Name: 인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 학습하세요 hiPSC를 중간엽 기질세포로 분화하는 단층 배양법과 배아체 형성법을 비교하는 방법을. 두 기법의 골형성, 지방형성 및 연골형성 분화 능력을 분석하여 유전 질환 연구와 세포 치료에 활용할 수 있습니다.

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우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).

1. hiPSC 유지 보수
<ol><li>hiPSC의 해동<ol><li>액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).</li>
		<li>세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 104 cells/cm2).</li>
		<li>매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 통과<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
		<li>세포가 시트로 분해될 때(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 10μM Y-27632와 함께 1mL의 iPSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료합니다. 세포를 위아래로 2-3회 조심스럽게 피펫팅합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다. 참고: 통과 비율은 1:6에서 1:20(약 4 x 104 cells/cm2)이며 평균 응집 크기는 약 50-200μm입니다.</li>
		<li>매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 80%-90% 밀도(5-6일)까지 세포를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EB 형성을 통한 hiPSC와 MSC의 분화
참고: 이 방법은 이전 문헌 21,22,23,24에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
<ol><li>배지의 제조<ol><li>α-MEM에 1%(v/v) GlutaMAX, 10%(v/v) FBS, 10ng/mL FGF2 및 5ng/mL TGFβ를 보충하여 MSC 분화 배지를 준비합니다.</li>
		<li>α-MEM에 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2를 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 준비<ol><li>37°C, 80%-90% 밀도까지 5% CO2 까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).</li>
	</ol></li>
	<li>0일차: EB 형성<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
		<li>세포가 시트로 분해되면(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 2mL의 iPSC 유지 배지(10μM 암석 억제제 및 1:100 GFR- 세포외 기질 겔 포함)를 추가하여 분해를 종료합니다.</li>
		<li>세포를 6웰 낮은 부착 플레이트로 옮깁니다. 조직 배양 플레이트 2웰과 낮은 부착 플레이트 1웰의 비율로 세포를 파종합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 의 셰이커(60rpm/분)에서 24시간 동안 배양하여 구형 EB를 형성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1일차-7일차: EB 감별<ol><li>파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리기 튜브로 옮기고 (EB를 파괴하지 않고) EB가 RT에서 5-10 분 동안 자연적으로 침전되도록합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>EB를 2mL의 MSC 분화 배지가 있는 6웰 로우 부착 플레이트로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 7 일 동안 셰이커에서 EB를 배양하고 배지를 한 번 변경하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>8일차-17일차: EB 접종<ol><li>파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리 튜브로 옮기고(EB를 파괴하지 않고) EB가 5-10분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>EB를 2mL의 MSC 유지 배지가 있는 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 접착 후 정기적인 배지 교체로 90% 밀도(~10일)까지 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>18일차-27일차: MSC의 성숙 및 확장<ol><li>EB 유래 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).</li>
		<li>세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 MSC 유지 배지 2mL를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>젤라틴 코팅 배양 플레이트(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 배지에서 90% 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.</li>
		<li>MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 6일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 두 번 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 단층 배양을 통한 MSC와 hiPSC의 차별화
참고: 이 방법은 이전 문헌 25,26,27,28에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
<ol><li>배지의 제조<ol><li>α-MEM을 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2로 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>hiPSC의 준비<ol><li>37°C에서 5% CO2 가 50%-60% 밀도가 될 때까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).</li>
	</ol></li>
	<li>0일차-13일차: 직접 단층 배양에 의한 분화<ol><li>6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다.</li>
		<li>MSC 유지 배지 2mL를 직접 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 14일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>14일차-35일차: 반복 통과에 의한 MSC 성숙<ol><li>단층 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).</li>
		<li>세포가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>젤라틴으로 코팅된 배양 접시(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 관리 배지에서 90%의 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.</li>
		<li>MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 18일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 6회 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC의 표면 항원 분석
참고: 골수 유래 MSC의 표면 항원과 유사하게, hiPSC를 유도하는 MSC는 CD105, CD73 및 CD90을 발현하지만, CD45, CD34는 발현하지 않는다29. 또한 hiPSC를 음성 대조 세포로 사용할 수 있습니다. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC 및 hiPSC의 표면 항원 분석은 그림 2에 나와 있습니다.
<ol><li>hiPSC 구동 MSC를 37°C에서 해리 용액으로 2-3분 동안 처리합니다. hiPSC를 0.48mM EDTA 해리 시약으로 처리하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 해리 시약을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>세포가 단일 세포로 분해되면 배지(MSC에 MSC 유지 배지, iPSC에 iPSC 유지 배지)를 추가하여 분해를 종료합니다.</li>
	<li>셀 현탁액을 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>차가운 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>10 x 106 cells/mL의 차가운 10% FBS-DPBS(v/v) 용액에서 세포를 계수하고 재현탁시키고 100μL/튜브의 세포 현탁액(1 x 106 세포/튜브)을 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다.</li>
	<li>5μL의 인간 Fc 수용체 차단 용액을 100μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 비특이적 차단을 수행하기 위해 RT에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>2% FBS-DPBS(v/v) 용액의 차가운 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>100μL 세포에 5μL(1 테스트)의 anti-CD34-FITC와 5μL의 anti-CD45-APC를 추가합니다. 서스펜션. 다른 100μL 세포 현탁 튜브에 5μL(1 테스트)의 anti-CD73-APC, 5μL의 anti-CD90-FITC의 90 μL(1 테스트) 및 5 μL의 anti-CD105-PE를 추가합니다. 5μL의 인간 IgG1 동형 대조군 FITC, 인간 IgG1 동형 대조군 PE 및 인간 IgG1 동형 대조군 APC를 세 번째 100μL 세포 현탁 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다. 한편, 단일 염색 구슬을 준비합니다.</li>
	<li>차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>300μL의 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액을 추가하여 세포를 재현탁시키고 200 메쉬 스크린 필터를 통해 필터링합니다.</li>
	<li>유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. isotype control 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석하고 게이트를 설정합니다. 그런 다음 표적 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석합니다.</li>
</ol>5. hiPSC 유도 MSC의 골형성 분화
참고: hiPSC를 구동하는 MSC는 골형성 분화 전위가 있습니다(그림 3A, B). 골형성 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 10mM 베타-글리세로포스페이트 및 100μM 아스코르브산을 보충하여 골형성 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>1 x 105 MSC를 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 파종하고 60%-70%가 합류할 때까지 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 골형성 유도 배지를 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 14 일 동안 골형성 유도 배지에서 세포를 3 일마다 배지를 교체하여 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PFA를 제거합니다. RT에서 10분 동안 0.3mL의 DPBS로 세포를 헹구고 3회 반복합니다.</li>
	<li>DPBS를 제거하고 Alizarin red 염색액 0.2mL를 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>염색액을 제거하고 0.3mL DPBS로 세포를 상온에서 10분 동안 헹구고 3회 반복합니다.</li>
	<li>광학 현미경으로 칼슘 침착의 염색을 관찰합니다.</li>
</ol>6. hiPSC 구동 MSC의 지방 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 지방 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3C, D). 지방 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 1μM 덱사메타손, 1μM IBMX, 10μg/mL 인슐린 및 100μM 인도메타신을 보충하여 지방 생성 유도 배지를 준비합니다. α-MEM에 10% FBS와 10μg/mL 인슐린을 보충하여 지방 생성 유지 배지를 준비합니다.</li>
	<li>젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 1 x 105 MSC를 파종하고 세포 밀도가 90%에 도달할 때까지 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유도 배지를 추가합니다. 지방 유도 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 4 일 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유지 배지를 추가합니다. 지방 생성 유지 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 3 일 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>지방 세포 분화 및 성숙이 이루어질 때까지 6.3 및 6.4 단계를 2-3회 반복합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 제거하고 DPBS로 2회 헹굽니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 Oli Red O 염색제를 바르고 광학 현미경으로 지질 방울을 관찰합니다.</li>
</ol>7. hiPSC 구동 MSC의 연골 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 연골 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3E, F). 연골 분화에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다.
<ol><li>α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 10μM 아스코르브산, 1mM 피루브산나트륨, 50μg/mL 프롤린, 0.02nM 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3) 및 0.5μg/mL 골 형태 형성 단백질 6(BMP-6)을 보충하여 연골아세포 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>2.5 x 105 hiPSC 구동 MSC를 수집하고 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 세포를 1mL의 α-MEM에 현탁시킨 다음 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 0.5mL의 연골 유도 배지에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>뚜껑의 나사를 직접 풀고 37 ° C, 5 % CO2에서 3 일마다 연골 유도 배지를 교체하여 21 일 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 연골 분화 중에 매일 연골 펠릿(연골 펠릿을 파괴하지 않고)을 부유시킵니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 PBS 0.5mL로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>4% PFA 0.3mL를 넣고 24시간 동안 고정합니다.</li>
	<li>파라핀은 연골 펠릿을 내장한 다음 절편합니다(3μm). 톨루이딘 블루(1%) 섹션을 30분 동안 염색합니다.</li>
	<li>광학 현미경으로 세포외 연골세포 기질을 관찰합니다.</li>
</ol>

hiPSC-Driving MSC의 표면 항원 및 증식 능력 특성화

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</ol>

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이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 있었습니다. hiPSC 유래 MSC는 세포 형태(그림 1), 표면 항원(<strong clas...

중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9. 이러한 특성으로 인해 MSC는 재생 의학의 잠재적 후보가 될 수 있다10. 그러나, 체세포 조직 유래 MSC(st-MSCs)는 제한된 기증, 제한된 세포 증식 능력, 품질 변화 및 기증자로부터 병원체의 전염 가능성에 대한 생물학적 안전성 우려에 의해 제한된다11,12.
인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)는 전사인자(transcription factor)(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)로 재프로그래밍하는 성체 세포에서 유래하며, 이는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 유사한 기능을 갖는다13,14. 그들은 자가 재생이 가능하며 MSC를 포함한 모든 유형의 체세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. st-MSC와 비교하여 iPSC-MSC는 무제한 공급, 저렴한 비용, 더 높은 순도, 품질 관리의 편리성, 규모 생산 및 유전자 변형이 용이하다는 장점이 있습니다 15,16,17.
iPSC-MSC의 이러한 장점으로 인해 iPSC에서 MSC를 구동하는 다양한 방법이 보고되었습니다. 이러한 분화 방법은 두 가지 배양 방법론, 즉 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양(monolayer cultures)의 사용(11,18,19,20)을 중심으로 이루어졌다. 여기에서, 두 가지 방법론 각각에 대한 대표적인 접근법을 특징지었다. 또한, 시간, 비용, 증식 능력, MSC 바이오마커 발현 및 체외 분화 능력에 기반한 두 가지 대표적인 접근법 간의 비교도 이루어졌습니다.

<table><tbody><tr><td>Alizarin 레드 염색 키트</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>C0148S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD105 (PE)</td><td>Biolegend</td><td>323206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD34 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>343503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD45 (APC)</td><td>Biolegend</td><td>304011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD73(APC)</td><td>Biolegend</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD90 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Solarbio</td><td>A8100</td><td></td></tr><tr><td>BMP-6</td><td>Novoprotein</td><td>C012</td><td></td></tr><tr><td>탄산 이산화물 레벨 쉐이커</td><td>크리스탈</td><td>CO-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>보상 비즈</td><td>BioLegend</td><td>424601</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL 기술</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>ST1254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp; 매체</td><td>Servicebio</td><td>G4610</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>HAKATA</td><td>HS-FBS-500</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemcell</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>human IgG1 isotype control APC</td><td>BioLegend</td><td>403505</td><td></td></tr><tr><td>인간 IgG1 동형 제어 FITC</td><td>BioLegend</td><td>403507</td><td></td></tr><tr><td>인간 IgG1 이소형형 제어 PE</td><td>BioLegend</td><td>403503</td><td></td></tr><tr><td>Human TGF-&beta; 1</td><td>스템셀</td><td>78067</td><td></td></tr><tr><td>인간 TruStain FcX&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>ST1398</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Solarbio</td><td>SI9020</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>P3376</td><td></td></tr><tr><td>iPSC 유지 매체</td><td>STEMCELL Technology</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ITS 미디어 보충제</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>C0341-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, 성장 인자 감소</td><td>BD Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Oli Red O 염색 키트</td><td>Beyotime&nbsp; 생명공학</td><td>C0158S</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Solarbio</td><td>P0011</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3</td><td>Novoprotein</td><td>CJ44</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue staining kit</td><td>Solarbio</td><td>G2543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme(1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>초저 부착물 6웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-66</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>스템셀</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-MEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30265</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-글리세로포스페이</td>트 <td>Solarbio</td><td>G8100</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells)를 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C).
그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hiPSC가 shaker에서 24시간 동안 해리 및 배양된 후 균일한 구형 EB가 형성되었습니다. MSC의 분화 배지에서 배양 1일차부터 7일차까지 EB의 부드러운 가장자리가 거칠어지고 EB의 부피가 커졌습니다. 8일째부터 17일째까지, EB를 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6-웰 플레이트로 옮긴 후, EB는 점차적으로 플레이트에 부착되었고, 많은 부착성 단층 세포가 EB 주위에 ...

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

본 연구의 범위는 유전 질환의 메커니즘 및 치료 전략 연구입니다. 우리의 연구는 세포주, iPSC, 오가노이드 및 마우스와 같은 다단계 질병 모델을 기반으로 합니다. iPSC는 다른 모델에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다.환자의 iPSC와 후속 파생 세포 및 오가노이드는 환자와 동일한 게놈을 공유하며, 이는 많은 질병에 대한 환자 세포 및 모델 뱅크를 제공합니다. 또한, 환자로부터 확립된 iPSC의 방법은 상당히 성숙합니다. iPSC를 특정 세포와 오가노이드로 분화하는 방향으로 많은 과제가 남아 있으며, 현재 개발 중인 개발 메커니즘에 대한 심화된 이해가 현장에서 발생할 것입니다.

comparison-two-representative-methods-for-differentiation-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 대식세포를 생성하는 시험관 내 방법을 설명합니다. iPSC에서 대식세포 생성은 3단계로 발생합니다: (i) 현탁액에서 iPSC가 응집되어 중배엽 세포로 분화하는 3차원 배아체(EB)를 형성하고, (ii) 분화된 EB에서 대식세포 전구세포가 형성되고, (iii) 대식세포 전구세포가 성숙하고 기능적인 대식세포로 분화됩니다.

Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Macrophages

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

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여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 분화 된 세포 유형을 생성하는 것은 훌륭한 치료 약속을 보유하고 있지만 여전히 도전적입니다. PSC는 종종 적절한 신호 세트로 자극된 경우에도 차별화할 수 없는 고유한 무능력을 나타냅니다. 여기에 설명된 간단한 도구는 다양한 PSC 라인에서 다중 라인 차별화를 향상시키는 간단한 도구입니다.

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이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

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지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

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학습하세요 hiPSC를 중간엽 기질세포로 분화하는 단층 배양법과 배아체 형성법을 비교하는 방법을. 두 기법의 골형성, 지방형성 및 연골형성 분화 능력을 분석하여 유전 질환 연구와 세포 치료에 활용할 수 있습니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

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