Name: 고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 고분해능 호흡 측정법을 사용하여 Drosophila melanogaster PINK1 B9-null 돌연변이의 미토콘드리아 생체에너지학을 분석하는 방법. 이 프로토콜은 파킨슨병 연구에서 미토콘드리아 기능 장애를 이해하는 데 도움을 줍니다.

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저자는 브라질 기관인 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)를 인정합니다. PM(#88887.512821/2020-00) 및 TD(#88887.512883/2020-00)는 연구 펠로우십 수혜자입니다.

블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center, ID 번호: 34749)의 w 1118(흰색) 및 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9로 지칭)(FlyBase ID: FBgn0029891) 균주를 사용했습니다. 이 연구에서는 수컷 D. melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 대조군(유전적 배경)으로 사용되는 w1118 균주의 수컷 D. melanogaster와 비교합니다. 다른 파라미터는 호흡 측정 실험과 동시에 분석되어야 하며, 이는 분홍색1B9 돌연변이 파리 24,25,26에 대해 잘 설명된 흉부 기형 및 운동 문제와 같은 파리가 올바른 유전자형(Pink1B9/Y)을 갖도록 해야 합니다.
1. 동물과 주거
<ol><li>파리를 10mL의 표준 식단(효모 1.73%, 콩가루 0.9%, 옥수수 가루 7.3%, 한천 0.5%, 옥수수 시럽 7.6%, 프로피온산 0.48%)이 들어 있는 유리병에 담아 일정한 온도와 습도(각각 25°C 및 60%)에서 12시간:12시간 명암주기로 보관합니다.</li>
	<li>각 실험에 대해 폐주 후 1-3일 된 파리 두 마리를 사용합니다. 참고 : PINK1B9-null 돌연변이 처녀 암컷 파리를 w1118 수컷과 교배하여 유전자형 Pink1B9 / Y를 가진 F1 수컷을 얻었습니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>표 1에 설명된 대로 MiR05 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 파리를 마취하고 마이크로 원심 분리기 튜브 (튜브 당 2 마리의 파리)로 옮깁니다.</li>
	<li>각 튜브에 200μL의 냉각된 MiR05 완충액을 넣고 파리를 균질화합니다. 미토콘드리아의 붕괴를 방지하기 위해 부드러운 압력(유봉의 약 4-6 스트로크)을 가하여 수동으로 균질화합니다.</li>
</ol>3. 폴라로그래픽 산소 센서의 고해상도 호흡 측정 교정
참고: OROBOROS 챔버의 총 부피는 약 2mL입니다. 분석을 시작하기 위해 산소 플럭스가 0pmol에 가까운지 확인하려면 보정이 필요합니다.
<ol><li>교정을 시작하여 챔버에 MiR05 2mL를 추가합니다. 기포를 남기지 않고 스토퍼로 챔버를 덮으십시오. 그런 다음 스토퍼를 조심스럽게 당겨 하나의 기포를 형성합니다.</li>
	<li>OROBOROS Dat.Lab 소프트웨어를 엽니다. Block temperature(블록 온도) 필드에 25°C의 온도를 입력하고 Connect to Oxygraph-2k(Oxygraph-2k에 연결)를 클릭합니다(그림 1A).</li>
	<li>캘리브레이션을 저장할 폴더를 클릭하고 선택하고 Save(저장)를 클릭합니다.</li>
	<li>새 창이 열리면 실험과 샘플의 이름을 지정하고(교정하는 경우 교정이라는 이름을 입력하기만 하면 됨) 저장을 클릭합니다.</li>
	<li>레이아웃 메뉴로 이동하여 첫 번째 옵션인 01 Calibration Exp. 그림 3B와 같이 1 - Temp를 선택합니다.</li>
	<li>프로그램이 보정 레이아웃으로 리디렉션될 때까지 기다렸다가 빨간색 선에 약 0pmol의 점이 있는 표준 직선이 표시될 때까지 기다립니다. 그런 다음 빨간색 선이 정확히 0일 때 챔버 A와 챔버 B에 대해 다른 하나, 두 점을 선택합니다(그림 1C). 알림: 선택한 지점에는 산소 플럭스(빨간색 선)가 0 부근이어야 합니다.<ol><li>두 챔버의 포인트를 표시하려면 화면 오른쪽에서 O2 농도를 선택하고 마크 포인트를 선택한 다음 포인트에 대한 온도 및 기압 값을 모두 복사합니다. 이 값을 아래 상자에 붙여넣고 그림 2와 같이 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 Calibrate and Copy to Clipboard를 클릭합니다.</li>
		<li>두 챔버 (A 및 B)에 대해 이 프로세스를 수행한 다음 파일 메뉴로 이동하여 저장 및 연결 끊기를 선택합니다. 알림: 보정 프로세스가 끝나면 프로그램은 소프트웨어가 HRR 테스트를 시작할 준비가 되도록 사용자를 홈 화면으로 리디렉션합니다. 이 테스트에서는 SUIT 프로토콜을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. SUIT 프로토콜
<ol><li>보정이 완료되면 스토퍼를 제거하고 챔버를 엽니다.</li>
	<li>스토퍼(샘플에 닿지 않는 팁을 잡음)와 챔버를 100% 에탄올, 70% 에탄올, 증류수 순서로 세척합니다. 알림: 모든 s에 대해 프로세스를 반복하십시오.amp르 변경.</li>
	<li>200μL의 완충액에서 파리를 균질화하고, 마이크로피펫을 사용하여 모든 샘플 내용물을 챔버에 넣고, 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 챔버에 스토퍼를 재배치합니다. 알림: 기포가 형성되면 스토퍼를 부드럽게 제거하고 MIR100μL 버퍼를 05μL를 추가합니다.</li>
	<li>레이아웃(Layout) 메뉴를 클릭하고 그림 1B와 같이 05 Flow by Corrected Volume 옵션을 선택합니다.</li>
	<li>새 창으로 리디렉션될 때까지 기다립니다. Save( 저장 )를 클릭하여 실험을 저장할 폴더를 선택합니다.</li>
	<li>다른 새 창이 열릴 때까지 기다립니다. 공간의 실험 이름을 Experimental Code로 지정합니다. 그런 다음 Sample 필드에서 해당 챔버의 각 샘플의 이름을 A와 B로 지정하고 Unit 필드를 단위로 설정합니다. 참고: 예를 들어 다른 단위도 선택할 수 있습니다.ample, Millions of cells 또는 mg.</li>
	<li>이 프로토콜은 두 개의 파리(2개 단위)를 사용하고 챔버 부피가 2mL인 것을 고려하여 농도 필드에서 mL당 1 개를 정의합니다(그림 1D). 참고: 여기서, 샘플 양은 파리의 수로 정규화되었습니다. 그러나, 이러한 정규화는 샘플의 단백질 함량, 미토콘드리아 DNA 정량화, 또는 시트레이트 합성효소의 활성에 의해 수행될 수 있다.</li>
	<li>산소 플럭스 신호(빨간색 선)가 양수 값으로 안정되면 기질, 억제제 및 언커플러의 적정으로 HRR 프로토콜을 시작합니다(그림 3). 모든 후속 시약 및 장비는 표 1에 나와 있습니다.<ol><li>디지토닌(5μg/mL)을 추가하여 미토콘드리아 막을 투과시킵니다.</li>
		<li>피루브산(5mM), 말레이트(2mM) 및 프롤린(10mM) 기질을 추가하고 산소 플럭스가 증가하고 안정화될 때까지 기다립니다. 각 시약 추가에 대한 이벤트를 표시하려면 키보드에서 F4 키를 누르고 각 시약의 이름을 입력합니다.</li>
		<li>ADP(5mM)를 추가하여 미토콘드리아 호흡 사슬을 결합하고 산소 플럭스의 증가와 안정화를 기다립니다.</li>
		<li>숙시네이트(10mM)를 넣고 산소 플럭스의 증가 및 안정화를 기다립니다.</li>
		<li>올리고마이신(2.5μM)을 첨가하여 ATP 합성효소를 억제하고 산소 플럭스의 감소를 확인합니다.</li>
		<li>빨간색 선이 안정화될 때까지 기다렸다가 최대 산소 소비량에 도달할 때까지 0.25μM의 역가와 함께 Carbonyl-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone cyanide(FCCP)를 사용하여 미토콘드리아 전자 전달을 분리합니다(빨간색 선의 상승으로 입증됨). 산소 플럭스가 안정화된 후 각 복합체의 억제제를 한 번에 하나씩 추가하기 시작합니다.</li>
		<li>복합 I 억제제인 로테논(0.5μM)을 추가합니다. 다음 억제제를 추가하기 위해 산소 플럭스의 감소 및 안정화를 기다립니다.</li>
		<li>복합 II 억제제인 말로네이트(5mM)를 추가합니다. 다음 억제제를 추가하기 위해 산소 플럭스의 감소 및 안정화를 기다립니다.</li>
		<li>마지막으로 복합 III 억제제인 항마이신(2.5μM)을 추가합니다. 산소 플럭스의 증가와 안정화가 뒤따르는 감소를 기다리십시오. 참고: 산소 플럭스는 양수 값에서 안정화되어야 하지만 미토콘드리아 단백질 복합체의 마지막 억제 값보다 낮아야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석이 끝나면 마이크로 피펫을 사용하여 챔버의 모든 내용물을 제거합니다. 필요한 경우 향후 분석을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석을 위해 적절한 통계 소프트웨어 패키지를 활용하십시오.</li>
	<li>t-검정을 수행하여 두 그룹 간의 차이를 평가합니다. 여러 처리가 필요한 상황에서는 분산 분석(ANOVA)을 통계적 검정으로 사용합니다 27.</li>
	<li>소프트웨어에서 생성된 그래프에서O2 플럭스 값을 추출합니다. OXPHOS CI는 ADP를 첨가한 후의O2 플럭스의 값을 나타낸다. OXPHOS CII는 OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI를 빼서 구합니다. OXPHOS CI&CII는 숙시네이트를 첨가한 후 추출된O2 플럭스의 값입니다. ETS CI&CII는 FCCP를 추가한 후의O2 플럭스 값입니다. ETS CI = FCCP - 로테논 및 ETS CII = 로테논 - 말로네이트.</li>
	<li>ATP 합성을 OXPHOS(P)와 LEAK(L)(P - L)28의 차이로 계산합니다.</li>
	<li>OXPHOS/LEAK 비율을 계산하여 호흡 제어 비율(RCR)을 결정합니다(여기서 RCR = P/L.11).</li>
</ol>

초파리의 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학 분석

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</ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

HRR은 D. melanogaster 및 기타 유기체의 미토콘드리아 호흡 및 에너지 대사를 연구하는 강력한 기술입니다. 미토콘드리아 기능에 대한 상세하고 정량적인 평가를 제공하여 연구원들이 세포의 생체 에너지학에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 D. melanogaster의 SUIT 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 및 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가하는 방법을 설명합니다. SUIT 프로토콜은 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면을 검사하기 위해 다양한 기질, 분리 장치 및 억제제를 체계적으로 조작하는 것을 포함합니다.
설명된 기술을 통해 OXPHOS 또는 ETS에 대한 효과, 탈수소효소 활성(CI 및 CII) 및 막 무결성(OXPHOS의 결합)으로 인한 호흡 억제를 평가할 수 있습니다. 여기서는 PD34,35<sup class="xref...

미토콘드리아는 세포사멸 조절, 칼슘 항상성, 생합성 경로 참여 등 중요한 기능을 조절하는 세포 소기관입니다. 자율적인 유전 물질을 소유함으로써 세포 유지 및 복구 과정에 기여할 수 있습니다. 그들의 구조는 세포 에너지 1,2,3에 중요한 전자 수송 사슬과 산화적 인산화를 수용합니다. 특히, 산화적 인산화(OXPHOS)를 통한 아데노신 삼인산(ATP) 생산을 통해 에너지 제어가 이루어집니다2. 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사 장애는 세포의 생존과 사멸 모두에서 발생하며4,5 암과 같은 광범위한 인체 병리학 및 파킨슨병(PD)3,6과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다.
파킨슨병은 만성, 진행성, 신경학적 장애입니다. 이 질병의 주요 원인은 뇌 세포의 죽음이며, 특히 운동을 조절하는 신경 전달 물질 도파민의 생산을 담당하는 흑질의 사멸입니다 6,7,8. 파킨슨병과 미토콘드리아 기능 장애를 연관 짓는 최초의 관찰은 1988년 호흡 사슬 복합체 I9를 억제하는 독소를 사용한 실험 모델에서 이루어졌습니다.
현재 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법에는 여러 가지가 있다 10,11,12,1 3; 그러나 기존 접근법에 비해 고분해능 호흡 측정법(HRR)은 우수한 감도와 이점을 제공합니다13,14. 예를 들어, HRR 프로토콜은 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가할 수 있다(14,15). 미토콘드리아 기능 장애는 온전한 세포, 분리된 미토콘드리아 또는 생체 외10,11,13,14에서 평가할 수 있습니다.
미토콘드리아 기능 장애는 많은 병리학적 및 생리학적 과정과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델 시스템을 사용하여 연구하는 것이 중요합니다. 이와 관련하여 초파리인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에 대한 연구는 몇 가지 장점이 있습니다. 이 모델은 DNA를 유전 물질로 사용하는 것, 공통 세포 기관, 발달, 면역 및 세포 신호 전달에 관여하는 보존된 분자 경로를 포함하여 기본적인 세포 특성과 과정을 인간과 공유합니다. 또한, 초파리는 빠른 생애 주기, 쉬운 유지 보수, 저렴한 비용, 높은 처리량 및 적은 윤리적 문제를 가지고 있으므로 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구를 구성합니다 16,17,18,19,20.
또한, PTEN-유도된 추정 키나아제 1(pink1) 유전자의 상동체가 D. melanogaster에서 발현됩니다. 미토파지 과정을 통해 손상된 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 역할을 합니다8. 인간의 경우, 이 유전자의 돌연변이는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 상염색체 열성 가족성 형태의 PD에 걸리기 쉽다 8,21,22,23. 결과적으로, 초파리는 PD의 병태생리학 연구와 미토콘드리아 기능 장애 및 생체 에너지학에 중점을 둔 약물 후보 물질의 스크리닝을 위한 강력한 동물 모델입니다. 따라서 본 연구는 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용하여 OROBOROS에서 HRR 기술을 사용하여 D. melanogaster의 PD 모델에서 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5285</td><td>아데노신 5&프라임;-디포스페이트 나트륨 염 (CAS 번호 72696-48-1); &ge; 95%; 분자량 = 501.31g/mol.</td></tr><tr><td>&급성; gar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>세균학 사용</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS 번호 1397-94-0); 분자량&nbsp; 540 g/mol;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>A7030</td><td>소 혈청 알부민 (CAS 번호 9048-46-8); pH 7,0 &ge; 98 %</td></tr> <tr><td>Datlab 소프트웨어</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>데이터 수집 및 분석 용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>CAS 번호 11024-24-1</td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>Bloomington Drosophila stock center</td></tr><tr><td>에서 획득Drosophila melanogaster strain&nbsp; w1118</td><td></td><td></td>획득; <td>산타마리아 연방 대학교에서</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (CAS 번호 13638-13-3); &ge; 97%; 분자량 = 468.28 g/mol</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>카르보닐 시안화물 4- (트리플루오로메톡시)페닐하이드라존&nbsp; (CAS 번호 370-86-5); &지; 98% (TLC), 분말&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 버전 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어</td></tr><tr>:<td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS 번호 7365-45-9); 99,5%(적정), 세포 배양 테스트; 분자량 = 238.30g/mol</td></tr><tr><td>고해상도 호흡계 Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K 호흡계 키트</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>인산일칼륨(CAS 번호 7778-77-0); 시약 플러스, 분자 weigt = 136.09 g / mol</td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>211473</td><td>수산화 칼륨 (CAS 번호 1310-58-3); ACS 시약, &ge; 85 %, 펠릿</td></tr><tr><td>말레이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M1296</td><td>말론 산 (CAS 번호 141-82-2); 99 %, 분자량 = 104.06 g / mol). 용액은 pH가 약 7.0으로 조정됩니다.</td></tr><tr><td>사과산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1000</td><td>(S)-(&마이너스;)-2- 하이드 록시 숙신산 (CAS 번호 97-67-6); &지; 95% ; 분자량 = 134.09 g/mol</td></tr><tr><td>MES</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3671</td><td>2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(CAS 번호 4432-31-9); &ge; 99%(적정); 분자량 = 195.24 g / mol</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>염화 마그네슘 (CAS 번호 7786-30-3);무수, &ge; 98%, 분자량 = 95.21 g/mol</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titration Set</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>다양한 용량의 Hamilton 주사기</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O 4876</td><td>Oligomycin from&nbsp; 스트렙토마이세스 디아스타토크로모겐스(CAS 번호&nbsp; 1404-19-9); &지; 90 % 총 oligomycins 기초 (HPLC)</td></tr> <tr><td>균질화</td><td></td><td></td><td></td>에 Pistil</tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>L-Proline (CAS 번호 147-85-3); 분말; 99 %; 분자량 = 115.13 g / mol</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>나트륨 pyruvate (CAS 번호 113-24-6), &ge; 99%; 분자량 = 110.04 g/mol</td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8875</td><td>로테톤(CAS 번호 83-79-4); &ge; 95 %, 분자량 394.42 g / mol</td></tr><tr><td>숙시 네이</td>트 <td>시그마 - 알드리치</td><td>S 2378</td><td>나트륨 숙시 네이트 이염기성 육수화물 (CAS 번호 6106-21-4); &ge; 99 %</td></tr> <tr><td>자당</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>미생물학 용 자당 (CAS 번호 57-50-1)</td></tr> <tr><td>타우린</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T0625</td><td>CAS 번호 107-35-7</td></tr></tbody></table>

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 pink1b9-null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 질환과 암과 같은 세포 장애는 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사를 방해하는 질환 중 일부입니다. 미토콘드리아는 세포 소기관으로, 에너지 대사와 세포 생존 및 사멸에 관여하는 세포 과정을 모두 조절합니다. 이러한 이유로 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법은 병리학적 및 생리학적 과정에서 세포 상태에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이와 관련하여 고분해능 호흡 측정법(HRR) 프로토콜을 통해 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활동을 평가할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 생리학 및 생체 에너지학을 연구하려면 Drosophila melanogaster와 같은 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델이 필요합니다.
이 모델은 인간 생리학과의 유사성, 빠른 수명 주기, 쉬운 유지 관리, 비용 효율성, 높은 처리량 기능 및 최소화된 윤리적 문제와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 특성은 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구로 총체적으로 설정됩니다. 본 연구는 Drosophila melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 이용하여 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명한다. pink1 유전자는 미토콘드리아 네트워크에서 기능 장애를 일으키는 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 미토파지로 인식되는 과정을 통해 PTEN에 의해 유도된 추정 키나아제 1을 암호화하는 역할을 합니다. 이 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 조기 발병 가족성 PD와 관련이 있습니다. 이 모델은 PD의 병태생리학과 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기서, OXPHOS CI (P = 0.0341) 및 OXPHOS CI &amp;II (P = 0.0392) 상태에서의 O2 플럭스는 대조 파리와 비교할 때 PINK1B9 null fly에서 감소됩니다 (그림 4). 이 결과는 우리 그룹29,30의 이전 결과에서도 관찰되었습니다.
CI와 CII는 전자 수송 시스템(ETS)의 핵심 구성 요소로, CI는 NADH에서 유비퀴논으로 전자를 전달하는 역할을 하는 반면 CII는 석시네이트에서 유비퀴논으로 전자를 전달합니다(31,32,33).</s...

여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

우리의 연구는 질병 및 화학적 독성에서 미토콘드리아 기능을 이해하기 위해 실험 모델로 Drosophila melanogaster를 사용합니다. PINK-1 돌연변이가 미토콘드리아 기능에 어떤 영향을 미치며 이것이 파킨슨병과 어떤 관련이 있는지에 대한 몇 가지 질문에 답하고 싶습니다. 이 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 어떻게 되돌릴 수 있습니까?고분해능 호흡 측정은 정확한 작동 및 데이터 분석을 위한 전문 교육이 필요합니다. 또한 우리가 사용한 시스템은 여러 샘플을 동시에 사용할 수 없으며 고처리량 분석을 위한 교육을 받지 않았습니다. 동시에 두 개의 샘플만 실행할 수 있기 때문에 실험 설계를 잘 설명해야 합니다.우리의 발견은 OXPHOS CI 연결 및 ETS CI&CII 연결의 감소를 특징으로 하는 PINK1-Null 돌연변이에서 직면하는 미토콘드리아 기능의 점진적인 손상과 경로에서 ATP 생산의 대사 대사 전환이 산화에서 해당과정으로 이동함을 나타냅니다. 이러한 결과는 파킨슨병 병태생리학과 밀접한 관련이 있습니다. 고분해능 호흡 측정의 핵심 포인트 중 하나는 산소 소비량을 직접적이고 정확하게 측정하여 미토콘드리아 기능과 세포 대사를 자세히 분석할 수 있다는 것입니다.또한 다재다능합니다. 분리된 미토콘드리아를 포함한 다양한 시료 유형에 사용할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애가 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 일반적인 특징이라는 점을 고려하여, 미토콘드리아 기능과 에너지 상승이 신경퇴행성 질환 치료의 중요한 표적이 될 수 있는 방법을 연구하는 데 중점을 둘 것입니다.

analyzing-mitochondrial-function-drosophila-melanogaster-pink1b9-null

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

미토콘드리아는 신진대사와 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. 유기체 생리학에 영향을 미치는 미토콘드리아 대사의 미묘한 변화는 전체 유기체 대사체학 연구에서 감지하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 Drosophila melanogaster에서 미묘한 대사 변화의 감지를 향상시키는 분리 방법을 설명합니다.

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조<em&gt; 초파리</em

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

우리는 Drosophila 조직 균질제에서 온전한 미토콘드리아 질량의 정량화를 위한 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 제시한다.

초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

학습하세요 고분해능 호흡 측정법을 사용하여 Drosophila melanogaster PINK1 B9-null 돌연변이의 미토콘드리아 생체에너지학을 분석하는 방법. 이 프로토콜은 파킨슨병 연구에서 미토콘드리아 기능 장애를 이해하는 데 도움을 줍니다.

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1^B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

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