Name: 인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 인간 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링 방법을. 고내용 이미징과 면역염색을 활용하여 126개의 정량적 특징을 추출하고, 파킨슨병 관련 유전적·화학적 변화를 분석하는 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는 제시된 프로토콜의 설계로 이어지는 귀중한 도움과 토론에 대해 Ksilink의 모든 동료에게 감사의 뜻을 전합니다.

1. 뉴런 파종을 위한 배지 및 플레이트 준비(1일차)
<ol><li>Day-1에 뉴런 파종을 위해 플레이트를 준비하려면 사용 직전에 라미닌을 실온(RT)으로 데우십시오. 라미닌 원액(0.1mg/mL)을 차가운 PBS+/+(Ca 2+ 및 Mg2+ 포함)에 1/10로 희석하여 라미닌 용액을 준비합니다. 알림: 모든 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 용액 및 완충액의 조성은 표 1-4에 기재되어 있다.</li>
	<li>그런 다음 25μL의 라미닌 용액을 PDL(Poly-D-Lysine) 사전 코팅된 384웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.</li>
	<li>전체 유지보수 매체를 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(표 1).</li>
</ol>2. 뉴런의 해동(0일차)
<ol><li>0일째에 뉴런을 해동하려면 수조를 37°C로 예열하고 빛으로부터 보호되는 전체 유지 관리 배지를 RT로 평형화합니다.</li>
	<li>상업적으로 얻어진 냉동 뉴런( 재료 표 참조)이 들어 있는 바이알을 액체 질소 탱크에서 꺼내 드라이아이스 위에 놓습니다. 그런 다음 바이알을 수조에 2분 동안 넣습니다. 액체가 완전히 해동되면 70% 에탄올로 바이알을 소독합니다.</li>
	<li>P1000 피펫(약 370μL)으로 해동된 뉴런을 흡인하고 상하 피펫팅 없이 50mL 원심분리 튜브에 전달합니다. 그런 다음 630μL의 Complete Maintenance Medium으로 바이알을 헹구고 50mL 튜브에 한 방울씩 떨어뜨립니다(45° 각도). 분배하는 동안 천천히 저어줍니다. 알림: 세포의 삼투압 파열을 방지하기 위해 배지를 천천히 한 방울씩 분배하는 것이 중요합니다. 45° 각도와 가벼운 교반은 피펫팅 중 높은 국부 삼투압을 최소화합니다.</li>
	<li>마찬가지로, P1000 피펫을 사용하여 50mL 원심분리기 튜브에 1mL의 Complete Maintenance Medium을 추가합니다. 그런 다음 Complete Maintenance Medium 2mL를 천천히 추가합니다. 분배하는 동안 조심스럽게 저어줍니다.</li>
	<li>셀을 셉니다. 10 μL Trypan Blue 및 10 μL 세포 현탁액이 있는 마이크로튜브를 준비하고 계수 챔버 슬라이드(10 μL)에 추가합니다. 자동화된 셀 카운터( 재료 표 참조)를 사용하거나 수동으로 계수를 수행합니다.</li>
	<li>카운팅 후 뉴런이 포함된 50mL 튜브를 RT에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. P1000 피펫과 1mL의 Complete Maintenance Medium을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다. 그런 다음 원하는 농도에 도달하기 위해 필요한 부피를 추가합니다(300,000세포/mL, 다음 단계 참조).</li>
</ol>3. 준비된 판에 뉴런 파종(Day 0)
<ol><li>0일째에 준비된 플레이트에 뉴런을 파종하려면 코팅된 플레이트를 냉장고에서 꺼내 세포 배양 후드 아래에 놓고 약 30분 동안 RT와 평형을 이루도록 합니다.</li>
	<li>파종 직전에 자동 액체 처리기 또는 16채널 피펫을 사용하여 15μL 코팅 용액을 흡입합니다. 코팅 손상을 방지하기 위해 웰당 약 10μL를 남겨 둡니다.</li>
	<li>다음으로, 웰당 300,000 cells/mL(2.6단계에서 준비)를 포함하는 세포 용액 50μL를 16채널 피펫으로 분주하여 웰당 15,000개의 시드된 뉴런과 웰당 60μL의 최종 부피를 생성합니다.</li>
	<li>384웰 플레이트에서는 표현형 프로파일에 영향을 줄 수 있는 가장자리 효과를 최소화하기 위해 열 1, 2, 23, 24 및 열 A, B, O, P를 사용하지 마십시오. 사용하지 않는 빈 웰을 80μL의 PBS로 채웁니다. 플레이트를 37 °C 및 5 % CO2 에서 배양합니다.</li>
</ol>4. 배지 변화 또는 복합 처리(3일차)
<ol><li>웰 수에 따라 적절한 양의 Complete Maintenance Medium을 RT에서 미리 예열합니다. 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>매체 변경이 필요한 경우 4.4단계로 진행합니다. 복합 처리가 필요한 경우 화합물 스톡 농도와 사용된 용매(물, DMSO, 메탄올 등)를 확인합니다.</li>
	<li>테스트할 모든 원하는 농도에 대해 1.5x 농축 화합물 용액을 준비합니다. Complete Maintenance Medium을 사용하여 화합물 희석액을 준비합니다. 알림: 중성 대조군으로 테스트된 화합물과 동일한 농도의 각 용매를 사용하십시오. 서로 다른 농도의 여러 또는 알려지지 않은 화합물을 사용하는 경우 표현형 프로파일에 대한 용매 효과를 측정하기 위해 별도의 용량-반응 실험을 수행하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>자동 피펫팅 시스템을 사용하는 경우 60μL의 1.5x 복합 용액을 384웰 보관 플레이트에 추가합니다. 또는 16채널 피펫을 사용하십시오. 배지 교체가 필요한 경우 대신 60μL의 Complete Maintenance Medium을 추가합니다.</li>
	<li>자동 피펫팅 시스템을 사용하여 뉴런 함유 플레이트에서 웰당 40μL의 배지를 흡입 및 폐기하여 20μL/웰을 유지합니다. 그런 다음 384웰 보관 플레이트에서 40μL/웰의 1.5x 복합 용액을 각 웰에 추가하여 원하는 최종 농도를 얻습니다. 알림: 전체 배지 교체를 수행하지 말고 신경 카펫이나 코팅의 손상을 방지하기 위해 항상 웰에 잔류 배지를 남겨 두는 것이 중요합니다.</li>
	<li>이 프로토콜에 설명된 6일 이상 신경 세포 배양을 수행하는 경우 2-3일마다 배지를 교체하십시오.</li>
</ol>5. 뉴런 고정 및 염색(6-7일)
<ol><li>6일과 7일에 뉴런을 고정하고 염색하려면 모든 분주 및 세척 단계에 자동 액체 처리기를 사용하십시오. 또는 16채널 피펫을 사용하십시오.</li>
	<li>Triton X-100을 1x PBS에 희석하여 10% Triton X-100 용액을 준비합니다. 용액이 균질해질 때까지 소용돌이칩니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>뉴런을 고정하기 위해 16% PFA의 20μL/웰을 분주하여 최종 농도를 4%로 만듭니다. 플레이트를 RT에서 30분 동안 배양하고 1x PBS로 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 PBS 20μL/웰을 남겨 둡니다. 주의: PFA는 구강, 피부 및 호흡기 독성을 유발하는 것으로 알려진 유해 물질로 인식되고 있습니다. 또한 눈에 위협이 되며 유전적 돌연변이와 암을 유발할 수 있습니다. PFA를 적절하게 취급하려면 적절한 환기를 보장하는 것 외에도 눈 및 얼굴 보호구와 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. PFA가 환경으로 방출되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>투과화 및 차단을 위해 2x 차단 용액을 준비합니다(표 2).</li>
	<li>2x 차단 용액(1x 최종 농도)의 20μL/웰을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 한 번 세척합니다. 세척 후 PBS 20μL/웰을 보관하십시오.</li>
	<li>1차 항체( 재료 표 참조) 염색을 위해 2x 1차 염색 완충액을 준비합니다(표 3).</li>
	<li>2x 1차 염색 완충액(1x 최종 농도)의 웰당 20μL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침 7일째 PBS로 세 번 씻으십시오. 세척 후 PBS 20μL/웰을 남겨 둡니다.</li>
	<li>2차 항체( 재료 표 참조) 염색을 위해 2x 2차 염색 완충액을 준비합니다(표 4).</li>
	<li>2x 2차 염색 완충액(1x 최종 농도)의 웰당 20μL를 추가하고, 빛을 피해 RT에서 2시간 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 100μL PBS/well을 그대로 두십시오.<ol><li>증발을 최소화하기 위해 플레이트에 알루미늄 밀봉을 추가하십시오. 또는 플라스틱 필름과 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 이미지 획득을 진행하거나 플레이트를 4°C에서 보관합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 배경 형광이 관찰되면 차단 시간을 늘리는 것이 좋습니다. 염색이 충분하지 않은 경우 1차 항체 농도 또는 배양 시간을 늘려 보십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 형광 염색 뉴런의 이미징(7일차)
<ol><li>7일째에 도금, 배양 및 염색된 뉴런의 이미지를 획득합니다. 이상적으로는 자동 컨포칼 형광 현미경을 사용하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조). 또는 수동으로 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>각각 405nm, 488nm, 561nm 및 647nm 레이저를 사용하여 Hoechst, TH, α-synuclein 및 MAP2 채널을 획득합니다(그림 2). 참고: 표현형 프로파일링을 위한 충분한 양의 상세 데이터를 생성하려면 40x 대물렌즈를 사용하고 2μm로 분리된 3개의 Z 슬라이스로 구성된 Z 스택을 사용하여 16개의 필드/웰을 획득합니다. 신경 카펫에 피펫팅 관련 손상이 있는 경우 이러한 영역을 이미징하지 마십시오.</li>
	<li>현미경과 카메라에 따라 4개의 형광 채널 각각에 대한 노출 시간과 여기 강도를 개별적으로 조정하여 형광 강도의 최적 동적 범위를 얻을 수 있습니다. 참고: 이미징 소프트웨어는 이상적인 노출 시간을 결정하기 위해 히스토그램을 제공하는 경우가 많습니다. 낮은 신호 범위에서 히스토그램이 너무 왼쪽으로 치우치면 노출 시간이 너무 짧거나 여기 강도가 너무 낮은 것입니다. 오른쪽의 최대 신호 레벨에 급격한 절벽이 있으면 신호 값이 포화 상태입니다. 이 경우 여기 강도를 줄이거나 노출 시간을 줄이십시오.</li>
	<li>.tif와 같은 손실 없는 개방형 형식으로 이미지를 저장합니다.</li>
</ol>7. 이미지 처리(8일차)
<ol><li>이미지 분할 및 표현형 특징 추출은 정량적 표현형 프로파일을 생성하는 데 필요합니다. 이미지 분할 및 특징 추출을 위해 PhenoLink 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표). PhenoLink 설치 지침은 GitHub 저장소(https://github.com/Ksilink/PhenoLink)에서 찾을 수 있습니다. 참고: 이미지 분할은 이미지에서 서로 다른 개체 또는 영역을 식별하고 분리하는 데 사용되는 반면, 표현형 특징 추출은 해당 영역에서 관련 정보를 분석하고 추출하는 데 사용됩니다. CellProfiler 10, ImageJ/FIJI 11, Napari12 또는 Knime Analytics Platform13과 같은 여러 대체 소프트웨어 솔루션을 사용하여 다중 채널 형광 이미지에서 정량적 정보를 추출할 수 있습니다.</li>
	<li>조명이 보정된 Raw 이미지에 대해 이미지 분할을 수행합니다. 각 형광 채널 강도 임계값을 플레이트별로 경험적으로 결정하여 배경 신호가 최소화되고 원하는 분할 신호가 원시 이미지의 신호에 대응하도록 합니다. 같은 날에 처리되고 염색된 플레이트는 일반적으로 분할을 위해 유사한 채널 강도 임계값이 필요합니다.</li>
	<li>살아있는 세포와 죽은 세포를 분리하기 위해 핵의 크기와 강도를 정의합니다. 40x 이미지를 사용하는 경우 다른 모든 기본 매개변수를 유지하고 소프트웨어를 실행합니다. 웰당 126개의 정량적 이미지 특징이 계산됩니다(보충 표 1).</li>
	<li>결과 표 형식의 정량 데이터를 사용하여 표현형 프로파일을 구성하고 다양한 세포주 또는 처리 조건의 표현형 프로파일을 비교할 수 있습니다. 각 행은 생물학적 조건(우물)에 해당하고 각 열은 결정된 표현형 특징에 해당합니다. 참고: 사용법을 설명하기 위해 데이터 분석 파이프라인과 함께 예제 출력 파일을 제공합니다( 자료 표 참조). 또한 그림 3 은 표현형 프로파일의 조성을 보여줍니다.</li>
</ol>8. 표현형 프로파일 생성 및 시각화 (8일차)
<ol><li>컴퓨터에 Python 및 Jupyter가 설치되어 있지 않은 경우 Anaconda 배포판을 설치하고 Jupyter 소프트웨어를 엽니다. 제공된 Jupyter Notebook 및 기타 제공된 모든 파일을 다운로드하여 동일한 디렉터리에 저장합니다( 자료 표 참조). Jupyter 소프트웨어를 사용하여 Jupyter Notebook 파일을 엽니다. 참고: Anaconda는 Python과 같은 프로그래밍 언어를 위한 무료 오픈 소스 플랫폼입니다. 이 플랫폼에는 제공된 Jupyter 노트북을 실행하여 표현형 프로파일(https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling)을 생성하고 분석할 수 있는 Python 인터프리터 Jupyter가 함께 제공됩니다.</li>
	<li>Jupyter 소프트웨어를 사용하여 Jupyter Notebook 셀을 셀별로 실행합니다. 제공된 샘플 데이터 .fth 및 요구 사항 .txt 파일은 Jupyter Notebook과 동일한 디렉터리에 있어야 합니다. 각 Jupyter Notebook 셀에는 해당 기능을 설명하기 위해 주석이 추가됩니다. 참고: Jupyter Notebook을 데이터 로드 및 크기 조정부터 시작하여 올바른 순서로 사용하고 셀별로 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. 모든 데이터 및 그래픽 출력은 Jupyter Notebook 원본 디렉터리에서 새로 만든 폴더에 저장됩니다. 그림 4 는 워크플로와 워크플로 출력을 보여 줍니다.</li>
</ol>

표현형 프로파일링을 위한 인간 중뇌 도파민 뉴런 배양

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표현형 프로파일링(Phenotypic profiling)은 형광 염색, 현미경 검사, 이미지 분석 등을 적용하여 세포에서 많은 수의 표현형을 측정하는 기술이다3. 표현형 프로파일을 얻고 세포주 또는 기타 실험 조건에서 비교하여 단일 판독값을 사용할 때 눈에 띄지 않을 수 있는 세포 생물학의 복잡한 변화를 이해할 수 있습니다. 여기서는 PD 세포 생물학17,18,19을 모델링하는 데 자주 사용되는 세포 유형인 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에 대한 표현형 프로파일링의 적용에 대해 설명합니다. mDA 뉴런에서의 표현형 프로파일링은 일반적인 형광 염색(generic fluorescent staining)4, 비뉴런 세포 유형(non-neuronal cell type)<sup class...

파킨슨병(PD)에서는 다양한 세포 생물학적 과정이 방해를 받습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 단백질 분해 결함, 소포 이동 및 엔도리소좀 기능 장애는 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실과 관련이 있으며, PD1에서 일반적으로 관찰됩니다. 따라서 파킨슨병은 서로 상호작용하고 악화시킬 수 있는 여러 질병 기전을 포함하는 것으로 보입니다. 이 기계론적 상호 작용을 조사하는 한 가지 유용한 방법은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 포괄적인 표현형 지문 또는 프로필을 생성하는 것입니다.
표현형 프로파일링은 측정 가능한 특성의 모음을 기반으로 샘플의 프로필을 생성하는 것과 관련된 접근 방식이며, 둘째, 이 프로필 2,3을 기반으로 샘플에 대한 예측을 수행하는 것을 포함합니다. 프로파일링의 목표는 다양한 특징을 포착하는 것이며, 그 중 일부는 이전에 질병이나 치료와 관련이 없었을 수 있다3. 결과적으로 프로파일링을 통해 예상치 못한 생물학적 과정을 밝힐 수 있습니다. 표현형 프로파일링은 일반적으로 형광 염색된 세포에 의존하며, 표현형 프로파일을 생성하기 위해 셀 페인팅(Cell Painting)과 같은 표준화된 분석법이 개발되었습니다4. 최근에, 표현형 프로파일링은 예를 들어, 소분자의 특성 분석 또는 환자 유래 섬유아세포만을 기반으로 하는 PD 아형의 정확한 예측에 적용되고 있다 5,6. 이러한 발전에도 불구하고 표현형 프로파일링은 LRRK2 G2019S와 같은 PD 연결 돌연변이를 발현하는 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런과 같은 유사분열 후 분화 세포에 거의 적용되지 않았습니다. iPSC 유래 모델의 중요한 과제로는 분화 배치 또는 유전자형에 걸쳐 미묘하거나 가변적인 병리학적 특징이 존재한다는 점과 분리된 PD 표현형이 질병의 전체 복잡성을 포착하지 못한다는 사실이 있습니다. 또한, iPSC 신경 세포 모델은 생리학적으로 관련이 있지만, 기술적 복잡성에 대한 우려로 인해 PD 약물 발견 프로세스에서는 거의 사용되지 않습니다 7,8.
우리는 이전에 유전적 및 화학적 화합물 유도 표현형 변화에 민감한 인간 mDA 뉴런에서 여러 PD 관련 병태생리학적 표현형을 측정하기 위한 강력한 방법론을 개발했습니다9. 이 기사에서는 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 생성하기 위해 이 방법론을 더욱 최적화된 버전으로 만드는 방법에 대해 자세히 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 고품질 mDA 뉴런의 사용 및 기술적 재현성과 같은 앞서 설명한 표현형 프로파일링 접근 방식에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 처음으로, 이 프로토콜은 확장성이 뛰어난 방식으로 화학적 섭동 후 생리학적으로 관련된 유사분열 후 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일링을 가능하게 합니다. 완전히 분화되고 동결 보존된 mDA 뉴런은 상용화되어 배치 간 분화 변동성을 크게 줄여줍니다. 둘째, 잘 정의된 실험 설계(예: 배양 기간 또는 에지 웰 방지), 자동화된 액체 처리 및 자동화된 현미경을 사용하여 기술적 변동성을 더욱 줄일 수 있습니다. 또한 비지도 클러스터링 또는 지도 분류 접근 방식을 사용한 표현형 프로파일 분석의 초기 단계가 여기에 요약되어 표현형 프로파일링 데이터를 분석할 수 있는 방법을 나타냅니다. 이 프로토콜은 유전적 또는 화학적 섭동에 의해 유도된 mDA 뉴런의 표현형 변화에 관심이 있는 연구자, 특히 스크리닝 캠페인 중 또는 독성 효과를 결정하기 위해 더 적은 수의 화합물의 효과를 연구해야 하는 경우와 같이 확장성이 뛰어난 연구 설정이 필요한 경우에 사용됩니다. 요약하면, 인간 뉴런의 표현형 프로파일링의 적용은 복잡한 질병 관련 표현형을 연구하고 약물 후보의 세포 효과를 특성화하는 데 유용한 기술일 것으로 예상됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg"> 그림 1: 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에서 이미지 기반 표현형 프로파일을 생성하기 위한 실험 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>안티 치킨 &ndash; Alexa 647</td><td>Jackson ImmunoRearch</td><td>703-605-155</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>아나콘다</td><td></td><td>https://www.anaconda.com/download</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2</td><td>Novus</td><td>NB300-213</td><td>면역형</td></tr>광 <tr><td>안티마우스 - Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>안티 토끼 - Alexa 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21429</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Merck</td><td>T2928</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-synuclein</td><td>Abcam</td><td>138501</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head</td><td>Agilent</td><td></td><td>액체 핸들러를 사용할 수 없는 경우 전자 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CV7000</td><td>이미지 품질의 일관성을 보장하기 위해 자동 컨포칼 형광 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>파종 전 세포 계수. 수동 계수 챔버를 사용하여 수행할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>DPBS +/+</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>EL406 세탁기 디스펜서 세척용 버퍼&nbsp;</td><td>BioTek (애질런트)&nbsp;</td><td></td><td>액체 처리기를 사용할 수 없는 경우 전동 멀티채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 (PFA 16 %)</td><td>Euromedex</td><td>EM-15710-S</td><td>염색 전 고정</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>iCell 베이스 배지 1</td> 뉴런용 <td>Fujifilm</td><td>M1010</td><td>기본 배지</td></tr><tr><td>iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M</td><td>Fujifilm</td><td>C1087</td><td>겉보기에 건강한 기증자</td></tr><tr><td>iCell DPN, Donor#11299, 표현형 LRRK2 G2019S, 표현형 PD lot#106139</td><td>Fujifilm</td><td>C1149</td><td>Donor carrying LRRK2 G2019S mutation&nbsp;</td></tr><tr><td>iCell 신경계 보충제</td><td>Fujifilm</td><td>M1031</td><td>기본 매체용 보충제</td></tr><tr><td>iCell 신경 보충제 B</td><td>Fujifilm</td><td>M1029</td><td>기본 매체용 보충제</td></tr><tr><td>Jupyter Python Notebook</td> 원시 <td>데이터에서 표현형 프로필 시각화 및 분류를 수행하기 위한</td> <td>사내 개발</td><td>https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling</td> Notebook.</tr><tr><td>Laminin</td><td>Biolamina</td><td>LN521</td><td>플레이트 코팅</td></tr><tr><td>PFE-360</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-120085</td><td>LRRK2 키나아제 억제제</td></tr><tr><td>PhenoLink</td><td>이미지 분석을 위한</td><td>자체 개발</td><td>https://github.com/Ksilink/PhenoLink</td> 소프트웨어</tr><tr><td>PhenoPlate 384w, PDL 코팅</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057500</td><td>세포 배양 및 이미징을 위한 사전 코팅된 플레이트. 이 플레이트를 사용하면 Yokogawa CV7000 현미경의 모든 대물렌즈를 사용하여 모든 웰을 이미징할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>저장 플레이트 Abgene 120 &micro; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0781</td><td>Vprep 피펫팅 시스템을 사용한 화합물 분주에 필요합니다. 사용할 수 없는 경우 전동 멀티채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>용해 전 투과화</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-20ML</td><td>살아있는 세포</td></tr><tr><td>Vprep 피펫팅 시스템의 결정&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>매체 변경 및 화합물 디스펜싱. 또는 전동 멀티채널 피펫을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons

파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실을 유발하는 다양한 세포 생물학적 과정과 관련이 있습니다. 현재의 많은 in vitro PD 세포 모델은 복잡성이 부족하고 여러 표현형을 고려하지 않습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 PD 관련 세포 유형에서 다양한 뉴런 표현형을 동시에 측정하여 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 인간 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 얻고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 뉴런 특이적 형광 염색 패널은 핵, α-시누클레인, 티로신 하이드록실라제(TH) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 관련 표현형을 시각화하는 데 사용됩니다. 설명된 표현형 프로파일링 프로토콜은 384웰 플레이트, 자동 액체 처리 및 고처리량 현미경을 사용하기 때문에 확장 가능합니다. 프로토콜의 유용성은 건강한 기증자 mDA 뉴런과 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2) 유전자에서 PD 결합 G2019S 돌연변이를 운반하는 mDA 뉴런을 사용하여 예시됩니다. 두 세포주 모두 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360으로 처리하고 표현형 변화를 측정했습니다. 또한 클러스터링 또는 기계 학습 기반 지도 분류 방법을 사용하여 다차원 표현형 프로파일을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 신경 질환 모델링을 연구하거나 인간 신경 세포의 화합물 효과를 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다.

mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 세포 생물학의 여러 측면과 실험 조절 중 변화를 정량화하는 효율적인 방법입니다. 이 방법론을 예시하기 위해 이 연구에서는 냉동 보존된 LRRK2 G2019S와 건강한 기증자 mDA 뉴런을 사용했습니다. 이 뉴런은 약 37일 동안 분화되었고, 유사분열 후 발현 뉴런 마커(TUBB3 및 MAP2)와 FOXA2와 결합된 티로신 하이드록실라제(TH)를 포함한 도파민성 뉴런 마커인 반면, 신경교세포 마커인 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP)은 결여되어있다 14. 설명된 프로토콜에 따라, 두 세포주를 6일 동안 배양하고 LRRK2 키나아제 억제제인 0.1μM PFE-360으로 처리했습니다. 뉴런은 핵 염색 Hoechst와 α-synuclein, TH 및 MAP2에 대한 항체를 사용하여 염색되었습니다(그림 2).
다음으로, 이미지를 분할하고 표현형 특징을 추출했습...

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...

우리는 뉴런과 같은 분화된 인간 세포의 표현형 프로파일을 구성합니다. 우리의 목표는 세포에 대한 화합물 처리의 전반적인 효과를 더 잘 이해하는 것입니다. 표현형 프로파일은 추가 기계론적 연구를 위한 덜 편향된 진입점을 제안할 수 있습니다.인간 도파민 뉴런을 분화하기 위한 프로토콜의 품질이 크게 향상되어 균질한 뉴런의 대량 생산이 가능해졌습니다. 또한 장기간에 걸쳐 분화된 세포의 재현성을 처리하기 위해 실험실 자동화의 사용이 증가하고 있으며, 물론 이미징 기반 데이터의 활용이 더 빠르고 상세해졌습니다. 가장 큰 과제는 표현형 프로파일이 정량화되고 재현 가능한지 확인하는 것입니다.이를 위해서는 동종 뉴런 배치를 생성하고 자동화에 적합한 프로토콜을 식별하는 것이 중요합니다. 그러나 자동화된 프로토콜을 사용하면 기술적 타당성과 생리학적 관련성 사이에 항상 절충안이 있습니다. 여기서 우리는 좋은 절충안을 찾았습니다.우리는 이미징 접근 방식을 사용하여 인간의 도파민 신경 세포를 철저히 특성화하기 위해 즉시 사용할 수 있는 솔루션을 개발했습니다. 자동화된 프로토콜은 이미지 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 더 많은 과학자들이 신경 표현형 프로파일을 생성할 수 있도록 지원합니다. 우리는 파킨슨병의 단일유전적 형태와 특발성 형태 간에 표현형 프로파일이 어떻게 다른지 더 잘 이해하고자 합니다.우리는 또한 도파민 뉴런이 예를 들어 미세아교세포와 같은 다른 뇌세포 유형과 상호 작용할 때 표현형 측면의 변화를 탐구하고자 합니다.

phenotypic-profiling-human-stem-cell-derived-midbrain-dopaminergic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

이 비디오에서는, 우리는 쥐의 뇌 조각의 전체 세포 구성에 기록된 dopaminergic 신경 세포로 전도성을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 기법은 동적 클램프라고합니다.

동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

학습하세요 인간 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링 방법을. 고내용 이미징과 면역염색을 활용하여 126개의 정량적 특징을 추출하고, 파킨슨병 관련 유전적·화학적 변화를 분석하는 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

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