Name: EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 배우세요 뇌 손상 환자의 응고 장애를 세포외 소포(EV) 활성화 응고 시간(EV-ACT)으로 측정하는 방법을. 차등 원심분리와 재칼슘화를 통해 EV 풍부한 혈장을 준비하고 응고 기능을 신속하게 평가할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81930031, 81901525)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 기계 및 기술 지침을 제공해 주신 Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.에 감사드립니다.

인체 검체 채취는 천진 의과대학 종합병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 인간 정맥혈 채취는 중국 국가위생건강위원회에서 발행한 지침, 즉 WS/T 661-2020 정맥혈 표본 채취 지침을 엄격히 따랐습니다. 간단히 말해서, 전방 상완 부위 정맥에서 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액을 수집하고, 샘플을 3.2% 구연산나트륨 항응고제를 1:9의 비율로 혼합했습니다. 구연산나트륨 항응고제 검체만 채취했을 때, 첫 번째 채취 용기는 폐기되었습니다. 처리 흐름은 샘플 수집 후 0.5시간 이내에 시작되었습니다. 건강한 성인 피험자는 정보에 입각한 동의를 얻은 후 샘플 수집을 위해 모집되었습니다. 환자 제외 기준은 (1) 최근 혈관 내 혈전증, (2) 간 및 신장 기능 장애, (3) 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 및 기타 만성 질환, (4) 아스피린 또는 항응고제 치료, (5) 월경 및 임신이었습니다.
1. EV가 풍부한 플라즈마의 분리
<ol><li>샘플을 실온에서 120 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈액 세포를 제거합니다. 상청액은 혈소판이 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 피펫이 있는 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혈소판이 풍부한 혈장을 실온에서 1500 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈소판을 제거합니다. 상청액은 혈소판이 부족한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혈소판이 부족한 혈장을 실온에서 13000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액은 EV가 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 후속 테스트를 위해 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
</ol>2. 분석기에 의한 시료의 EV-ACT 검출
<ol><li>응고 분석기( 재료 표 참조)를 켜고 기기를 37°C로 예열합니다. 일회용 프로브와 테스트 컵을 설치한 다음 기계의 품질 관리 절차를 시작합니다. 알림: 화면에 점성 저항 신호 값이 직선으로 표시되면 감지가 방해받지 않고 분석기 상태의 품질 관리가 자격이 있음을 의미합니다. 자체 테스트가 검증된 후 테스트 절차를 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>시스템에 샘플 정보를 입력합니다. 그런 다음 200μL의 EV가 풍부한 혈장을 테스트 컵으로 옮긴 다음 20mM 170μL의 염화칼슘을 옮깁니다. 시작 버튼을 클릭합니다. 테스트 컵의 자석 교반 막대는 샘플과 염화칼슘을 완전히 혼합합니다. 덮개를 닫으면 프로브가 샘플 저항의 변화를 감지하기 시작합니다. 알림: 테스트가 완료되면 분석기에서 자동으로 "테스트 완료"라는 메시지를 표시합니다. EV-ACT 시간이 시스템에 의해 표시되고 기록됩니다. 결과는 시간 단위 "초"로 표현됩니다. 프로브를 버리고 컵을 테스트하십시오.</li>
</ol>3. EV가 풍부한 혈장 샘플의 유세포 분석 기반 품질 관리
<ol><li>EV는 먼저 크기(0.1-1μm)로 식별되었습니다. 유세포 분석기의 파라미터를 미리 조정하고 시판되는 폴리스티렌 비드(0.5, 0.9 및 3.0μm)를 사용하여 EV의 "게이트"를 설정합니다( 재료 표 참조). 참고: 비드 혼합물은 미세소포(0.5 및 0.9μm)와 혈소판(0.9μm 및 3μm)의 크기 범위를 포괄하는 다양한 직경의 형광 구체로 구성됩니다.</li>
	<li>전방 산란과 측면 산란의 전압을 조정하고 0.9μm 마이크로스피어가 적절한 영역에 속하는지 확인합니다. EV 영역은 마이크로스피어의 직경에 따라 그릴 수 있습니다.</li>
	<li>50μL의 EV가 풍부한 혈장을 플로우 튜브로 옮긴 다음 450μL의 여과된 인산염 완충 식염수를 전달합니다. 플로우 튜브에 액체를 완전히 혼합하십시오. 마지막으로, 유세포 분석(25)을 이용하여 샘플들을 검출한다.</li>
	<li>Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 재료 표 참조)를 사용하여 브리프의 EVs.In 수를 정량화하고, 유동 검출 전에 샘플에 10μL의 입자를 추가하고, 샘플 검출이 완료된 후 10,120 * EV (#) / (마이크로비즈 * 부피) * 희석 계수26 공식을 사용하여 EV 농도를 계산합니다.</li>
</ol>

EV-Rich Plasma의 혈액 과응고 평가

<ol><li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury%3A+systemic+manifestation+of+a+localized+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li>
<li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothrombotic+state+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Prothrombotic state associated with preeclampsia.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).</li>
<li>Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+thrombosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).</li>
<li>You, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypercoagulability+with+thrombelastography+in+patients+with+hip+fracture+receiving+thromboprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis.</a> Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Zang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-derived+microparticles+as+novel+biomarkers+for+the+diagnosis+of+deep+venous+thrombosis+in+trauma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V%28-%29+and+tissue+factor%28%2B%29+microparticles+as+biomarkers+for+predicting+deep+vein+thrombosis+in+patients+after+joint+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty.</a> Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).</li>
<li>Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles+in+the+pathogenesis+and+early+anticoagulation+of+thrombosis+in+COVID-19+with+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).</li>
<li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).</li>
<li>Cointe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+microparticle+enumeration+across+different+flow+cytometry+platforms%3A+results+of+a+multicenter+collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).</li>
<li>Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+and+platelet-derived+microvesicle+absolute+counts+determined+by+flow+cytometry+correlates+with+a+measurement+of+their+functional+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).</li>
<li>Mooberry, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+microparticles+promote+coagulation+in+a+factor+XI-dependent+manner+in+human+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+microparticles+and+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).</li>
<li>Bolliger, D., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+coagulation+testing+in+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).</li>
<li>Ganter, M. T., Hofer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+monitoring%3A+current+techniques+and+clinical+use+of+viscoelastic+point-of-care+coagulation+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices.</a> Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).</li>
<li>Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+assessment+of+the+anticoagulant+activity+of+direct+oral+anticoagulants%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review.</a> Chest. 151 (1), 127-138 (2017).</li>
<li>Maier, C. L., Sniecinski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulation+monitoring+for+perioperative+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anticoagulation monitoring for perioperative physicians.</a> Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).</li>
<li>Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+in+vivo+evaluation+of+hemostasis%3A+Spatial+thrombodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics.</a> Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).</li>
<li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+coagulation+activity+in+hip+fracture+patients%3A+A+case-control+study+using+rotational+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).</li>
<li>Premkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19-related+dynamic+coagulation+disturbances+and+anticoagulation+strategies+using+conventional+D-dimer+and+point-of-care+Sonoclot+tests%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study.</a> BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).</li>
<li>Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+thromboelastography+and+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Anestesiologica%22%5BJournal%5D)">Comparison between thromboelastography and thromboelastometry.</a> Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16F+mediated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release+on+erythrocyte+contribute+to+hypercoagulable+state+in+hyperuricemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperuricemia+enhances+procoagulant+activity+of+vascular+endothelial+cells+through+TMEM16F+regulated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release.</a> The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPs-ACT%2C+an+assay+to+evaluate+the+procoagulant+activity+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+extracellular+vesicles+induce+vasoconstriction+and+reduce+cerebral+blood+flow+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice.</a> Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microvesicles+levels+and+effects+of+associated+factors+in+elderly+patients+with+obstructive+sleep+apnea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung disease.</a> Chest. 153 (1), 210-216 (2018).</li>
<li>Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Hypertension+Reports%22%5BJournal%5D)">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).</li>
<li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications%3B+emphasis+on+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861(2019).</li>
<li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li>
<li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+endothelial+locus-1+%28Del-1%29+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li>
<li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li>
<li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+removal+by+single-step+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability%3A+a+clinical+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis%2C+treatment%2C+and+prognosis+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).</li>
<li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714(2023).</li>
<li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li>
</ol>

모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

이 연구에서는 EV가 풍부한 혈장의 제조를 설명하고 유세포 분석을 사용하여 방법의 합리성을 검증했습니다. 이어서, 재석회화된 혈장 샘플은 점탄성 원리24에 기초한 응고 분석기를 사용하여 ACT 시간 동안 분석하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 초원심분리를 통해 얻은 EV의 농도는 EV-ACT 시간을 단축하는 것으로 나타났으며, EV 수준을 감소시킨 초원심분리 후 상층액은 EV-ACT 시간이 연장되는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 EV-ACT 결과와 EV 수준 사이에 밀접한 관계가 있음을 시사합니다. 그림 3B에서는 자간전증, 고관절 골절 및 폐암 환자의 혈장 샘플의 EV-ACT를 건강한 지원자와 비교하여 질병 그룹에서 EV-ACT 시간이 상당히 짧다는 것을 보여주었습니다. 이전 보고에 따르면 이러한 질병에 대한 혈장 내 응고 촉진 EV 수치가 상승했습니다 27,28,29.<...

혈액 응고 과잉에 의해 발생하는 혈전증은 뇌 외상(brain trauma)1, 자간전증(pre-eclampsia)2, 종양(tumors)3, 골절 환자(fracture patients)4 등 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 과응고성의 기전은 복잡하며, 최근에는 응고 장애에서 세포외 소포체(EV)의 역할이 강조되고 있습니다. EV는 직경이 10nm에서 1000nm에 이르는 세포막에서 분리되는 이중층 구조를 가진 소포 모양의 몸체입니다. 이는 다양한 질병 과정, 특히 응고 장애와 관련이 있다5. 여러 연구에서 EV가 혈전증 위험의 유망한 예측 인자로 확인되었습니다 6,7. EV의 응고 활성은 응고 인자, 주로 조직 인자(TF)와 포스파티딜세린(PS)의 발현에 따라 달라집니다. 강력한 프로응고제 활성을 가진 EV는 테나아제와 프로트롬빈 복합체의 촉매 효율을 크게 향상시켜 트롬빈 매개 피브리노겐과 국소 혈전증을 촉진한다8. EV의 높은 수준과 과응고성과의 인과 관계는 수많은 질병에서 관찰되었다9. 결과적으로, EV의 검출을 표준화하고 그들의 응고제 활성을 보고하는 것은 중요한 조사 영역이다10.
현재까지 EV의 응고 활성을 감지하는 데 사용할 수 있는 상용 키트는 소수에 불과합니다. 상업 회사에서 생산한 MP-활성 분석 및 MP-TF 분석은 혈장11에서 EV의 응고제 활성을 측정하는 데 사용되는 기능 분석입니다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 분석과 유사한 원리를 사용하여 EV에서 PS 및 TF를 검출합니다. 그러나 이러한 키트는 비싸고 소수의 고급 연구 기관으로 제한됩니다. 이 프로세스는 복잡하고 시간이 많이 걸리기 때문에 임상 환경에서 구현하기가 어렵습니다. 또한, 상업적으로 개발된 프로코아응고제 인지질(PPL) 분석은 PS-free 혈장과 테스트 혈장을 혼합하여 응고 시간을 측정하여 PS 양성 EV의 수준을 정량적으로 검출한다12. 그러나 이러한 분석은 주로 EV의 PS 및 TF에 초점을 맞추고 순환 EV가12에 관여할 수 있는 다른 응고 경로를 간과합니다.
혈장 응고 시스템은 복잡하며 응고제, 항응고제, 섬유소 용해 시스템 및 혈장에 부유하는 EV를 포함하여 "보이지 않는" 구성 요소와 "보이는" 구성 요소로 구성됩니다. 생리학적으로 이러한 구성 요소는 동적 균형을 유지합니다. 병리학적 상태에서, 순환 중인 EV의 현저한 증가는 특히 뇌 외상, 자간전증, 골절 및 다양한 유형의 암 환자에서 과응고에 기여한다13. 현재 임상 실험실에서 응고 상태를 평가하는 것은 주로 응고 시스템, 항응고 시스템 및 섬유소 용해를 평가하는 것을 포함합니다 14,15,16,17. 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간 및 국제 정규화 비율은 일반적으로 응고 시스템18에서 응고 인자 수준을 평가하는 데 사용된다. 그러나 최근 연구에 따르면 이러한 검사는 특정 질병의 과응고 가능성을 완전히 반영하지 못한다19. 혈전 탄성 측정법(TEG), 회전 TEG 및 소노클로트 분석과 같은 다른 분석 방법은 전혈 점탄성 변화를 측정합니다20,21. 전혈 샘플에는 수많은 혈액 세포와 혈소판이 포함되어 있기 때문에 이러한 검사는 샘플 전체의 응고 상태를 나타낼 가능성이 더 큽니다. 일부 연구자들은 혈액 세포와 혈소판이 응고제 활성에서 차지하는 역할에 대해 보고했습니다 22,23. 최근 연구에서는 이전의 응고 기능 검사가 미세입자의 응고 활성의 변화를 감지하는 데 어려움을 겪는다는 사실도 발견했다24. 따라서 EV가 풍부한 혈장에서 활성화된 응고 시간(ACT)의 점탄성 측정으로 EV의 응고 기능을 평가할 수 있다는 가설이 제안되었습니다.

<table><tbody><tr><td>AccuCount 울트라 레인보우 형광 입자</td><td>3.8 미크론; Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td><td></td> MP 염화칼슘 Werfen (china)<td>의 정량적 검출을 위해</td></tr><tr><td></td><td></td><td>0020006800</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>Century Clot analyzer</td><td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td><td></td><td>원리는 점탄성 방법으로 플라즈마 점도를 측정하는 것입니다</td></tr><tr><td>일회용 프로브 및 테스트 컵</td><td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa 유세포 분석기</td><td>BD, 미국</td><td></td> MP Megamix 폴리스티렌 비드를 <td>검출하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Biocytex, Marseille, France</td><td>7801</td><td>Megamix는 선택된 직경의 마이크로비드 혼합물로 구성됩니다: 0.5 &마이크로; m, 0.9 &마이크로; m 및 3 &m.</td></tr></tbody></table>

ev-act(activated clotting time)를 사용한 세포외 소포(ev)의 응고 활성 측정

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

다양한 질병에서 세포외 소포체(EV)의 역할은 특히 강력한 응고 활성으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나 임상 환경에서 EV의 응고 활성을 평가하기 위한 병상 검사가 시급히 필요합니다. 이 연구는 EV의 응고제 활성의 척도로 EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간을 사용할 것을 제안합니다. 나트륨 구연산 전혈을 얻기 위해 표준화된 절차를 사용한 후 EV가 풍부한 혈장을 얻기 위해 차등 원심분리를 수행했습니다. EV가 풍부한 플라즈마와 염화칼슘을 테스트 컵에 첨가하고 분석기를 사용하여 점탄성의 변화를 실시간으로 모니터링했습니다. EV-ACT라고 하는 EV가 풍부한 혈장의 자연 응고 시간을 측정했습니다. 그 결과, 건강한 지원자로부터 얻은 혈장에서 EV를 제거했을 때 EV-ACT가 크게 증가한 반면, EV가 농축되었을 때 EV-ACT가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암의 인간 샘플에서 EV-ACT가 상당히 단축되어 혈장 EV 수치가 상승하고 혈액 과응고가 촉진되었음을 나타냅니다. 간단하고 빠른 시술을 통해 EV-ACT는 혈장 EV 수치가 높은 환자의 응고 기능을 평가하기 위한 병상 검사로서 가능성을 보여줍니다.

EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간은 혈장 응고 시간 측정을 위해 점탄성 방법 분석기를 사용하여 측정하였다. 이 기계는 전자 신호 변환기, 프로브, 감지 탱크 및 발열체의 네 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다(그림 1A,B). 프로브는 고주파 및 저진폭 진동을 활용하여 플라즈마 점도의 변화를 감지합니다. 일상적인 품질 관리에는 주로 테스트 플랫폼의 안정성을 평가하고 프로브에 대한 물리적 장애를 식별하기 위한 공기 품질 관리가 포함됩니다. 성능 품질 관리에는 프로브에서 감지한 저항 값이 설정 범위 내에 있는지 확인하기 위해 표준 점도 오일로 테스트하는 작업이 포함됩니다.
EV가 풍부한 혈장을 얻은 후 시료 품질 관리를 위해 유세포 분석을 사용하여 EV를 측정했습니다. 비정규화 샘플은 EV의 "게이트" 근처에서 입자 크기가 약간 더 큰 뚜렷한 클러스터를 나타냅니다(<strong class="xf...

이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.

EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

우리의 주요 초점은 뇌 외상을 입은 환자의 응고 장애에 있습니다. 이 연구에서는 세포외 방광 활동 응고 시간에 따른 응고 기능의 변화를 모니터링하려고 합니다. 우리 팀은 뇌 손상 연구에 주목합니다.그리고 뇌 손상의 경우, 우리는 과응고 상태라고 부르는 심각한 상태입니다. 측정하기가 매우 어렵습니다. 그리고 환자의 혈액에는 세포사멸체(apoptosis) 몸체, 미세소포(micro vesicle), 엑소좀(exosome)을 포함하여 세포외 소포(extracellular vesicle)라고 부르는 미세 소포가 있습니다.그리고 그들은 프로 응고 능력이 다릅니다. 그래서 우리는 능력을 측정할 수 있는 방법을 찾아야 합니다. 그리고 이 방법을 사용하면 세포외 소포의 차이를 빠르게 찾을 수 있습니다.그것은 매우 중요합니다. 이 조치에 따라 우리는 많은 일을 할 수 있습니다. 우리는 TPI 마우스와 임상 환자, 특히 말초 순환에서 약간의 색전술이 필요하다는 것을 확인했습니다.이는 임상에서 매우 심각한 문제입니다. 우리의 프로토콜은 단순성, 비용 효율성 및 속도로 인해 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공했습니다. 이를 통해 병상에서 혈액 응고 검사를 수행할 수 있으므로 광범위한 실험실 처리가 필요하지 않습니다.우리의 연구는 말초 혈액의 과응고 상태를 측정할 수 있는 새로운 방법을 확립했습니다. TPI뿐만 아니라 패혈증, 자간전증, 종양 및 혈액 질환과 같은 다른 질병에도 사용할 수 있습니다. 앞으로 우리는 혈전의 위험을 증가시키는 임상 하이퍼 질환을 스캔할 때 OF를 조사할 계획입니다.

determination-procoagulant-activity-extracellular-vesicle-ev-using-ev

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

이 논문은 광물화 가능성을 관찰하기 위해 쥐 대동맥을 분리한 후 석회화된 세포외 소포를 추출하여 혈관 석회화를 얻고 평가하는 방법론을 제시합니다.

In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

여기서는 사내 세포외 소포체 조직 인자 활성 분석에 대해 설명합니다. 활성 기반 분석 및 항원 기반 분석은 인간 혈장 샘플에서 세포외 소포체의 조직 인자를 측정하는 데 사용되었습니다. 활성 기반 분석은 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높습니다.

세포외 소포 조직 인자 활성 분석

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

배우세요 뇌 손상 환자의 응고 장애를 세포외 소포(EV) 활성화 응고 시간(EV-ACT)으로 측정하는 방법을. 차등 원심분리와 재칼슘화를 통해 EV 풍부한 혈장을 준비하고 응고 기능을 신속하게 평가할 수 있습니다.

EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정

더 많은 동영상 탐색