Name: 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 면역조직화학 및 디지털 이미지 분석을 활용한 자궁내막 면역세포 정량적 검출 플랫폼을 사용하는 방법을. 이 연구는 반복유산 환자의 면역학적 요인 분석과 생식 실패 원인 규명에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자들은 이 연구에 동의하고 샘플을 기증한 모든 여성들에게 감사한다.

연구 내용과 프로토콜은 Shenzhen Zhongshan Urology Hospital의 연구 윤리 위원회에서 윤리적으로 검토하고 승인했습니다. 연구에 참여한 모든 여성(20-40세)은 샘플 수집 및 사용에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 병리조직의 획득
<ol><li>조직 채취를 위한 도구, 즉 측정 자, 핀셋, 임베딩 카세트, 임베딩 용지 및 티슈 바구니를 준비합니다.</li>
	<li>피펠 카테터와 함께 표준 접근법을 사용하여 수집된 자궁내막 조직(녹두보다 큼)의 양이 충분한지 관찰합니다.</li>
	<li>포르말린에서 자궁내막 조직을 핀셋으로 임베딩 페이퍼에 옮기고 자로 자궁내막 조직 치수를 측정합니다.</li>
	<li>자궁내막 조직을 임베딩 페이퍼로 감싸고 임베딩 카세트에 넣습니다.</li>
	<li>탈수를 위해 임베딩 카세트를 티슈 바스켓에 넣습니다.</li>
</ol>2. 조직 탈수
<ol><li>티슈 바스켓을 탈수기의 반응 챔버에 넣고 ( 재료 표 참조) 일상적인 조직 탈수 절차를 시작합니다 : 포르말린 100 분; 100분 동안 포르말린; 60분 동안 75% 알코올; 60분 동안 85% 알코올; 60분 동안 95% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 35분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 80 분 동안 왁스; 80 분 동안 왁스; 80분 동안 왁스를 바릅니다. 이 과정은 약 15 시간이 걸립니다.</li>
	<li>조직 탈수 절차가 끝나면 탈수기의 반응 챔버를 열고 티슈 바스켓을 제거합니다.</li>
</ol>3. 조직 임베딩
<ol><li>시편의 크기에 따라 적절한 매립 금형을 꺼내 70°C에서 파라핀 왁스를 채운다.</li>
	<li>티슈를 몰드에 빠르게 넣고 티슈가 몰드 중앙에 오도록 조심스럽게 조정합니다.</li>
	<li>금형을 냉각판으로 부드럽게 옮기고 바닥의 파라핀이 굳는 동안 티슈를 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>몰드 위에 임베딩 카세트를 놓고 왁스를 더 얹습니다.</li>
	<li>냉각판에 금형을 놓고 파라핀이 완전히 응고되면 부착된 카세트가 있는 블록을 금형에서 제거합니다.</li>
</ol>4. 조직 단면
<ol><li>마이크로톰의 샘플 클립에 블록을 삽입하고 블레이드를 홀더에 놓고 블록 평면과 블레이드 사이의 각도를 조정하고 단면의 두께를 4μm로 조정하고 핸드 휠을 돌리고 슬라이싱을 시작합니다.</li>
	<li>블록에서 몇 개의 얇은 부분을 잘라 적절한 조직 표면을 노출시킵니다. 브러시로 연속적이고 완전한 섹션을 꺼냅니다.</li>
	<li>단면이 충분히 절단되면 핸드 휠을 돌리는 것을 멈추고 핀셋으로 앞쪽 끝의 부적격 단면을 제거하고 핀셋과 브러시로 수조의 42°C 물 표면에 단면을 띄웁니다.</li>
	<li>섹션이 완전히 평평해지면 분리 방지 슬라이드에서 섹션을 선택하고 65°C의 슬라이드 워머로 옮겨 60분 동안 굽습니다.</li>
	<li>베이킹이 끝나면 슬라이드 워머에서 유리 슬라이드를 꺼냅니다.</li>
</ol>5. 면역조직화학적 염색
<ol><li>1차 항체를 항체 희석제가 있는 작업 용액에 희석합니다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>희석된 항체 용액을 특수 시약 병에 넣고 검출 키트를 자동 IHC 염색기의 시약 구획에 넣습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>특수 커버타일로 덮인 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 기기의 실험 반응 구획에 삽입합니다.</li>
	<li>기기가 슬라이드의 시약 및 실험 정보를 자동으로 인식한 후 시작 버튼을 클릭하여 면역조직화학적 염색을 시작합니다. 실험은 약 3시간 동안 지속됩니다.</li>
</ol>6. 활주의 탈수함 그리고 바다표범 어업
<ol><li>면역조직화학적 염색 후 슬라이드 홀더를 꺼내고 특수 커버타일을 제거하고 염색된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 슬라이드에 남아 있는 염료를 깨끗한 물로 씻어냅니다.</li>
	<li>슬라이드 홀더를 자동 커버슬리퍼( 재료 표 참조)로 옮기고 탈수 및 밀봉 절차를 선택하고 실행합니다.</li>
	<li>탈수 및 밀봉 후 슬라이드를 꺼냅니다.</li>
</ol>7. 슬라이드 스캔
<ol><li>슬라이드를 파노라마 병리학적 이미지 스캐너의 슬라이드 랙에 놓고( 재료 표 참조) 파노라마 병리학적 이미지 스캔을 위해 기기 슬라이드 스캔 구획에 놓습니다. 스캔하는 데 2분이 걸립니다. 그림 1을 참조하십시오.</li>
</ol>8. 이미지 분석
<ol><li>이미지 가져오기<ol><li>병리학적 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 새 폴더를 만듭니다. 분석할 면역조직화학적 이미지를 가져옵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 분류기 구축<ol><li>여러 조직과 빈 주석을 표시하여 조직과 빈 영역을 각각 식별하기 위한 분류기를 훈련하고 설정합니다.</li>
		<li>실시간 튜닝을 사용하여 마크 주석을 추가하는 동안 소프트웨어의 인식 용량을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 인식이 적시에 이루어지지 않으면 주석을 달고 조직 인식이 정확해질 때까지 다시 훈련하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 알고리즘 구축<ol><li>실험 유형에 따라 소프트웨어에서 표준 알고리즘을 선택하십시오 : 멀티플렉스 IHC.</li>
		<li>셀 인식의 색상 매개변수는 일반적인 음수 및 양수 픽셀을 선택하여 설정합니다. 이를 기반으로 핵, 세포질, 세포막의 파라미터를 설정하고, 이미지에 가장 적합한 파라미터를 찾을 때까지 실시간으로 세포 인식 상황을 관찰합니다.</li>
		<li>양성 세포 인식 임계값을 설정하고 적절한 임계값이 조정될 때까지 실시간으로 인식 상황을 관찰합니다.</li>
		<li>알고리즘에서 조직 분류기를 선택하고 조직 분류기에서 조직 부분을 확인하여 조직을 기반으로 세포를 식별합니다. 이 시점에서 분석 알고리즘 설정이 완료됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 분석 실행<ol><li>분석 영역을 선택합니다. 설정된 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소프트웨어 분석이 완료되면 조직 인식, 음성 및 양성 세포 인식을 포함하여 이미지 인식이 정확한지 수동으로 확인합니다.</li>
	<li>이미지 인식이 정확하지 않으면 알고리즘과 파라미터 임계값을 다시 조정하고 성공할 때까지 이미지 분석을 다시 실행합니다. 분석 결과를 내보냅니다. 그림 1을 참조하십시오.</li>
	<li>위의 단계에 따라 다른 면역 세포도 분석할 수 있습니다(그림 1 참조). 다양한 자궁내막 면역 마커(CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포25,26)의 실제 발현에 따라 다양한 분석 파라미터를 설정합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 계산을 통해 자궁내막 면역 세포의 비율을 얻습니다( 표 2 참조). 이를 사용하여 재발성 유산 환자의 자궁내막에 있는 다양한 면역 세포의 수준을 평가합니다.</li>
</ol>

면역조직화학적으로 염색된 자궁내막 조직의 이미지 분석

<ol><li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss%3A+a+committee+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li>
<li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98(2020).</li>
<li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3%2C+CD4%2C+CD8%2C+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li>
<li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetrics%2C+Gynecology%2C+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li>
<li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+percentage+of+CD3%28%2B%29T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li>
<li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li>
<li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li>
<li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106(2017).</li>
<li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li>
<li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+CD56%2B+natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage%3A+a+histomorphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure%3A+establishment+of+a+reference+range%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li>
<li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li>
<li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li>
<li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells%3B+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105(2020).</li>
<li>Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li>
<li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317(2019).</li>
<li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715(2021).</li>
<li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains%3A+a+multi-centre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologic%22%5BJournal%5D)">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+%28ARTAG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li>
<li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+specimens%3A+analytical+performance+measuring+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li>
<li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li>
<li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li>
<li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+endometrial+immune+cell-based+score+%28EI-score%29+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF%2FICSI%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li>
<li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li>
<li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communication+%28London%2CEngland%29%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li>
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<li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li>
<li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984(2017).</li>
<li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418(2017).</li>
</ol>

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이 프로토콜은 RM 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축했습니다. 여기에서 RM 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 6개의 자궁내막 면역 마커를 검출했습니다.
황체 중기의 수용성 자궁내막은 성공적인 착상과 임신의 핵심이다27,28. 따라서 자궁내막 면역세포의 비율은 자궁내막 수용성을 추정하는 데 중요한 역할을 합니다. 자궁내막 면역 세포 분석은 기존의 병리학적 방법으로 예측하기 때문에 임상 적용에 도움이 되지 않습니다. 현재 면역 세포 비율을 측정하기 위한 표준화된 방법이 없어 임신 중 면역 세포 비율의 역할을 이해하는 데 장벽이 되고 있습니다. 기존의 IHC 분석은 선택된 시야와 수동 카운팅을 기반으로 합니다. 면역 세포의 정확한 조직 분할 및 국소화는 수동 분석이 주관적이기 때문에 기존 IHC로 평가할 ...

재발성 유산(RM)은 두 번 이상의 연속적인 임신을 상실하는 것으로, 최근 몇 년 동안 임상의들의 관심을 끌고 있는 복잡한 질병입니다. 가임기 여성의 RM 발생률은 1%-5%입니다 1. 이전 연구의 결과는 면역 요인이 RM 2,3,4,5의 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 모체-태아 계면에서 면역 항상성을 유지하는 것은 배아 착상과 발달에 필요합니다. 자궁내막 면역세포는 영양세포 침범 촉진, 나선형 동맥 개조, 태반 발달에 기여하는 등 이러한 항상성을 유지하기 위해 여러 가지 조절 역할을 수행합니다 6,7,8,9.
RM이 있는 여성의 비정상적인 자궁내막 면역 세포는 이전에 보고된 바 있습니다. 결과는 자궁 자연 살해 세포(uNK)의 고밀도와 RM10,11,12의 발생 사이에 밀접한 연관성이 있음을 보여줍니다. RM을 가진 여성의 자궁내막에서 대식세포의 수가 증가한 것으로 보고되었는데, 이는 출산을 한 여성에 비해 증가한 수치이다13. 조절 T 세포(Treg)는 배아에 대한 모계의 면역 관용에 중요한 역할을 하며, RM 환자의 데시두아에서 그 수준과 기능이 감소한다14. 세포독성 T 세포(CTL)와 수지상 세포(DC)도 임신의 면역 조절에 중요한 역할을 합니다15,16. 따라서 황체 중기 동안 국소 자궁내막 면역 세포에 대한 포괄적인 정량 분석은 RM의 발병 기전을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 분석을 위한 일부 현재 방법은 여러 마커를 가진 면역 세포를 정확하게 표지할 수 있는 유세포 분석을 사용합니다17,18. 그러나 유세포 분석의 임상적 적용은 신선한 조직에서만 수행할 수 있기 때문에 제한적입니다. 신선한 조직을 얻는 것은 자궁내막에서 드물게 발생하는 많은 양의 과도한 종양을 사용할 수 있을 때만 가능합니다. 면역조직화학은 조직 형태를 현장에서 잘 관찰할 수 있고 다양한 면역 세포를 표지할 수 있는 반면, 기존의 면역조직화학 기법은 면역 세포의 정량 분석을 수행할 수 없습니다.
기존의 면역조직화학 실험과 비교했을 때, 자궁내막의 면역세포에 대한 정량적 면역조직화학적 분석은 임상적으로 중요한 의미를 지닙니다. IHC 강도 점수는 일반적으로 병리학적 진단 및 연구에서 4점 척도 또는 강하고 약한 것으로 평가됩니다 19,20,21. 그러나 이 반정량적 기법은 주관적이고, 매우 부정확하며, 관찰자 내 및 관찰자 간 변동성이 크다22. 한 가지 가능한 해결책은 기계 학습의 적용이며, 이는 디지털 이미지 분석에서 가치 있는 것입니다23,24. 정량적 측정을 제공함으로써 이 접근법은 자궁 조직 내 면역 세포 침투, 분포 및 밀도를 보다 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 정량적 정보는 월경 주기 및 다양한 병리학적 조건에서 면역 세포 집단의 동적 변화를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 면역조직화학을 통해 자궁내막의 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 능력은 자궁의 면역 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
따라서 이 프로토콜은 RM 환자의 황체 중기 동안 uNK 세포, Tregs, 대식세포, DC 및 세포독성 T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 이미지 분석 플랫폼을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다.

<table><tbody><tr><td>자동 커버슬리퍼</td><td>사쿠라우스</td><td>DRS-Prisma-P-JCS& Film-JC2</td><td></td></tr><tr><td>CD163</td><td>GrowGn 생명공학</td><td>NCL-L-CD163</td><td></td></tr><tr><td>CD1a</td><td>유전자 기술</td><td>GM357129</td><td></td></tr><tr><td>CD56</td><td>유전자 기술</td><td>GT200529</td><td></td></tr><tr><td>CD8</td><td>Novocastra</td><td>NCL-L-CD8-4B11</td><td></td></tr><tr><td>탈수기</td><td>Thermo Fisher</td><td>Excelsior ES</td><td></td></tr><tr><td>디지털 병리학 및</td><td>인디카 실험실</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>YILIFANG 생물학</td><td>14-477-82</td><td></td></tr><tr><td>IHC 염색기</td><td>Leica</td><td>BOND III</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 플랫폼</td><td>인디카 연구소</td><td>HALO</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>올림푸스 생명 과학</td><td>VS200</td><td></td></tr></tbody></table>

면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(digital image analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 황체 중기 동안 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발 및 검증했습니다. 모든 자궁내막 샘플은 월경 주기의 황체 중기에 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 절단하고, CD56+ uNK 세포, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔했으며 정량 분석을 위해 상용 이미지 분석 시스템을 사용했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율은 전체 자궁내막세포의 면역세포 수를 나누어 계산하였다. 상용 영상 분석 시스템을 이용하면 기존의 영상 분석으로는 분석이 어렵거나 불가능했던 자궁내막 면역세포의 정량 평가를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 방법론은 면역 세포 간의 상호 작용과 다양한 생식 부전 환자에 대한 이질성을 포함하여 자궁 내막 미세 환경을 정량적으로 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 플랫폼은 RM 환자의 진단 및 치료에 중요한 임상적 중요성을 가질 수 있습니다.

자궁내막 면역세포를 정량적으로 평가하고 인위적인 조작 실수로 인한 불안정성을 줄이기 위해 자동 면역조직화학적 검출 및 디지털 정량 평가 시스템을 사용하여 자궁내막 면역세포에 대한 디지털 정량 분석 플랫폼을 구축했습니다. 이식 기간 동안 재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위해 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축하였습니다. 모든 자궁내막 조직은 생리 주기의 황체 중기 동안 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 분할하고, CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD163+M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 IHC 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔하고 디지털 이미지 분석 시스템을 사용하여 정량 분석을 수행했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율을 계산하기 위해서는...

여기에서 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발하여 착상 기간 동안 유산이 재발한 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있도록 검증했습니다.

면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

현재로서는 특정 범위 내에서 분석을 안정화하는 것이 어렵습니다. 실험의 품질 관리를 유지하는 것도 어렵습니다. 우리의 연구는 면역력에서 비정상적인 자궁내막 민감도를 가진 환자가 생식 부전의 원인을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.자궁내막에서 면역세포의 국소적 비율을 안정적이고 반복적으로 검출할 수 있습니다. 우리의 발견은 반복적인 착상 실패 환자에 대한 자궁내막 민감도 평가의 연구 진행을 촉진할 수 있습니다.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.

재발성 유산에 있는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 멀티플렉스 형광 면역히스토화학 염색

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

이 연구는 고급 다중 형광 면역조직화학 염색 기술을 사용하여 착상 기간 동안 자궁 자연 살해 세포 하위 집합을 정량화하는 선구적인 방법을 제시합니다.

반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

이 프로토콜은 조직 또는 종양에서 ECM 단백질을 농축하고 ECM이 풍부한 제제를 펩타이드로 탈당화 및 분해하여 질량 분석법으로 단백질 구성을 분석하는 절차를 설명합니다.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

이 원고는 살아있는 세포에서 직접 형광 표지된 나노 입자의 세포내이입 후 세포 내 유전자 발현을 검출할 수 있는 새로운 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포의 조작을 필요로 하지 않으며 표적 유전자 또는 종에 대해 제한되지 않습니다.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

배우세요 면역조직화학 및 디지털 이미지 분석을 활용한 자궁내막 면역세포 정량적 검출 플랫폼을 사용하는 방법을. 이 연구는 반복유산 환자의 면역학적 요인 분석과 생식 실패 원인 규명에 중요한 통찰을 제공합니다.

면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼

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