Name: 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 배우세요 PROTACS 유도 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성화를 위한 SPR, BLI, ITC 방법을. 이 프로토콜은 VHL 및 CRBN 계열의 표적 단백질 분해 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 MIT와 하버드의 브로드 연구소(Broad Institute of MIT and Harvard)의 치료제 개발 센터(Center for the Development of Therapeutics)의 혁신 및 기술 개발 상(Innovation and Technology Development Award)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업을 지원해 준 고위 경영진과 검토 위원회의 구성원들에게 감사의 뜻을 전한다.

모든 단백질은 문헌 프로토콜18에 따라 우수한 수율과 순도(>80%)로 대장균에서 과발현되었습니다. 비오틴화는 BirA-촉매 반응18을 사용하여 수행하였다. 모든 저분자는 100% DMSO에서 1mM 원액으로 준비되었습니다. 여기에 설명된 절차에는 특수 실험실 안전 장비나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 표준 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다(예: 실험실 가운, 보안경 및 장갑).
이 연구에 적용된 단백질은 다음과 같습니다. VHL: ElonginB의 C-말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 VHL(53-213)/ElonginB(1-104)/ElonginC(17-112) 복합체. Brd4BD2: 태그가 지정되지 않은 Brd4BD2(333-460) CRBN: N 말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 CRBN(319-442) PPM1D: N 말단에서 태그가 지정되지 않은 이중 또는 이중 His8 태그가 지정된 PPM1D(1-420)
이 연구에 적용된 소분자는 다음과 같습니다. MZ1 (MW = 1002.6 Da): VHL 및 Brd4BD2에 결합하는 PROTAC BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBNKD ~ 3 μM, PPM1D에 결합하지 않음 BRD-5110 (MW = 872.0 Da) : CRBNKD ~ 3 μM, PPM1DKD = 1-2 nM BRD-4761(MW = 476.6Da): CRBN, PPM1DKD = 1-2nM에 결합하지 않음
1. 방법 1: ITC(등온 적정 열량계)
참고: 적정은 자동 주입 기능이 있는 마이크로 열량계를 사용하여 수행됩니다.
<ol><li>완충액 준비: 20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, pH 7.5를 포함하는 완충액 3L를 준비합니다.</li>
	<li>투석: VHL 및 Brd4BD2 (각각 150μM에서 ~ 500μL)를 단계 1.1에서 제조한 완충액 1L에 대해 4°C에서 3회, 각각 4시간, 2시간 및 약 16시간 동안 투석합니다. 마지막 투석 후 후속 단계에서 사용할 수 있도록 완충액을 저장합니다.</li>
	<li>플라스틱 덮개가 있는 96웰 플레이트에 샘플을 준비합니다.<ol><li>각 적정에 대해 셀용 용액 400μL, 주사기용 용액 125μL, 세척용 완충액 400μL를 준비합니다. 플레이트의 연속된 웰 3개에 샘플을 추가합니다. 화합물 스톡은 100% DMSO에서 1mM으로 준비되므로 단백질 용액에 동일한 비율의 DMSO를 첨가하여 세포와 주사기의 완충액이 일치하도록 합니다. 최종 용액에 2% DMSO를 추가합니다.<ol><li>VHL을 MZ1로 적정하기 위한 샘플: 392μL의 완충액, 1mM(10μM 최종 농도)에서 4μL의 MZ1 및 4μL의 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM에서 122.5μL의 VHL, 2.5μL의 100% DMSO(84μM 최종 농도)를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
			<li>VHL을 완충액으로 적정하기 위한 샘플(데이터는 샘플 1.3.1.1에서 생성된 데이터의 백그라운드 빼기에 사용됨): 392μL 완충액, 8μL 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(최종 농도 84μM)에서 122.5μL의 VHL을 포함하는 주사기 용액을 준비하고 2.5μL의 100% DMSO를 추가합니다.</li>
			<li>VHL을 MZ1 및 Brd4 BD2로 적정하기 위한 샘플: 17.1μM Brd4BD2(16.8μM 최종 농도) 392μL, 1mM(8.4μM 최종 농도)에서 MZ1 3.36μL 및 100% DMSO의 4.64μL를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(84μM 최종 농도)에서 122.5μL의 VHL과 2.5μL의 100% DMSO를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
			<li>VHL을 Brd4 BD2로 적정하기 위한 샘플(1.3.1.3의 배경): 392μL의 17.1μM Brd4BD2(16.8μM 최종 농도) 및 8μL의 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(84μM 최종 농도)에서 122.5μL의 VHL과 2.5μL의 100% DMSO를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>마이크로 열량계에서 4개의 적정을 모두 실행합니다. 각각은 120초 시간 간격으로 2μL/s의 속도로 2μL 주사기 용액을 19회 주입하는 것으로 구성됩니다. 단백질(0.4μL)을 초기에 주입하고 데이터 분석 중에 폐기합니다. 모든 실험은 25°C에서 600rpm으로 교반하면서 수행합니다.</li>
	<li>데이터 분석: 제조업체에서 제공한 분석 소프트웨어를 사용하여 화학량론(n), 해리 상수(KD) 및 결합 엔탈피(ΔH)를 얻기 위해 단일 결합 부위 모델에 데이터를 맞춥니다(그림 2).</li>
</ol>2. 방법 2: BLI(생물층 간섭계)
<ol><li>5Hz의 획득 속도로 실온(RT)에서 streptavidin(SA) 코팅 센서를 사용하여 BLI 실험을 수행합니다. 자동화된 BLI 실험 중에 센서가 단일 컬럼 내에 고정되어 있고 최대 웰 부피가 392μL인 96웰, 평평한 바닥, 흑색 플레이트의 다른 컬럼 사이를 이동하는지 확인합니다. 실험에 사용된 플레이트의 각 웰을 200μL의 용액으로 채웁니다. 참고: BLI는 단백질-단백질 상호 작용(즉, 삼원 복합체 형성)을 감지하는 데만 유용합니다. 단백질과 소분자 사이의 상호 작용을 감지할 만큼 민감하지 않습니다.<ol><li>완충액 준비: 20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, 0.05% P20, pH 7.5를 포함하는 완충액 100mL를 준비합니다.</li>
		<li>고정 단계 최적화: 제조업체에서 권장하는 대로 테스트 센서를 1-3nm로 로드합니다. ~1.0nm의 하중이 여기에 설명된 절차에 사용됩니다. 이를 위해 센서를 1.5μg/mL의 VHL이 포함된 용액에 80초 동안 담그십시오.</li>
		<li>다음 시퀀스를 사용하여 7개의 SA 센서를 적용하여 BLI 역학 측정을 수행합니다.<ol><li>첫 번째 기준 단계의 경우 60초 동안 버퍼에 담급니다.</li>
			<li>고정화 단계의 경우 1.5μg/mL의 VHL 용액에 80초 동안 담그십시오.</li>
			<li>두 번째 기준 단계의 경우 60초 동안 버퍼에 담그십시오.</li>
			<li>결합 단계의 경우 2μM에서 고정 농도의 Brd4BD2 , 2%에서 고정 농도의 DMSO와 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.3nM, 3.1nM 및 0nM(기준 센서)에서 다양한 농도의 MZ1 용액에 300초 동안 담그십시오.</li>
			<li>해리 단계의 경우 600초 동안 버퍼에 담그십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 데이터 피팅을 위해 k on, koff 및 KD가 보고됩니다(그림 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 방법 3: SPR(표면 플라즈몬 공명)
참고: 모든 SPR 실험은 RT에서 스트렙타비딘(SA) 코팅 센서 칩을 사용하여 수행됩니다. NTA 칩은 단백질과 소분자 사이의 검출에 사용되지만, SA 칩보다 훨씬 더 높은 배경이 관찰되기 때문에 삼원 복합체에 적용할 때 하전된 칩 표면과 분석물 내 단백질 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 주의해서 사용해야 합니다.
<ol><li>VHL-MZ1 상호 작용을 위한 SPR<ol><li>완충액 준비.<ol><li>20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, 0.005% P20, pH7.5를 포함하는 1L 완충액을 준비하고 0.2μm 필터 장치를 통과시킵니다.</li>
			<li>나중에 사용할 수 있도록 20mL의 완충액을 제거하고(DMSO 무함유 완충액) 20mL의 DMSO(최종 실행 완충액의 2% DMSO)로 다시 채웁니다. 아래에 설명된 모든 샘플에서 DMSO를 2%로 유지합니다(3.1 및 3.2단계).</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 VHL을 ~2000RU로 고정합니다(5μL/min에서 5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>최대 부피가 130μL인 384웰, 원뿔형 바닥, 반투명 폴리프로필렌 플레이트에서 상단 농도 10μM의 3겹, 8포인트 연속 희석으로 MZ1을 준비합니다. 폴리프로필렌 마이크로플레이트와 호환되는 자체 접착식 투명 플라스틱 호일로 플레이트를 덮습니다.<ol><li>최종 농도에서 2% DMSO를 보장하기 위해 DMSO가 없는 완충액으로 최고 농도를 준비합니다. 147μL의 DMSO-free 완충액에 1mM에서 1.5μL의 MZ1 스톡과 100% DMSO의 1.5μL를 추가합니다.</li>
			<li>2% DMSO를 함유한 러닝 버퍼로 3배 연속 희석액을 준비합니다. 러닝 버퍼 100μL에 3.1.3.1단계에서 제조한 최고 농도의 용액 50μL를 첨가하고 잘 혼합하여 2차 최고 농도를 제조한다.</li>
			<li>그런 다음 3.1.3.2 단계에서 제조한 용액 50μL를 다음 100μL의 러닝 버퍼로 옮기고 잘 혼합하여 3번째로 높은 농도를 제조하는 식입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간 : 120 초; 해리 시간: 300초; 유량: 50μL/min.</li>
		<li>기기 제조업체에서 제공하는 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 정상 상태 분석은 KD = 26 (± 3) nM 및 ~ 91 % (± 5 %) 결합의 Rmax가 달성되었음을 나타 냈습니다 (그림 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>VHL용 SPR: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체<ol><li>3.1.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 VHL을 ~100RU로 고정합니다. 0.5μg/mL VHL의 단백질 용액을 5μL/min의 유속으로 주입하고 표면 밀도가 ~100RU에 도달할 때까지 1-5분 사이의 접촉 시간을 주입합니다.</li>
		<li>최대 부피가 323μL인 96웰의 투명한 폴리스티렌 원형 바닥 플레이트에서 2회의 5겹, 5포인트 단일 사이클 주입을 위한 샘플을 준비하고 3.2.3.1-3.2.3.2단계에 설명된 대로 폴리스티렌 마이크로플레이트와 호환되는 접착식 투명 플라스틱 호일로 덮습니다.<ol><li>음성 대조군: 분석물에는 Brd4BD2 만 포함되어 있습니다.<ol><li>부피가 200μL(#A5)인 실행 버퍼에서 25μM의 최고 농도를 준비합니다.</li>
				<li>러닝 버퍼의 2μM에서 각각 160μL의 Brd4BD2 를 왼쪽의 다음 4웰(#A1-A4)에 추가합니다.</li>
				<li>40μL의 A5를 A4로 옮깁니다. 잘 섞는다.</li>
				<li>40μL의 A4를 A3로 옮깁니다. 잘 섞는다. A1까지 계속하십시오.</li>
			</ol></li>
			<li>삼원 복합체 형성: 분석물에는 MZ1 및 Brd4BD2가 포함되어 있습니다.<ol><li>DMSO-free 완충액(#B5)에 25.5μM Brd4BD2 를 포함하는 196μL에 100% DMSO 용액에서 20μM에서 4μL의 MZ1을 추가하여 최고 농도를 준비합니다. 최종 농도는 25μM Brd4BD2, 100nM MZ1 및 2% DMSO입니다.</li>
				<li>실행 중인 버퍼에서 2μM에서 각각 160μL의 Brd4BD2 를 왼쪽의 다음 4웰(#B1-B4)에 추가합니다.</li>
				<li>40μL의 B5를 B4로 옮깁니다. 잘 섞는다.</li>
				<li>40μL의 B4를 B3로 옮깁니다. 잘 섞는다. B1까지 계속하십시오.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>단일 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 접촉 시간: 100초; 해리 시간: 720초; 유량: 50μL/min. 안정적인 배경을 보장하기 위해 각 샘플 전에 완충액을 세 번 주입합니다.</li>
		<li>데이터 분석: 버퍼의 세 번째 주입을 빼기의 배경으로 적용합니다. 음의 대조군으로서 MZ1이 존재하지 않을 때 VHL과 Brd4BD2 사이의 SPR 응답은 무시할 수 있습니다. MZ1이 존재할 때, 키네틱 피팅은 VHL과 MZ1-Brd4사이의 상호작용이 k on = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1 및 KD = 1 nM임을 나타낸다. (그림 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>CRBN 및 저분자 상호작용을 위한 SPR<ol><li>완충액 준비.<ol><li>50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5를 포함하는 1L 완충액을 준비하고 0.2μm 필터 장치를 통과시킵니다.</li>
			<li>20mL의 완충액을 제거하고 20mL의 100% DMSO를 다시 채웁니다(최종 실행 중인 완충액에서 2% DMSO). 아래에 설명된 모든 샘플에서 DMSO를 2%로 유지하는 것이 중요합니다(3.3, 3.4 및 3.5단계).</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 CRBN을 ~800RU로 고정합니다.</li>
		<li>3.1.3에 설명된 대로 최고 농도가 30μM인 384웰 플레이트에서 3겹, 6pt 연속 희석으로 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능, 접촉 시간: 60초, 해리 시간: 90초; 유량: 50μL/min. 이 시스템의 경우 안정적인 백그라운드를 얻기 위해 세 번의 버퍼 주입으로 충분합니다. 다른 분석 시스템의 경우 추가 완충액 주입을 수행해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 알림: 정상 상태 분석에 따르면 BRD-2512 및 BRD-5110의 KD는 모두 약 3μM입니다. 그러나, 결합은 최고 농도에서만 ~ 70% R최대 결합을 도달했습니다. 약한 친화도와 센서그램의 모양은 모두 고농도에서 화합물 불용성이 발생할 가능성이 있음을 나타냅니다. 따라서,실제 KD 는 3μM보다 높을 수 있다. CRBN에 결합하지 않는 BRD-4761은 음성 대조군으로 포함되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>PPM1D 및 저분자 상호작용을 위한 SPR<ol><li>3.3.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다. 니트릴로아세트산(NTA) 센서 칩을 사용하십시오.</li>
		<li>PPM1D 탄두에는 느린 k켜기 와 끄기가 있으므로 단일 사이클을 적용하십시오. 제조업체의 기본 설정을 사용하여 NTA 칩을 재생하고 각 화합물 주입 후 PPM1D를 ~ 1000RU로 고정합니다(5μL/min에서 5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>3.1.3에 설명된 대로 최고 농도가 400nM인 3겹, 5점 연속 희석으로 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>단일 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간 : 90 초; 해리 시간: 600초; 유량: 50μL/min. 안정적인 백그라운드를 보장하기 위해 각 화합물 전에 완충액을 3회 주입합니다.</li>
		<li>데이터 분석. 버퍼의 세 번째 주입을 빼기의 배경으로 적용합니다. 음성 대조군인 BRD-2512는 PPM1D에 대한 결합을 나타내지 않습니다. BRD-4761 및 BRD-5110의 경우 키네틱 피팅은 둘 다에 대한 KD를 1-2nM으로 표시했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>CRBN:PROTAC에 대한 SPR: PPM1D 삼원 복합체<ol><li>3.3.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 CRBN을 ~35RU로 고정합니다(5μL/min에서 0.5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>3.2.3단계에 설명된 방법을 사용하여 블랭크를 포함한 모든 샘플에서 [PPM1D]를 1μM로 유지하면서 최고 농도가 30μM인 3겹, 6점 연속 희석으로 3개의 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간: 60초; 해리 시간: 90초; 유량: 50μL/min.</li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 알림: BRD-2512 및 BRD-4761은 반응이 없거나 무시할 수 있는 반면 BRD-5110은 빠른 온/오프 역학으로 정상 상태에서 "후크 효과"를 명확하게 보여줍니다(그림 5A-C). BRD-5110의 실험적 결합 반응(그림 5C)은 KD(CRBN, cpd)가 3 또는 10μM(그림 5E)라고 가정할 때 시뮬레이션에서 예측된 반응 사이에 있으며, 이는 삼항 KD와 이진KD가 매우 유사하다는 것을 시사합니다. PPM1D: BRD-5110: CRBN 복합체 형성의 명백한 협력성은 없습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Biophysical Assay를 사용한 PROTAC의 삼원 복합체 형성 특성 분석

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<li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li>
<li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+magnesium-dependent+1+%CE%B4+%28PPM1D%29%2C+serine%2Fthreonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362(2021).</li>
<li>Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li>
<li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li>
<li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li>
<li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 및 삼원 상호 작용에 대한 생물물리학적 특성 분석은 널리 사용되는 세포 시스템과 관련하여 독특하고 보완적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. PROTAC 분자의 각 탄두와 단백질 결합 파트너 간의 친화도를 이해하면 이러한 상호 작용을 최적화하기 위한 의약 화학 노력을 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 발표된 삼원 PROTAC 복합체의 결정 구조는 링커 영역의 원자가 단백질 결합 파트너(16,20) 중 하나 또는 둘 모두와 상호작용을 형성할 수 있음을 밝혀냈다. 삼원 복합 형성의 협력성을 실험적으로 결정하면 링커 최적화를 지원할 수 있습니다.
이 보고서에는 PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 결합 친화도에 대한 정보를 제공할 수 있는 세 가지 생물물리학 기법의 활용이 설명되어 있습니다. 방법 1은 PROTAC 분자, MZ1, VHL E3 리가아제 복합체 및 Brd4BD2 브로모도메인에 대한 등온 적정 열량측정법(ITC) 실험 설정을 자세히 설명합니다. ITC 결과는 MZ1과 VHL 사이의 이항 상호작용에 대해 59nM의 KD를 보여주었고, VHL과 미리 혼합된 MZ1 및 Brd4BD2 사이의 삼원 상호작용에 대해 4nM을 보여주었다. 친화도는 SPR(MZ1KD=26nM에 대한 고정화된 VHL 결합, 미리 혼합된 MZ1 및 Brd4BD2에 대한 고정화된 VHL 결합=1nM) 및 BLI(KD= 2.8nM)에서 관찰된 것과 일치했습니다. MZ1에 대한 VHL 결합에 대한 ITC KD 결과는 보고된 값16과 일치하지만, 얻어진 화학량론은 다르다. 이 결과에 대한 한 가지 잠재적인 설명은 여기에 설명된 프로토콜에 사용된 HEPES 기반 완충액에서 MZ1의 용해도가 낮다는 것이며, 문헌의 결과는 Bis-tris 기반 완충액을 사용하여 생성되었습니다. 저자는 SPR, ITC 및 BLI에서 동일한 버퍼 구성 요소를 사용하는 것을 선호했습니다.
방법 2는 고정화된 VHL, Brd4BD2 의 고정 농도 및 다양한 농도의 MZ1의 상호 작용에 대한 BLI 분석을 위한 실험 설정을 설명합니다. 이 기법의 감도 제한으로 인해, 삼원 복합체 형성에대한 KD, kon 및 koff 값은 생성될 수 있지만, MZ1과 단백질 사이의 이진 상호작용에 대해서는 생성되지 않습니다.
방법 3은 여러 SPR 분석에 대해 설명합니다. SPR은 BLI보다 더 민감하며 단백질-소분자(이원) 및 단백질-단백질(삼원) 상호 작용을 모두 관찰하는 데 적용할 수 있습니다. 후자의 경우, 분석물의 단백질이 높고 불안정한 신호를 제공할 수 있으므로 배경 신호를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. SPR은 DMSO, 글리세롤 및 세제를 포함하여 굴절률이 높은 시약에 매우 민감합니다. 단백질이 글리세롤 또는 세제를 함유하는 완충액에 저장되는 경우, 실행 중인 완충액은 해당 성분의 농도가 일치해야 합니다. 또는 크기 배제 크로마토그래피를 적용하면 SPR 실험 전에 완전히 제거됩니다. 완충액과 분석물 샘플 간의 DMSO 농도를 밀접하게 일치시키기 위해 주의를 기울여야 합니다. DMSO 용매 보정은 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.
단계 3.1의 방법은 바이너리 VHL-MZ1 상호 작용에 대한 SPR 분석을 설명합니다. 방법 3.2는 VHL에 대한 SPR 분석을 설명합니다: VHL이 고정되고 분석물이 Brd4BD2 단독 또는 MZ1:Brd4 BD2 복합체인 MZ1:Brd4 BD2 삼원 복합체. 이 시스템에서 Brd4BD2와 VHL 간의 상호 작용은 무시할 수 있습니다. 삼원 복합 형성은 매우 협조적입니다(ɑ = 26). 삼원 복합 형성에 대한 오프레이트는 0.014 s-1이며, 이는 단일 사이클 역학을 사용해야 합니다. ITC의 결과는 또한 매우 협력적인 삼원 복합 형성(ɑ=15)을 보여줍니다. 단계 3.3, 3.4 및 3.5의 SPR 방법은 PROTAC 분자 BRD-5110의 존재에 의해 유도된 CRBN과 PPM1D 사이의 복합체 형성을 평가하기 위한 분석을 설명합니다. PROTAC 분자는 CRBN(K D ~3 μM)에 대한 친화력이 약하고 PPM1D(KD = 1-2 nM)에 대한 친화력이 강합니다. 결과적으로, CRBN에 대한 약한 결합은 포화되지 않고 관찰된 "후크 효과"를 초래합니다. 실험에 사용된 DMSO 농도를 증가시켜 리간드 용해도를 높일 수 있지만, 이러한 경우 고농도의 DMSO에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있는 단백질 안정성을 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 또한 DMSO는 용해열이 높아 리간드가 단백질에 결합하는 열을 흐리게 할 수 있습니다. 주사기에 있는 용액과 세포에 있는 용액의 DMSO 농도가 일치하도록 주의해야 합니다. 저자는 동일한 완충액 제제에 대해 두 가지 용액을 투석할 것을 권장합니다.
일반적인 권장 사항 및 지침은 여기에서 수행되고 보고된 실험을 기반으로 제공됩니다. PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 상호 작용의 친화도가 강할 때(KD <1 μM) SPR은 삼원 복합체 형성의 협력성에 대한 귀중한 정보와 함께 신뢰할 수 있고 재현 가능한 친화력을 제공합니다. 단백질 결합 파트너 중 하나와 PROTAC 분자 간의 이원 상호 작용의 친화도가 약한 경우(KD >1μM) 분석 설정을 수정해야 합니다. 이러한 경우, 결합 상수가 고정되어 있고 리간드와 분석물의 농도가 다양한 분자 시뮬레이션을 사용하면 분석 설계를 안내하고 실험 결과를 해석하는 데 유용할 수 있습니다. ITC 분석은 결합의 화학량론에 대한 중요한 정보를 제공하지만 SPR 및 BLI에 비해 훨씬 더 많은 단백질 및 화합물 시약이 필요합니다. 또한 PROTAC 분자의 용해도는 ITC 실험에서 제한될 수 있습니다. BLI는 ITC보다 처리량이 높으며 단백질 및 화합물 시약이 덜 필요합니다. 그러나 감도 제한으로 인해 BLI는 PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 상호 작용이 아닌 삼원 복합체 형성을 평가하는 데만 사용할 수 있습니다. SPR은 바이너리 및 삼원 PROTAC 결합 분석의 일상 테스트와 SPR 결과의 직교 검증에 사용되는 BLI 및 ITC 분석에 사용하는 것이 좋습니다.

세포 내 단백질의 폴리유비퀴틴화는 유비퀴틴 리가아제 계열의 효소를 포함하는 엄격하게 조절되는 과정입니다 1,2. 이 경로의 말단 효소는 유비퀴틴 분자를 단백질 결합 파트너에 공유 결합하는 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이다3. 이러한 단백질 결합 파트너의 폴리유비퀴틴화는 프로테아좀4에 의한 단백질 분해를 표적으로 합니다. 이 시스템은 질병에 관여하는 단백질의 분해를 유도하기 위해 치료적으로 활용된 단백질 항상성 과정의 일부이다5. Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 또는 세레블론(CRBN)과 같은 E3 유비퀴틴 리가아제 간의 상호작용을 유도하는 소분자는 일반적으로 분해 표적이 되는 단백질에 결합하는 탄두에 유연한 링커에 의해 연결된 E3 리가아제 결합 탄두로 구성됩니다. 이러한 이종이기능성 분자는 일반적으로 키메라 또는 PROTACS6를 표적으로 하는 단백질 분해라고 합니다.
PROTACS의 개발에는 세포 내 단백질의 분해를 유도하는 분자의 능력 평가가 포함됩니다. PROTAC 분자로 세포를 처리할 때 표적 단백질과 E3 리가아제 성분(예: VHL 또는 CRBN) 간의 유도된 상호 작용을 모니터링하는 많은 세포 분석 시스템이 개발되었습니다. 이러한 세포 분석 중 하나인 nanoluc-Halotag 시스템7은 Halotag 수용체에 융합된 E3 리가아제와 나노루크 공여체로 태그된 표적 단백질을 포함합니다. 삼원 복합체 형성은 nanoluc 공여체와 Halotag 수용체를 근접하게 하여 공여체에서 수용체로 에너지를 전달하여 빛을 방출합니다. 이 시스템의 변형은 PROTACS 분자8의 세포 투과성 또는 표적 단백질 유비퀴틴화9의 상대적 수준의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 시스템은 PROTACS의 최적화를 유도하는 데 필수적이지만, E3 리가아제와 분해 표적 단백질 사이의 복합체 형성은 다단계 과정입니다10,11. 관련된 이원 및 삼원 상호 작용의 동역학 및 열역학은 효율성 유비퀴틴화와 단백질12,13,14의 결과적인 분해에 기여합니다.
본 명세서에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 PROTACS에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성화에 적응할 수 있는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 문헌 보고(13,15)로부터 유래되고 여기에 기술된 Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 MZ1 PROTAC 분자에 대한 SPR 및 ITC 프로토콜은 보고된 절차의 일부 수정을 통해 보고된 결과를 요약할 수 있었으며, 이에 대해 논의될 것이다. MZI, Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 평가하는 데 사용되는 BLI 분석에 대한 설명이 이 보고서에 포함되어 있습니다. BLI의 친화도 측정은 SPR 및 ITC에서 관찰된 것과 일치했습니다. p53 의존적 방식으로 발현이 유도되는 Ser/Thr 단백질 인산가수분해효소인 PPM1D와 CRBN 사이의 PROTAC 유도 삼원 복합체 형성을 평가하기 위해 SPR 분석이 개발된 이전에 발표된 프로토콜도 설명됩니다. 이 경우 PROTAC 분자는 PPM1D에 대해 나노몰 친화도를 갖지만 CRBN에 대해서는 마이크로몰 친화도만 갖습니다. 이 경우 CRBN에 대한 PROTAC 분자의 결합은 포화되지 않아 일반적으로 관찰되는 "후크 효과"가 발생합니다. 갈고리 효과(hook effect)는 두 종이 모두 가교 분자에 결합될 때 이종 삼합체 복합체를 형성할 수 있는 세 가지 신체 시스템의 특성입니다(그림 1)17. 갈고리 효과는 가교 종이 다른 두 종에 비해 과도하게 집중되어 있을 때 관찰됩니다. 결과 상태는 이항 상호 작용이 삼항 상호 작용을 능가하는 상태입니다. 후크 효과가 관찰되는 시스템에는 이 보고서에서 논의된 특정 실험 설계 고려 사항이 필요합니다. PROTAC 유도 삼원 복합체 형성 평가를 위한 생물물리학 분석의 활용을 평가하기 위한 일반 개념 및 시약 요구 사항이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>96-플레이트</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>바닥이 평평하고 BLI 실험에 사용되는 검은색 플레이트</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>73520-120</td><td>ITC 샘플 준비에 플레이트 사용</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>650101</td><td>SPR 실험을 위한 샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>자동 iTC200 마이크로 열량계</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>ITC 실험을 수행하는 데 사용되는 기기입니다. 제품 단종.</td></tr><tr><td>Biacore S200</td><td>Cytiva</td><td>29136649</td><td>SPR 실험 수행에 사용되는 기기,</td></tr><tr><td>MZ1</td><td>ProbeChem</td>, <td>VHL 및 Brd4BD2</td>NTA 센서 칩에 결합하는 <td>PC-60099</td> PROTAC</tr>, <tr><td></td><td>Cytiva</td><td>BR100532</td> SPR 칩, PPM1D Octet Red-384 Sartorius <td>Instruments와 관련된 SPR 실험을 수행하는 데 사용되는 SPR 칩</td></tr><tr><td></td><td></td>, BLI 실험을 수행하는 데 사용되는 기기.<td></td><td> 제품 단종.</td></tr><tr><td>플레이트 커버</td><td>Malvern</td><td>PQA0001</td><td>Nunc 96-well 플레이트(73520-120)용</td></tr> <tr><td>커버</td><td>Cytiva</td><td>28975816</td><td>Greiner 플레이트(650101)용 플레이트 커버,</td></tr> <tr><td>시리즈 S SA 센서 칩</td><td>Cytiva</td><td>BR100531</td><td>MZ1:VHL:BRD4</td></tr><tr><td>Streptavidin (SA) 딥 앤 리드 바이오 센서</td>와 관련된 SPR 실험을 수행하는 데 사용되는 SPR 칩 <td>Sartorius</td><td>18-509</td><td>BLI에 사용되는 코팅 센서 실험</td></tr></tbody></table>

단백질 분해 표적 키메라(protacs)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

분해를 표적으로 하는 E3 리가아제와 단백질은 다단계 공정에서 이종 이작용 분자에 의해 복합체를 형성하도록 유도될 수 있습니다. 관련된 상호 작용의 역학 및 열역학은 유비퀴틴화의 효율성과 결과적으로 단백질의 분해에 기여합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 생물물리학 기술은 이러한 상호 작용의 최적화에 사용할 수 있는 귀중한 정보를 제공합니다. 두 가지 모델 시스템을 사용하여 삼원 복합체 형성의 협력성과 결합 역학에 대한 '후크 효과'의 영향을 이해하기 위한 생물물리학 분석 도구 키트를 확립했습니다. 한 사례에서, Brd4BD2와 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTAC) 분자를 평가하였다. 이종 이작용 분자 MZ1은 Brd4BD2 단백질(SPR KD = 1nM, ITC K D = 4nM)과 VHL 복합체(SPRKD = 29nM, ITC K D = 66nM) 모두에 대해 nM 친화도를 갖습니다. 이 시스템을 위해 삼원 복합체 형성의 협력성을 입증하는 발표된 결과를 재현하는 강력한 SPR, BLI 및 ITC 분석이 개발되었습니다. 다른 경우에는 46.0kDa 단백질, PPM1D 및 세레블론[CRBN(319-442)] 사이의 삼원 복합체를 유도하는 분자를 연구했습니다. 이종 이작용 분자인 BRD-5110은 PPM1D에 대해 SPR KD = 1nM이지만 잘린 CRBN(319-442) 복합체(SPR KD= ~ 3μM)에 대한 결합은 훨씬 약합니다. 이 경우 SPR에서 CRBN에 대한 바인딩이 포화 상태가 아니므로 "후크 효과"가 발생했습니다. SPR, BLI 및 ITC에 대한 처리량 및 시약 요구 사항을 평가하고 PROTAC 프로젝트에 적용하기 위한 일반적인 권장 사항을 제공했습니다.

VHL: MZ1 이원 복합체 및 VHL: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체의 특성 분석은 매우 유사한 버퍼를 사용하여 그림 2(ITC), 그림 3(BLI) 및 그림 4(SPR)에서 찾을 수 있습니다. 직교 분석에서 추출한 KD는 일관성이 있습니다. 협력성은 K D (이진) / KD (삼항)로 계산할 수 있으며, 이는 매우 양수 (ITC에서 15 또는 SPR에서 26)입니다.
CRBN:PROTAC의 특성화: PPM1D 시스템은 SPR에 의해 수행되었습니다(그림 5A-D). CRBN은 삼원 복합체 형성의 관찰을 용이하게 하기 위해 ~35RU에 고정되었습니다. PROTAC의 바인딩 단독으로 노이즈보다 낮은 &lt;2RU의 신호가 생성되었습니다. 분석물의 PPM1D는 SA 칩 표면에 높은 백그라운드 신호를 제공하며, 적용할 수 있는 최고 농도는 약 1μM입니다. 이 값은 CRBN과 탄두 사이의 KD≥3μM)보다 낮으므로 "후크 효과"가 예상됩니다. SPR은 이를 감지할 수 있을 만큼 민감하며, 이는 시뮬레이션과 잘 일치합니다(그림 5E). 시뮬레이션은 문헌19의 비협조 평형을 고전적인 SPR 계산[반응최대 = (반응 리간드 × 질량고정화)/질량리간드]와 결합하여 수행되었습니다. CRBN과화합물 사이의 KD는 고농도에서 화합물의 불용성으로 인해 정확하게 측정되지 않기 때문에 시뮬레이션은 1μM, 3μM, 10μM 또는 30μM의 4가지 추정 KD를 사용하여 수행되었습니다. 실험 결과는 시뮬레이션된 3μM와 10μM 곡선 사이에 있었는데, 이는 쌍성계의 KD와 거의 동일하여 협력성이 없음을 시사합니다.
<img alt="결합 협력 다이어그램; KD&lt;sub&gt;&lt;/sub&gt; 이진/삼항, 후크 효과 차트; 단백질 상호작용 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 세 가지 바인딩 시나리오 및 다양한 KD의 정의에 대한 그림. (A) 고전적인 2성분 시스템. (B) PROTAC의 한쪽 끝이 포화될 수 있는 3액형 시스템으로, 2액형 시스템으로 평가될 수 있다. (C) "후크 효과"가 관찰되는 3 성분 시스템. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="단백질-리간드 분석을 위한 결합 상호 작용 열역학을 보여주는 등온 적정 열량계 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: ITC 결과. VHL을 MZ1(왼쪽) 또는 MZ1:Brd4BD2 복합체(오른쪽)로 적정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="동역학 그래프 결합; 응답 대 시간; 평형 상수; 단백질 상호 작용 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: BLI 결과. MZ1은 VHL: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체의 형성을 매개합니다. (A) 원시 데이터. (B) [MZ1] = 0인 배경 신호의 빼기. (C) k on, koff 및 KD를 추출하기 위한 B의 동역학 피팅. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="표면 플라즈몬 공명 차트, 동역학 데이터 결합; Kd 값, 이진 및 삼항 복합체 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: SPR 결과 . (A) VHL에 대한 MZ1 바인딩. (B) VHL에 대한 MZ1:Brd4BD2 바이너리 복합 결합. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="결합 분석을 위한 RU 반응 대 화합물 농도를 보여주는 표면 플라즈몬 공명 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65718/65718fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 대표적인 PPM1D-PROTAC의 "후크 효과"를 보여주는 SPR 결과. CRBN은 SA 칩 표면에 고정된 반면 [PPM1D]는 모든 경우에 대해 분석물에서 1μM로 유지되었습니다. (A) CRBN에만 결합하는 화합물인 BRD-2512는 거의 반응이 없습니다. (B) PPM1D에만 결합하는 화합물인 BRD-4761도 반응이 없습니다. (씨,디) BRD-5110은 BRD-2512의 CRBN 탄두와 BRD-4761의 PPM1D 탄두를 가진 PROTAC으로 삼원 복합체의 형성을 유도했습니다. (E) CRBN과 화합물 사이의KD 가 1μM(검은색), 3μM(파란색), 10μM(빨간색) 또는 30μM(녹색)이라고 가정한 SPR 결과의 시뮬레이션. BRD-2512 곡선은 3μM에서 10μM 사이이며, 이는 측정된바이너리 KD에 매우 가깝기 때문에 협력성이 없음을 시사합니다(협력성 = 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65718/65718fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

우리의 연구는 확립된 모델 시스템을 복제하고, 추가 분석을 통해 검증하고, 특정 연구 맥락에 맞게 이러한 방법론을 조정하는 데 중점을 둡니다. 다양한 프로젝트에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식을 시연하는 것을 목표로 합니다. 현재의 실험적 과제는 프로젝트별 요구 사항 및 기존 지식 격차에 따라 적절한 분석 형식과 조건을 전략적으로 선택하는 라이센싱입니다.이는 실험에서 효율적이고 정확한 답을 얻는 데 필수적입니다. 당사의 프로토콜은 다양한 ProTech 시스템에 원활하게 적응할 수 있도록 간소화된 접근 방식을 제공합니다. 또한 각 방법에 대한 철저한 평가를 수행하여 각각의 장단점을 강조합니다.특정 조건에 따라 가장 적합한 형식을 선택하는 방법에 대한 정보에 입각한 지침을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을...

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

이 프로토콜은 표적 단백질에 융합된 항체가 없는 내인성 단백질 검출 태그를 발현하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 조작된 살아있는 세포에서 단백질 분해 역학의 정량적 발광 검출을 설명합니다. 정량적 분해 파라미터, 속도, Dmax, DC 50 및 Dmax50을 계산하고 얻기 위한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

전계 효과 바이오 센싱 (FEB)은 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨이없는 기술입니다. 결합 표적이 고정되는 그래핀 바이오센서를 통해 전류를 측정한다. FEB 기술은 Hsp90과 Cdc37 사이의 생체 분자 상호 작용을 평가하는 데 사용되었으며 두 단백질 간의 강력한 상호 작용이 검출되었습니다.

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

배우세요 PROTACS 유도 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성화를 위한 SPR, BLI, ITC 방법을. 이 프로토콜은 VHL 및 CRBN 계열의 표적 단백질 분해 연구에 활용됩니다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

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