%, 낮은 수준에서 7.1%, 절대 분석 간 정확도는 높은 수준에서 11.3%, 낮은 수준에서 8.1%입니다. 총체적으로, 이러한 결과는 눈물 매트릭스에서 방법의 정확성, 정밀도 및 특이성을 입증합니다.
표 5: 분석의 동적 범위를 정의하는 데 사용되는 품질 관리. 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%205.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 6: 합성 이중 가닥 DNA 품질 관리 및 NTC의 총 액적 수 및 양성 대 총 액적 비율. 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%206.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 7: QC 웰 간 통계(copy target/μL PCR 반응). 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%207.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 8: QC의 분석 중 정확도 및 정밀도(복사 표적/μL PCR 반응). 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%208.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 9: QC의 분석 간 정확도 및 정밀도(복사 표적/μL PCR 반응). 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%209.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 10: 눈물 샘플의 총 액적 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2010.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 11: 눈물 샘플 웰 간 통계(copy target/μL PCR 반응). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2011.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 12: 눈물 샘플의 분석 내 정확도 및 정밀도(복사 대상/μL PCR 반응). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2012.zip" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 13: 눈물 샘플의 분석 간 정확도 및 정밀도(복사 표적/μL PCR 반응). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%2013.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S1: 이 연구에 사용된 프라이머, 프로브 및 합성 이중 가닥 DNA 품질 관리의 서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Supp.%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

우리의 프로토콜은 복잡한 매트릭스에서 아데노 관련 바이러스 벡터를 정량화합니다. 정확한 검출 및 정량화는 임상 시험에서 성능을 평가하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 특히 우수 실험실 관행 준수 분자 연구 설계에서 현재의 규제 격차를 메우기 위해 노력합니다.바이러스 벡터 개발의 일환으로, 규제 기관은 벡터 바이오 쉐딩에 대한 평가를 요구합니다. ddPCR은 표준 곡선을 사용하지 않고도 정확한 정량을 가능하게 하고 qPCR에 비해 감도가 향상되기 때문에 이 평가를 위한 유망한 기술입니다. 눈물과 같은 임상 환경에서 발생하는 복잡한 매트릭스의 정확한 정량화는 PCR 간섭 및 억제로 인해 검증하기 어려울 수 있습니다.제한된 임상 샘플의 양은 분석이 충분히 민감하지 않은 경우 희귀 사건을 검출하는 능력을 제한할 수도 있습니다. 우리의 접근 방식은 규제 연구에 사용하기 위한 분석을 검증하기 위해 반복 가능하고 적응 가능한 ddPCR 기반 프레임워크를 개발합니다. 이 방법은 특정 DNA 추출 단계를 피하여 보다 간소화된 검증을 가능하게 하고 견고성과 반복성을 보장하기 위해 분석 성능을 평가할 수 있는 명확한 기준을 제공합니다.이 프로토콜은 여기에 제시된 바와 같이 눈물에서 AAV를 검출하는 것뿐만 아니라 모든 바이러스 벡터 흘리기 연구에 적용될 가능성이 있습니다. 목적에 맞는 여러 규제 프로그램을 개발할 수 있는 강력하고 반복 가능한 프레임워크를 만듭니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

PCR은 많은 분자 생물학 연구소의 일반적인 기법으로 부상하고있다. 여러 기존의 PCR 프로토콜에 대한 안내서가 여기에 제공됩니다. 각 반응은 독특한 실험, 제품이 다양 생성하는 데 필요한 최적의 조건이기 때문에. 반응의 변수를 이해하는 것은 크게함으로써 원하는 결과를 얻을 수있는 기회를 증가 문제 해결 효율성을 향상시킬 것입니다.

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

학습하세요 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터를 검출하는 ddPCR 분석법을. 이 검증된 프로토콜은 임상 시험에서 바이러스 바이오셰딩을 정량화하여 유전자 치료 연구의 신뢰성을 높입니다.

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

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