Name: Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 인간 대변에서 밀도 구심 분리법을 사용하여 박테리아 세포외 소포를 분리하고 정제하는 방법. 이 프로토콜은 원심분리 시간을 단축하고 오염물질로부터의 분리 효율을 높여 BEV 연구에 신뢰할 수 있는 표준을 제공합니다.

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이 연구는 저명한 젊은 학자를 위한 국립 과학 기금(National Science Fund for Distinguished Young Scholars, 82025024)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82230080)의 핵심 프로젝트; 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFA1300604); 중국 국립 자연 과학 재단 (81871735, 82272438 및 82002245); 저명한 젊은 학자를 위한 광둥성 자연과학 기금(2023B1515020058); 광둥성 자연과학재단(2021A1515011639); 중국 산둥성 자연과학재단의 주요 국가 기초 연구 개발 프로그램(ZR2020ZD11); 박사후 과학 재단(2022M720059); 남부 의과 대학 Nanfang 병원의 뛰어난 청소년 개발 계획(2022J001).

Microbiota Multi-Omics를 위한 향상된 박테리아 세포외 소포체 분리

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<li>Park, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+changes+in+stool%2C+saliva%2C+serum%2C+and+urine+before+and+after+anti-TNF-%CE%B1+therapy+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).</li>
<li>Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+bacterial+extracellular+vesicles+in+human+body+fluids+by+orthogonal+biophysical+separation+and+biochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization.</a> Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).</li>
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<li>Kang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota%2C+especially+Akkermansia+muciniphila%2C+protect+the+progression+of+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> PloS one. 8 (10), 76520(2013).</li>
<li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+we+looking+at%3F+Extracellular+vesicles%2C+lipoproteins%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li>
<li>Correll, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+small+extracellular+vesicle+isolation+from+expressed+prostatic+secretions+in+urine+for+in-depth+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+bacterial+extracellular+vesicles%3A+important+players+in+regulating+intestinal+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment.</a> Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).</li>
<li>Alberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota+in+inflammatory+bowel+disease+and+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palacky%2C+Olomouc%2C+Czech+Republic%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).</li>
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<li>Lajqi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota-derived+small+extracellular+vesicles+endorse+memory-like+inflammatory+responses+in+murine+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils.</a> Biomedicines. 10 (2), 442(2022).</li>
<li>Lee, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+vesicle+of+gut+microbial+Paenalcaligenes+hominis+is+a+risk+factor+for+vagus+nerve-mediated+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment.</a> Microbiome. 8 (1), 107(2020).</li>
<li>Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+eukaryotic+extracellular+vesicles+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+new+players+in+the+gut-liver+axis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+enhance+tau+phosphorylation+and+contribute+to+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).</li>
<li>Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+bacterial+membrane+vesicle+production%2C+purification%2C+quantification%2C+and+examination+of+their+immunogenic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions.</a> Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).</li>
<li>Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+isolation%2C+and+characterization+of+bioengineered+bacterial+extracellular+membrane+vesicles+derived+from+Bacteroides+thetaiotaomicron+and+their+use+in+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development.</a> Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).</li>
<li>Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+isolation+of+extracellular+vesicles+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles.</a> Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).</li>
<li>Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+salivary+extracellular+vesicles+by+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+their+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stool+consistency+is+strongly+associated+with+gut+microbiota+richness+and+composition%2C+enterotypes+and+bacterial+growth+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates.</a> Gut. 65 (1), 57-62 (2016).</li>
<li>Wen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+extracellular+vesicles%3A+A+position+paper+by+the+Microbial+Vesicles+Task+Force+of+the+Chinese+Society+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles.</a> Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).</li>
</ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언한다.

박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아가 분비하는 지질-이중층 나노입자로, 풍부한 단백질, 지질, 핵산 및 기타 생체 활성 분자를 운반하여 박테리아20의 기능적 효과를 매개하는 데 기여합니다. 장에서 유래한 BEV는 염증성 장 질환, 크론병, 대장암과 같은 질병의 발병에 관여하고 일반적인 대사에 영향을 미치고 인지 기능 장애를 중재하는 것으로 확인되었습니다 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 <...

소화관은 인체에서 가장 풍부한 미생물 군집을 보유한 기관으로 널리 알려져 있으며, 박테리아의 90% 이상이 집락 형성 및 증식에 관여합니다 1,2. 장내 미생물총(microbiota)이 장내 미세환경을 조절하고 동시에 주로 손상된 장 장벽(intestal barrier)을 통해 멀리 떨어진 장기의 기능 장애와 상호 작용한다는 광범위한 증거가 입증되었습니다 3,4. 장내 미생물군의 불균형과 염증성 장 질환(IBD)5,6 및 장-뇌 축 을 통한 인지 장애(5,6,7,8)의 진행 사이에 상관관계가 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 박테리아에 의해 생성되는 박테리아 세포외 소포체(BEV)는 이러한 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.
BEV는 직경이 20nm에서 400nm에 이르는 박테리아 유도체를 캡슐화하는 나노 크기의 입자입니다. 박테리아와 숙주 유기체 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 입증되었다 9,10. 눈에 보이지 않음에도 불구하고, 이러한 입자는 진단 바이오마커, 치료 표적 및 약물 전달 수단으로서 광범위한 응용 분야로 인해 연구자들로부터 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다11. BEV 연구를 위한 생체 표본으로 자주 사용되는 인간 대변은 주로 장내 세균에서 추출하며 물, 박테리아, 지질, 단백질, 소화되지 않은 음식물 찌꺼기, 박리된 상피 세포의 복잡한 혼합물을 함유하고 있습니다. 복잡한 배설물 구성은 BEV의 분리 및 순도에 문제를 제기하여 BEV에 대한 포괄적이고 객관적이며 현실적인 분석을 방해합니다. 따라서 오염 부품의 간섭을 최소화하고 BEV의 수율을 높이기 위한 효과적인 전략이 즉각적인 주의가 필요한 중요한 문제로 떠올랐습니다.
기존의 분리 전략은 초고속 원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리(DGC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)12,13,14,15,16,17과 같은 기술에 크게 의존합니다. 현재 DGC는 BEV 분리 분야에서 가장 널리 적용되는 방법 중 하나로, 시료의 초기 로딩 위치에 의해 결정되는 "하향식(Top-down)" 및 "상향식(Bottom-up)"의 두 가지 침전 부유 모드를 포함합니다. 이러한 방법론은 크기 및 밀도 차이에 따라 세포외 소포체(EV)를 다른 구성 요소와 구별하여 다양한 순도와 회수율을 제공합니다. 선행 연구에 따르면 단일 접근법 전략은 혈액 내 지단백질18 및 소변 내 Tamm-Horsfall 단백질과 같은 체액 샘플의 용해성 단백질에서 EV를 적절하게 분리하는 데 불충분하다고 합니다19. 또한 진핵 세포외 소포체(EEV)의 크기 분포는 BEV의 크기 분포와 겹치는 경우가 많으므로 BEV 수율을 최적화하기 위해 추가적인 방법론적 개선이 필요합니다. 결과적으로 BEV 연구의 발전은 효과적인 분리 및 정제 방법론의 개발에 달려 있습니다. 특히, Tulkens et al15는 EEV에서 분변 BEV를 분리하기 위해 직교 생물물리학 전략을 사용했으며, 상향식 DGC 모드의 원심분리 시간은 최대 18시간이었습니다. 대조적으로, 이 연구는 이를 7시간으로 줄여 그래디언트-초원심분리 시간을 크게 절약하고 프로세스를 단순화했습니다.
본 연구에서는 저속에서 극도로 빠른 속도까지 다양한 차등 원심분리 속도로 BEV를 농축한 후 최적화된 완충 조건에서 두 가지 DGC 모드를 사용하는 분변 BEV를 분리하고 정제했습니다. 형태학, 입자 크기 및 농도를 기반으로 한 평가는 이 향상된 방법으로 칭찬할 만한 성능을 나타냈습니다. 이 연구는 향후 연구의 토대가 될 수 있으며, 더 넓은 영역으로 응용 분야를 확장하고 인체 내 BEV의 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 BEV 분리 및 분석 기술의 표준화에도 기여합니다.

<table><tbody><tr><td>1 % (w/v) 글루타르알데히드(탈이온수 내 2.5% 원액으로 제조)</td><td>ACMEC</td><td>AP1126</td><td>8.3.3단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰</td></tr><tr><td>1%(w/v) 메틸셀룰로오스(탈이온수 내 원래 분말로 준비)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>8.3.6단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰</td></tr><tr><td>1.5%(w/v) 우라닐 아세테이트(탈이온수 내 원래 분말로 준비)</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td>8.3.5 단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰</td></tr><tr><td>1000 &mu; L, 200 &뮤; L, 10 &뮤; L 피펫</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313, KG1212, KG1011</td><td>용액</td></tr><tr><td>5 % (w / v) 소 혈청 알부민 용액 (TBST 완충액의 원래 분말에서 준비)</td><td>Fdbio science</td><td>FD0030</td><td>8.5.6 단계 5 &times에서 차단을 위해 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>; 로딩 버퍼</td><td>Fdbio science</td><td>FD006</td><td>8.5.1 단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie 브릴리언트 블루 염색에 사용</td></tr><tr><td>75 % (v / v) 알코올</td><td>LIRCON</td><td>LIRCON-500 mL</td><td>표면 소독</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Rar</td><td>A8096</td><td>흡광도 값을 측정합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab92573</td><td>Western blotting (Primary 항체)</td></tr><tr><td>Anti-CD63 항체</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td>Western blotting (1차 항체)</td></tr><tr><td>Anti-CD9 항체</td><td>Abcam</td><td>ab236630</td><td>Western blotting (1차 항체)</td></tr><tr><td>Anti-Flagellin 항체</td><td>Sino Biological</td><td>40067-MM06</td><td>Western blotting (1차 항체)</td></tr><tr><td>Anti-Integrin beta 1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab30394</td><td>Western blotting (Primary Antibody)</td></tr><tr><td>Anti-LPS antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-83152</td><td>Western blotting (Primary Antibody)</td></tr><tr><td>Anti-LTA antibody</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>MA1-7402</td><td>웨스턴 블로팅 (1차 항체)</td></tr><tr><td>안티-옴피 항체</td><td>CUSABIO</td><td>CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/</td> <td>웨스턴 블로팅 (1차 항체)</td></tr><tr><td>안티 신테닌 항체</td><td>Abcam</td><td>ab133267</td><td>웨스턴 블로팅 (1차 항체)</td></tr><tr><td>Anti-TSG101 항체</td><td>Abcam</td><td>ab125011</td><td>웨스턴 블로팅 (1차 항체)</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>ZEALWAY</td><td>GR110DP</td><td>실험에 사용된 공급 및 매체에 대한 살균</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL104</td> PBS Bicinchoninic acid assay<td>로 샘플이 로드된 튜브의 균형을 맞추십시오</td></tr><tr><td>.</td><td>Fdbio 과학</td><td>FD2001</td><td>8.2 단계에서 BEV의 단백질 함량을 측정</td></tr>하십시오 BioRender https://app.biorender.com 그림 1 <tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>Haier</td><td>HR1200- II B2</td><td>Peform</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에서 보인 BEV 격리 및 정제의 개략도 작업 흐름을 대</td></tr>변 샘플 처리 <tr><td>원심 분리기 5810 R에 대한 절차를 확인하십시오. Rotor F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5805000092; 5804727002, 어댑터: 5804774000</td><td>BEV를 위한 전처리 (단계 3)</td></tr><tr><td>화학발광 장치</td><td>BIO-OI</td><td>OI600SE-MF</td><td>단계 8.5.12에서 신호 감지를 위한 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>F01</td><td>흡광도(단계 8.1) 및 형광(그림 6) 값을 측정하기 위한 마이크로플레이트 검출기&nbsp;</td></tr><tr><td>Dil-labled 저밀도 지단백질</td><td>ACMEC</td><td>AC12038</td><td>간섭 성분의 분포 정의&nbsp;</td></tr><tr><td>전기영동 장비</td><td>Bio-rad</td><td>1658033</td><td>8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 단계에서 단백질 분리 및 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>향상된 화학발광 키트 HRP&nbsp;</td><td>Fdbio 과학</td><td>FD8020</td><td>단계에서 신호 감지를 위한 웨스턴 블로팅에 사용됩니다</td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC8739</td><td>BEV를 양성 대조군으로 분리합니다. 프로토콜: LB 분말 25g을 1L 탈이온수에 녹이고 오토클레이브합니다. 800 &mu를 전송합니다. L은 배지에 보존 된 Escherichia coli를 사용합니다. 37 &deg에서 재배하십시오. C를 인큐베이터 셰이커에 넣습니다. 그 때 3, 000 &times에 분리기; g 4°C에서 20분 동안; C, 12, 000 &회; g 4°C에서 30분 동안; C, 0.22 &mu를 통해 상등액을 필터링합니다. M 막은, 160, 000 &times에 초고속 원심분리를 실행합니다; g 4°C에서 70분 동안 &C. 대장균의 조잡한 BEV로 정의된 펠렛을 1.2mL PBS에 현탁시켰습니다(3, 4단계). &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 튜브 50 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2811</td><td>BEVs (Step 3)</td></tr><tr><td>Feto 단백질 염색 버퍼</td><td>Absci</td><td>ab.001.50</td><td>Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Biosharp</td><td>BS-TFP-070B</td><td>Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon supported copper grids&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TEM-FCF200CU50</td><td>8.3단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰</td></tr><tr><td>Hepes 분말</td><td>Meilunbio</td><td>MB6078</td><td>밀도 구배 원심분리를 위한 다양한 농도의 요오딕산올 완충액 준비</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Fdbio science</td><td>FDM007</td><td>Western blotting (Secondary Antibody)</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Fdbio 과학</td><td>FDR007</td><td>웨스턴 블로팅 (보조 항체)</td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>Qiangwen</td><td>DHZ-L</td><td>배양 대장균&nbsp;</td></tr><tr><td>킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업 닦음</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>단계에서 초원심분리기 튜브의 내벽을 닦습니다. 4.15</td></tr><tr><td>LB 수프</td><td>Hopebio</td><td>HB0128</td><td>배양 대장균&nbsp;</td></tr><tr><td>저온 냉동고 (-80 &deg; C)</td><td>Haier</td><td>DW-86L338J</td><td>샘플 저장</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Alalddin</td><td>M116118</td><td>단계에서 PVDF 멤브레인을 활성화하기 위해 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>마이크로 튜브 1.5mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211</td><td>밀도 구배 원심분리 후 분획 회수</td></tr><tr><td>마이크로 튜브 2mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2911</td><td>밀도 구배 원심분리 후 분획 회수</td></tr><tr><td>Micro 튜브 5 mL</td><td>BBI</td><td>F610888-0001</td><td>밀도 구배 원심분리 후 분획 회수</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>Multiskan MK3</td><td>8.2 단계에서 BEV의 단백질 함량 측정</td></tr><tr><td>Millipore 필터 0.22 &mu; m</td><td>Merck 밀리포어</td><td>SLGP033RB</td><td>여과 살균; 재질 : 폴리 에테르 설폰, PES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GHTECH</td><td>1.01307.040</td><td>밀도 구배 원심 분리 용액</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>GHTECH</td><td>1.01394.068</td><td>밀도 구배 원심 분리 용액 (pH 조정)</td></tr> <tr><td>Optima &trade; XPN-100</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94469</td><td>4, 7단계에서 BEV 분리를 위한 초원심분리</td></tr><tr><td>OptiPrep&trade;</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>1893</td><td>밀도 구배 원심 분리 원액</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Youning</td><td>CS-100</td><td>2 단계에서 대변 용해</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Procell</td><td>PB180327</td><td>2 단계에서 대변 용해</td></tr><tr><td>피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267, 3120000259</td><td>용액 이송</td></tr><tr><td>플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>ABCbio</td><td>ABC217003-4</td><td>단계에서 전처리 시 상등액 제거 3.4</td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010, IPVH00010</td><td>8.5.5 단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>사전 제작된 폴리아크릴아미드 겔, 4&ndash; 20% 15 Wells</td><td>ACE</td><td>F15420Gel</td><td>8.5.2, 8.5.3단계에서 단백질 분리를 위한 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr> 1<tr><td>차 항체 희석제</td><td>Fdbio science</td><td>FD0040</td><td>8.5.8단계에서 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>단백질 사다리</td><td>Fdbio science</td><td>FD0672</td><td>8.5단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie brilliant blue stain에 사용</td></tr><tr><td>빠른 단백질 블로팅 용액</td><td>UBIO</td><td>UW0500</td><td>8.5.5단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용됨</td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>초원심분리는 Step 4, 7</td></tr><tr><td>Syringe 20 mL, 50 mL에서</td> BEVs 분리를 위한 것입니다.<td>Jetway</td><td>ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL</td><td>전송 버퍼는 TBS 분말을 사전 처리하면서 상층액을 제거합니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Fdbio science</td><td>FD1021</td>은 8.5단계 투과전자현미경 (TEM)<td>Hitachi에서 웨스턴 블로팅에 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>H-7650</td><td>8.3단계에서 BEV에 대한 형태학적 관찰</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fdbio 과학</td><td>FD0020</td><td>8.5단계에서 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td>326823, 355642</td><td>4, 7단계에서 BEV 격리를 위한 초원심분리</td></tr><tr><td>울트라클린 벤치</td><td>AIRTECH</td><td>SW-CJ-2FD</td> 액체 취급 수조 Bluepard<td>에 대한 절차 수행</td></tr><tr><td></td><td></td><td>CU600</td><td>8.2.5단계에서 BEV의 단백질 함량 측정에 사용됨</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>S/N 21-734, 소프트웨어 ZetaView(버전 8.05.14 SP7)</td> <td>8.4단계에서 BEV의 입자 크기 및 농도를 측정하기 위한 나노 입자 추적 분석(NTA)</td></tr></tbody></table>

density gradient centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아-박테리아 및 박테리아-숙주 통신에 적극적인 역할을 하는 박테리아에서 파생된 나노소포체로, 모체 박테리아에서 물려받은 단백질, 지질 및 핵산과 같은 생체 활성 분자를 전달합니다. 장내 미생물군에서 유래한 BEV는 위장관 내에서 영향을 미치고 멀리 떨어진 장기에 도달할 수 있어 생리학 및 병리학에 상당한 영향을 미칩니다. 인간의 대변에서 유래한 BEV의 유형, 수량 및 역할을 탐구하는 이론적 연구는 장내 미생물군에서 BEV의 분비와 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 조사는 또한 BEV를 분리하고 정제하기 위한 현재 전략의 개선을 필요로 합니다.
이 연구는 하향식(Top-down)과 상향식(Bottom-up)의 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 설정하여 BEV의 분리 및 정제 프로세스를 최적화했습니다. BEV의 농축 분포는 분획 6 내지 8(F6-F8)로 결정하였다. 접근법의 효과는 입자 형태, 크기, 농도 및 단백질 함량을 기반으로 평가되었습니다. 입자 및 단백질 회수율을 계산하고 특정 마커의 존재를 분석하여 두 DGC 모드의 회수율과 순도를 비교했습니다. 그 결과 하향식 원심분리 모드는 오염 수준이 낮고 상향식 모드와 유사한 회수율과 순도를 달성한 것으로 나타났습니다. 7시간의 원심분리 시간은 108/mg의 분변 BEV 농도를 달성하기에 충분했습니다.
대변 외에도 이 방법은 성분과 점도의 차이에 따라 적절하게 수정하여 다른 체액 유형에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 BEV의 표준화된 분리 및 정제를 용이하게 하여 후속 다중 오믹스 분석 및 기능 실험을 위한 토대를 마련할 것입니다.

BEV 농축 분획의 분포 결정 박테리아 세포외 소포체(BEV)-농축 분획물의 분포를 결정하기 위해, OD 340nm에서 흡광도 값을 측정하기 위해 블랭크 대조군을 설정하고, 측정 및 요오드화놀 가이드라인을 기반으로 각 분획의 밀도를 계산하였다(단계 8.1). 표 2 는 밀도 결과를 제시하며, 분획 F4 내지 F9가 전형적으로 세포외 소포체와 관련된 범위 내에서 밀도를 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 대부분의 BEV가 이러한 분획에서 분리되어 F4-F9를 BEV의 대략적인 범위로 정의했음을 시사합니다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 그림 1 에서 분획 F4-F9로 표시된 것처럼 분리된 분변 BEV의 형태학적 특징을 특성화했습니다. TEM 이미지(그림 2)는 BEV의 특징인 고전적인 컵 모양의 구조의 존재를 보여주었습니다. 나노 입자 추적 분석(N...

이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host ...

우리의 연구는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 물리학자로부터 박테리아 세포외 소포체를 분리, 정제 및 특성화합니다. 우리는 오염 물질에서 BEV를 분리하고 연구원에게 신뢰할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 당사의 프로토콜은 원심분리 시간을 18시간에서 7시간으로 단축합니다.탑다운 모드는 BEV 분리를 개선하고 간 단백질의 오염을 줄입니다. 당사의 방법은 BEV의 분리를 단순화하여 향후 연구의 표준을 설정합니다. 적절한 변형을 통해 다른 체액에 적용할 수 있어 이해를 높이고 인체 내에 고유한 이질성을 드러내는 BEV 연구를 촉진할 수 있습니다.

isolation-purification-bacterial-extracellular-vesicles-from-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

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배우세요 인간 대변에서 밀도 구심 분리법을 사용하여 박테리아 세포외 소포를 분리하고 정제하는 방법. 이 프로토콜은 원심분리 시간을 단축하고 오염물질로부터의 분리 효율을 높여 BEV 연구에 신뢰할 수 있는 표준을 제공합니다.

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

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