Name: Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: 배우세요 마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 분리하고 체외 확장하는 방법을. 다중 분화 능력과 염증 조절 효능을 확인하여 치료 적용 가능성을 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) 및 Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11)의 보조금으로 지원되는 연구. 이 연구는 PROPP UESC(073.6764.2019.0021079-85)의 일부 재정 지원을 받았습니다. MGAG와 URS는 각각 FAPESB(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia)와 CAPES(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)에서 수여하는 장학금 덕분입니다.

마우스 부고환에서 유래한 지방 조직 유래 줄기 세포의 1차 배양

<ol><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Pittenger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+perspective%3A+cell+biology+to+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress.</a> npj Regen Med. 4, 22(2019).</li>
<li>Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+cancer%3A+Clinical+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities.</a> BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).</li>
<li>Mazini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hopes+and+limits+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSCs%29+and+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing.</a> Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanisms+of+mesenchymal+stem+and+stromal+cells+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).</li>
<li>Uccelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue-derived+small+extracellular+vesicles+promote+soft+tissue+repair+through+modulating+M1-to-M2+polarization+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).</li>
<li>Maffioli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+primed+by+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines.</a> J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-stem-cell-induced+immunoregulation+involves+FAS-ligand-%2FFAS-mediated+T+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.</a> Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+mesenchymal+stem+cells+in+immunomodulation%3A+pathological+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications.</a> Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+vs.+autologous+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+in+their+medication+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice.</a> Cell Biosci. 11, 187(2021).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+and+promises+of+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+use+as+a+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).</li>
<li>Jurado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+as+part+of+therapy+for+chronic+graft-versus-host+disease%3A+A+phase+I%2FII+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study.</a> Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosome-educated+macrophages+alleviate+systemic+lupus+erythematosus+by+promoting+efferocytosis+and+recruitment+of+IL-17%2B+regulatory+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).</li>
<li>Fernández, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28AdMSC%29+for+the+treatment+of+secondary-progressive+multiple+sclerosis%3A+A+triple+blinded%2C+placebo+controlled%2C+randomized+phase+I%2FII+safety+and+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study.</a> PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).</li>
<li>Abdolmohammadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+therapy+as+a+new+therapeutic+approach+for+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation.</a> Life Sci. 312, 121206(2023).</li>
<li>Hoang, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for human diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue.</a> Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).</li>
<li>Strem, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue+derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Kern, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Dominici, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Berryman, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone%27s+effect+on+adipose+tissue%3A+Quality+versus+quantity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Miranda, V. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+damage+in+schistosomiasis+is+reduced+by+adipose+tissue-derived+stem+cell+therapy+after+praziquantel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment.</a> PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primary+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).</li>
<li>Boregowda, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).</li>
<li>Sreejit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Cells. 10 (12), 3433(2021).</li>
</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

MSC는 다양한 조직에서 추출할 수 있습니다. 골수가 쥐와 인간 모두에서 MSCs의 공통 공급원을 나타내고 있음에도 불구하고25,26, 우리는 MSC가 풍부하고 신체에 분포하며 접근이 용이하기 때문에 이 연구에서 지방 조직과 함께 작업하기로 결정했습니다. 대안으로, 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸화 세포를 생성할 수있다 27.
추출의 일부 포인트는 여기에 공유된 프로토콜의 성공을 위해 특별한 주의를 기울일 가치가 있습니다. 먼저, 무균 상태에서 수행해야 하는 조직 채취에 대한 주의를 강조합니다. 따라서 수술을 시작하기 전에 쥐를 70% 알코올로 적절하게 소독했는지 확인하십시오. 또 다른 중요한 점은 동일한 핀셋과 가위를 사용하여 부고환 지방 조직을 집어내지 않도록 하여 오염원을 피하는 것입니다. 
두 번째 관심사는 조직 처리입니다. 원추형 튜브의 조각은 37°C에서 10분 동안 배양하여 적절하고 세게 흔들어야 합니다. 다음 날과 2-3일마다 매체를 교체하는 것이 매우 중요합니다. 매일 배양을 관찰하고 배지 색상, 세포 모양 및 배양 환경의 간섭을 확인하는 것이 좋습니다. 
세 번째 우려 사항은 MSC 특성화를 위한 최적의 시간/경과에 관한 것입니다. 여기에서는 세포의 세 번째 통로에서 수행하는 것이 좋지만 필수는 아닙니다. 연구의 목적에 따라 다릅니다. 세 번째 단락에서는 MSC로 특성화된 세포의 약 80%를 가지고 있으며, 이는 예를 들어 이 연구의 목표에 충분합니다. 표현형 특성 분석은 조혈 마커(예: CD34 및 CD45) 및 중간엽 마커(예: CD29, CD73, CD90 및 CD105)의 발현을 분석하여 수행됩니다. 또한, 국제세포유전자치료학회(International Society for Cell and Gene Therapy, ISCT)21 는 ADSC가 섬유아세포와 유사한 형태를 가져야 하며 배양 플랫폼의 플라스틱에 부착되어야 한다고 강조합니다. 형태는 성장하는 배양 중에 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 기능적 특성 분석은 ADSC가 조골세포, 지방아세포 및 연골아세포 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 분석하여 수행됩니다. 표현형 특성 분석에서 중간엽 및 조혈 마커의 비율은 동물 종 및 세포 공급원에 따라 달라질 수 있으며, ISCT에서 권장하는 수치를 완전히 충족하지 못할 수 있습니다. 예를 들어, ISCT는 인간 MSC의 경우 CD105, CD73, CD90의 ≥95%, CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79a 또는 CD19의 ≤2%를 인간 백혈구 항원 - DR 동형(HLA-DR)21을 권장합니다. 또한, 기능적 특성 분석을 수행하고 조골세포, 연골세포 및 지방세포 계통으로 분화하는 세포의 다능성을 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 계통 중 적어도 두 개는 다능성을 증명하기 위해 권장됩니다. 
이러한 강조된 사항 외에도 여기에서 제안하는 일부 분석법(예: Von Kossa 염색 대신 Alizarin Red S, Alcian Blue 대신 Periodic Acid Shiff, 유세포 분석 대신 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 대체할 수 있습니다. 
인체에서 나타나는 세 가지 유형의 지방 조직(백색, 갈색, 베이지색) 중에서 백색 지방 조직은 MSCs의 공급원이 가장 높다28. 이 조직은 여기에 보고된 부고환 위의 지방과 같은 피하, 복부 및 서혜부 영역에서 얻을 수 있습니다. 여기에 공유된 프로토콜에 사용된 콜라겐분해효소에 의한 물리적 단편화 및 효소 소화는 처리 중에 고갈되는 지방세포를 제외한 많은 세포 유형으로 구성된 기질 혈관 분획(SVF)을 유도합니다. 
결론적으로, MSC의 공급원으로 지방 조직을 사용하는 주요 이점은 항염증 및 재생 특성으로서의 MSC의 치료 잠재력과 관련된 세포 분리 방법의 풍부함과 용이성을 포함합니다.

중간엽 줄기 세포(MSC)는 조골세포, 연골아세포, 지방세포 1,2와 같은 세포로 분화하는 성체 다전위 세포입니다. 이 세포는 여러 장기에 존재하기 때문에 골수, 근육, 지방, 모낭, 치아 뿌리, 태반, 진피, 주위, 탯줄, 폐, 간 및 비장과 같은 성인 조직에서 추출할 수 있습니다 3,4.
MSC가 생리학 및 면역 체계에 미치는 영향은 5,6으로 보고되었습니다. 이 세포는 인간 및 수의학 모두에서 여러 질병을 치료하는 데 유망했습니다. MSC는 세포-세포 접촉, 용해성 인자 및 작은 세포외 소포체와 같은 다양한 메커니즘을 통해 염증을 제어하고 혈관 신생 및 조직 항상성을 촉진할 수 있습니다 7,8,9,10. 또한, MSC는 면역학적으로 양립할 수 없는 동종 이식 수혜자에서 생존할 수 있는 면역 특권 세포인데, 이는 이들 세포가 클래스 I 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 발현이 낮고 동종 이식을 위한 세포 기반 치료에 사용되기 때문입니다11,12. 낮은 면역원성과 재생 잠재력이 결합된 MSC는 이식편대숙주병(GvHD)13, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)14 및 다발성 경화증15 등과 같은 세포 치료에 이상적인 후보입니다16,17.
MSC가 여러 성인 조직에 존재한다는 사실에도 불구하고, 지방 조직은 최소한의 외과적 개입으로 수확에 대한 접근성과 같은 다른 공급원에 비해 이점을 제공합니다. 높은 팽창률을 가진 많은 수의 사용 가능한 셀; 특정 장비 및 저비용 재료 없이 수행하기 쉬운 프로토콜을 사용하여 체외 확장이 용이합니다 18,19,20. 추출한 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)는 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy, ISCT)에서 정한 대로 특성화해야 합니다21. 따라서 MSC는 엔도글린(CD105), 엑토-5'-뉴클레오티다아제(CD73) 및 Thy-1(CD90)과 같은 중간엽 마커의 높은 비율(≥95%)을 발현하고, 백혈구 공통 항원(CD45), 막관통 인산지방단백(CD34), 당지질 고정 막 당단백질(CD14), 인테그린 알파 M(CD11b), B세포 항원 수용체 복합체 관련 단백질 알파 사슬(CD79α)과 같은 조혈 마커의 낮은 비율(≤2%)을 발현하는 형태학을 보여야 합니다. B-림프구 표면 항원 B4(CD19) 및 클래스 II 인간 백혈구 항원(HLA-II). 또한, 기능적 특성화가 필요하며, 세포는 조골세포, 연골아세포 또는 지방아세포로 분화할 수 있어야 한다21.
여기에서는 in vitro 연구를 위한 기계적 해리 및 효소 소화를 사용하여 부고환 지방 조직에서 MSC를 얻는 방법과 ISTT에 의해 preconized 형태학적 특성 분석을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>140 > C 고온 살균 CO2 인큐베이터</td><td>RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, 중국</td><td>C180</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴</td><td>시그마-알드리치, 샌루이스, 미주리, 미국</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 빙하</td><td>시그마-알드리치, 샌루이스, 미주리, 미국</td><td>PHR1748</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>A9186</td><td>BioReagent, 당단백질 검출에 적합합니다. 아세트산 1%, pH 2.5</td></tr><tr><td>알코올 70%</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>65350-M</td><td>70% 물</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>항체와 관련상품 anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>555005</td><td>세포의 기능: 접착 및 활성화, 배아 형성, 백혈구, DC, 혈소판, 비만 세포, 섬유아세포 및 내피 세포</td></tr><tr><td>항체 항-마우스 anti-CD34 PE (Clone RAM34)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>551387</td>세포 <td>내 기능: 세포 접착 인자. 조혈 줄기 세포</td></tr><tr><td>항체 항체 anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>559864</td>세포 <td>내 기능: 백혈구 활성화 지원</td></tr><tr><td>항체 anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>553266</td>세포 <td>내 기능: 세포 증식 중 철 흡수를 조절합니다. 증식 세포, 망상 적혈구 및 전구체</td></tr><tr><td>항체 anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>557266</td><td>세포의 기능: 신호전달, 접착. T 림프구, NK, 단핵구, HSC, 뉴런, 섬유아세포</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1008</td><td></td></tr><tr><td>Automatic pipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>4700850N</td><td>Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Not applicable</td><td></td><td>1 unit</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, 미국</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 (6-well)</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>Z707759</td><td>07 단위 멸균. TPP 조직 배양</td></tr><tr><td>플레이트세포 배양 플레이트(96-well. 원형 또는 V 하단)</td> <td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>CLS353077</td><td>01 유닛 멸균. Wells, 96, Tissue Culture (TC) 처리된 표면, 둥근 바닥 투명 웰, 멸균</td></tr><tr><td>연골 생성 매체</td><td>Stem Pro Chondrogenesis Differentiation&ndash; 생명 기술</td><td>A1007101</td><td>TGF-&beta; 2, TGF-&베타; 3, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, ITS, 나트륨-L - 아스코르브산염, 피루브산나트륨, 아스코르브산-2-인산</td></tr><tr><td>분해효소 II형 콜라겐분해효소 유형 II</td><td>Life Technologies, 캘리포니아, 미국</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄으로 덮인 코르크 또는 스티로폼 보드</td><td>해당 없음</td><td>1단위</td>면 해당 <td></td></tr><tr><td></td><td>없음</td><td></td><td>50g</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>해당</td><td></td> 없음 <td>03 units sterile</td></tr><tr><td>DPX Mountant for histology</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D5523</td><td>1000 mg/L 포도당 및 L-글루타민, 중탄산나트륨 없음, 분말, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>Eosin B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>861006</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (0.3mm x 13mm)</td><td>해당 없음</td><td></td><td>5 units</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, 미국 미주리</td><td>I0200000</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국</td><td>563935</td><td>H2O</td></tr><tr><td>케타민-D4 염산염 용액</td> 중 70% 시<td>그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국</td><td>K-006</td><td>1.0 mg/mL 메탄올(유리 염기), 인증 참조 물질, Cerilliant&reg;</td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>BR718620</td><td>브랜드 카운팅 챔버 BLAUBRAND Neubauer 패턴. 클립, 이중 괘</td></tr><tr><td>Nichiryo 피펫 팁(0.1&ndash; 10 &뮤; L)</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>Z645540</td><td>볼륨 범위 0.1&ndash; 10 &뮤; L, 길쭉한, 벌크 팩. 멸균</td></tr><tr><td>Nichiryo 피펫 팁 (1&ndash; 10 mL)</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>Z717401</td><td>부피 범위 1&ndash; 10 mL, 범용, 벌크 팩. 멸균</td></tr><tr><td>Nichiryo 피펫 팁 (200 &mu; L)</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>Z645516</td><td>최대 볼륨 200 &mu; L, 졸업, 미니 스택. 멸균</td></tr><tr><td>오일-레드 O 용액</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>O1391</td><td>0.5% in isopropanol</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>107.151</td><td>46&ndash; 48, 블록 형태</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치, 샌 루이스, 미주리, 미국</td><td>P4333</td><td>용액 안정화, 10,000 단위 페니실린 및 10 mg 스트렙토마이신/mL, 0.1 &mu; m 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 1x(PBS).</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>P3813</td><td>분말, pH 7.4, 1L 용액 준비용. 균형 잡힌 멸균</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 코니컬 튜브(15mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>멸균</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 코니컬 튜브(50mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>멸균</td></tr><tr><td>메스 2개(선택 사항)</td><td>해당 없음</td><td></td><td>1개</td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>소듐 티오설페이트</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>수술용 핀셋 (15 cm)</td> <td>적용되지</td><td></td> 않음 <td>3 유닛 멸균</td></tr><tr><td>스위스 남성 마우스 (6&ndash; 8주)</td><td>Bioterium, Santa Cruz State University</td><td>021/22</td><td></td></tr><tr><td>주사기(1mL)</td><td>해당 없음</td><td></td><td>1 unit</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>T8154</td><td>0.4%, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>트립신/EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-글리세로인산이 나트륨 염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>G9422</td><td>BioUltra, 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, &ge; 99%(적정)</td></tr></tbody></table>

isolation, in vitro expansion, and characterization of mesenchymal stem cells from mouse epididymal adipose tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue

중간엽 줄기 세포(MSC)는 주로 면역 반응을 조절할 수 있는 잠재력으로 인해 악화된 염증을 막기 위한 새로운 치료 접근법으로 광범위하게 연구되었습니다. MSC는 class I major histocompatibility complex(MHC) 분자의 낮은 발현과 동종 이식을 위한 세포 기반 요법의 사용을 기반으로 면역학적으로 호환되지 않는 동종 이식 수혜자에서 생존할 수 있는 면역 특권 세포입니다. 이 세포는 여러 조직에서 분리할 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 것은 골수와 지방 조직입니다. 당사는 마우스의 부고환 지방 조직에서 MSC를 분리, 배양 및 특성화할 수 있는 간편한 프로토콜을 제공합니다. 부고환 지방 조직은 외과적으로 절제하고 물리적으로 단편화한 후 0.15% 콜라겐분해효소 II형 용액으로 분해합니다. 그런 다음 1차 지방 조직 유래 줄기세포(ADSC)를 시험관에서 배양 및 증식하고 유세포 분석을 통해 표현형 특성 분석을 수행합니다. 또한 ADSC를 골형성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 세포로 분화하는 단계를 제공하고 각 세포 계통의 기능적 특성을 규명합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 in vivo 및 ex vivo 실험에 사용할 수 있으며, 대안으로 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸 세포를 생성할 수 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜에 따라 지방 조직에서 추출한 세포는 ISCT에서 제안한 MSC에 대한 최소 기준과 일치하는 형태를 보여주었습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 표현형적으로, ADSC는 세포 배양 초기에 플라스틱 및 섬유아세포와 유사한 형태에 대한 부착을 보여주었습니다(그림 2A). 게다가, 그들은 균질하게 성장하여 식민지를 형성했습니다. 또한, ADSC는 조혈 마커인 CD34(2.12%)와 CD45(1.81%)의 발현이 낮았고, 모든 중간엽 세포 마커인 CD71(42.6%), CD29(74.2%), CD90(55.1%)의 발현이 높았다(그림 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig02.jpg"> 그림 2: 지방 조직 유래 세포의 표현형 특성 분석. (A) 배양 2일, 4일, 8일째에 원형에서 섬유아세포와 유사한 형태로 변하는 ADSC 형태; 스케일 바 = 22.22 μm. (B) ASC에 의해 표현되거나(CD71, CD29 및 CD90) 표현되지 않는(CD34 및 CD45) 마커에 대한 히스토그램. 이 그림은 Miranda et al.24의 허가를 받아 복제되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
기능적으로, ADSC는 14일 또는 21일 동안 각 계통에 대해 조건화된 배지에서 배양했을 때 조골세포, 지방아세포 및 연골아세포로 분화할 수 있는 다능성을 보여주었습니다(그림 3). Von Kossa 염색은 골형성 과정의 특징인 세포외 기질에서 광물화된 결절을 드러냈습니다(그림 3). Oil-red O 염색은 ADSC의 세포질에서 지질 액포를 입증했으며, Alcian Blue 염색은 세포외 기질에 글리코사미노글리칸의 존재를 확인했습니다(그림 3). 표현형 및 기능적 특성은 부고환 지방 조직에서 추출한 세포의 집단을 MSC로 확인했습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig03.jpg"> 그림 3: 지방 조직 유래 세포의 기능적 특성 분석. 배양 14일 및 21일 후 ADSC의 골형성, 지방형성 및 연골형성 다계통 잠재력. 스케일 바 = 50 μm (상단 패널), 100 μm (중간 및 하단 패널). 이 그림은 Miranda et al.24의 허가를 받아 복제되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied as a new therapeutic approach, mainly to stop exacerbated inflammation due to their potential ...

제 연구는 여러 질병의 염증을 개선하기 위해 다른 치료법과 연관되거나 연관되지 않은 새로운 접근법 치료법으로 지방 유래 중간엽 줄기 세포에 중점을 둡니다. 우리는 지방 중간엽 줄기 세포를 프라지콴텔과 함께 사용하여 주혈흡충 만소니 감염에서 육아종 반응을 크게 제어했음을 입증하여 이 결합 치료 접근법의 이점을 강조했습니다. 본 프로토콜은 무균 질환 하에서 부고환 지방 조직을 꼼꼼하게 채취하는 과정에서 발생하는 물리적 처리와 격렬한 흔들림을 수반하는 연구 격차를 해결하고, 지방 유래 줄기세포를 활용하기 위한 최적의 시기를 식별합니다.당사의 프로토콜은 상당한 이점을 제공하며, 특히 중간엽 줄기 세포의 분리를 위한 풍부한 가용성과 잠재적 강도를 제공합니다. 또한 중간엽 줄기 세포는 항염증 및 조직 재생 능력을 포함한 강력한 치료 특성을 나타냅니다.

isolation-vitro-expansion-characterization-mesenchymal-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

배우세요 마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 분리하고 체외 확장하는 방법을. 다중 분화 능력과 염증 조절 효능을 확인하여 치료 적용 가능성을 평가합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석) (동영상) | JoVE Journal

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

더 많은 동영상 탐색