형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가
2023년 10월 27일
단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
CAR T세포는 인체 임상시험에서 더 나은 반응을 얻기 위해 지속적으로 개선되고 있습니다. 우리는 형광 이미징을 사용하여 가장 잘 작동하는 조합을 스크리닝하는 것과 같은 편향되지 않은 고처리량 방법을 사용하여 실험실에서 이를 평가하는 방법을 찾고 있습니다. 세포외 및 힌지 도메인의 기하학적 구조를 수정하여 임의의 단일 사슬 가변 단편에 대해 설계할 수 있는 구성물의 여러 조합이 있습니다.
이 프로토콜은 Jurkat 세포를 사용하여 표적 세포를 제거하는 데 가장 효과적인 조합을 식별하기 위해 설계되었습니다. 이는 Jurkat 세포를 사용하여 표적 세포 독성을 기반으로 CAR 구조를 스크리닝하기 위한 빠르고 처리량이 높은 프로토콜로, 기존 T 세포로 검증됩니다. 이 기술을 사용하여 12개의 서로 다른 CAR 구조를 96웰 플레이트에서 동시에 테스트할 수 있습니다.
Akhavan Lab에서는 여러 CAR 구조를 스크리닝하기 위해 높은 처리량 방식으로 Jurkat 세포를 발현하는 CAR에 의한 표적 세포의 직접 순환을 절대적인 수로 정량화합니다. 우리 실험실의 주요 목표는 고급 뇌종양에 대한 CAR T 세포 요법의 임상 번역을 개선하는 것입니다. 당사는 CAR T 세포 세포 독성을 개선하고 종양 미세환경을 표적으로 삼기 위한 하나의 양식으로 고처리량 약물 스크리닝을 활용합니다.
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개요
이 프로토콜은 종양 세포에 대한 CAR 발현 Jurkat 세포의 세포독성을 평가하기 위한 고처리량 방법을 설명합니다. 이를 통해 특정 종양 항원을 타겟팅하는 가장 효과적인 조합을 식별하기 위해 다양한 CAR 구성체를 신속하게 스크리닝할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 암 생물학
- 세포 치료
배경
- CAR T 세포는 임상 결과를 개선하기 위해 개선되고 있습니다.
- 고처리량 스크리닝 방법은 CAR 구성체를 최적화하는 데 필수적입니다.
- Jurkat 세포는 CAR 효과를 평가하는 모델로 사용됩니다.
- 이 연구는 목표 세포에 대한 CAR 구성체의 세포독성에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- CAR 구성체를 효율적으로 스크리닝할 프로토콜을 개발합니다.
- CAR 발현 Jurkat 세포의 세포독성 효과를 정량화합니다.
- 종양 항원을 타겟팅하기 위한 최적의 CAR 구성을 식별합니다.
사용된 방법
- 고처리량 스크리닝을 위한 형광 이미징.
- 96정 플레이트 형식에서 여러 CAR 구성체의 평가.
- CAR 발현 Jurkat 세포에 의한 목표 세포 살상의 정량화.
- 검증을 위한 기존 T 세포 반응과의 비교.
주요 결과
- 종양 세포 살상을 위한 효과적인 CAR 구성체의 식별.
- Jurkat 세포를 사용한 고처리량 기능의 시연.
- 다른 구성체 간의 세포독성에 대한 정량적 평가.
- 임상 적용 전에 CAR 설계의 신속한 최적화 가능성.
결론
- 이 프로토콜은 CAR 구성체의 효율적인 스크리닝을 가능하게 합니다.
- Jurkat 세포는 CAR 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.
- 이 접근법은 CAR T 세포 치료의 개발을 가속화할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput cytotoxicity evaluation of CAR constructs in Jurkat cells enables early-stage de-risking and prioritization of CAR designs before resource-intensive primary T cell validation. This platform accelerates the identification of hinge-optimized CARs with superior target cell killing, supporting efficient portfolio triage in oncology cell therapy pipelines. By quantifying cytotoxicity across multiple constructs simultaneously, teams can make data-driven decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of CAR construct permutations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying direct cytotoxicity in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in construct selection prior to primary T cell engineering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CAR-Jurkat systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes cytotoxicity assays with quantitative fluorescent imaging outputs.
- Enables reproducible, scalable evaluation of multiple CAR constructs in parallel.
- Supports reliable compound or construct evaluation in 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cytotoxicity data with translational goals by confirming findings in PBMC-derived T cells.
- Provides continuity from discovery-stage construct optimization to preclinical validation steps.
- Reduces risk of late-stage attrition by filtering out suboptimal CAR designs early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput cytotoxicity platform fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging construct design with preclinical validation. It enables rapid hypothesis testing and construct triage before advancing to resource-intensive primary T cell or in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of hinge and extracellular domain modifications for CAR efficacy.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cytotoxicity data for construct comparison and ranking.
- Analytics: Provides absolute cell counts and statistical outputs (e.g., one-way ANOVA) to inform decision-making.
- Translational Research: Confirms construct performance in PBMC-derived T cells, supporting translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for ongoing CAR construct optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR construct selection.
- Operational Value: Standardizes and scales cytotoxicity evaluation, enabling efficient resource allocation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by filtering constructs early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAR construct design and lentiviral transduction of Jurkat cells.
- Needs access to fluorescent imaging instrumentation and analytical software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis parameters.
- Adaptation to other cell models or antigens may require protocol optimization.
- Dependent on robust statistical analysis (e.g., ANOVA) for construct comparison.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
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