Name: 인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 학습하세요 인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가 방법을. 해동 후 생체 에너지 매개변수가 변하지 않도록 세포를 안정적으로 보존하여 다기관 연구와 면역 기능 연구의 재현성을 높입니다.

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혈액 채취에 대해 Giessen-Marburg 대학병원의 임상팀에 감사드립니다. 이 작업은 Justus Liebig 대학에서 자금을 지원했습니다.

미토콘드리아 생물 에너지 분석을 위한 PBMC 수집 및 냉동 보관

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 생체 에너지 분석에 적합한 방식으로 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 동결 보존하는 수단을 제공합니다. 설명된 방법은 PBMC를 부드럽게 대량으로 분리할 수 있는 가능성을 제공하며, 높은 생존율과 생체 에너지 측정을 위한 충분한 세포를 제공합니다. 최소한의 중단에도 긴 분리가 발생하지만 후속 동결 보존을 통해 생체 에너지학의 시간 독립적인 측정이 가능하다는 단점이 있습니다. 이 방법을 사용하면 나중에 시료를 수집하고 측정할 수 있습니다. 또한 다기관 시험에서 샘플을 수집하고 중앙 위치에서 동시에 파라미터를 측정하는 데 적합합니다.
냉동 보존은 세포를 장기간 보관하고 나중에 측정할 수 있는 가능성을 제공합니다. PBMC의 분리는 약 2-3시간의 시간 소모적인 프로세스이며 한 번에 적은 수의 샘플만 채취할 수 있습니다. 한 명의 실험자가 품질 손실 없이 2명 이상의 개체로부터 신선한 PBMC를 동시에 분리하는 것은 불가능합니다. 신선한 세포로 후...

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 노화 과정이나 퇴행성 질환과 관련된 면역 및 생체 에너지 문제 연구를 포함하여 많은 과학 분야의 다양한 응용 분야에 사용됩니다 1,2. PBMC는 구성이 이질적이며 림프구(B 세포, T 세포 및 NK 세포), 단핵구 및 수지상 세포로 구성됩니다. 세포는 때때로 피험자 내에서 큰 개인차와 편차를 보이기 때문에 이러한 세포를 다루기 위한 표준화된 절차가 필요합니다. 분리물의 생존력 및 순도와 같은 중요한 매개변수는 취급을 위한 기본 요구 사항이며 수집 시간, 멜라토닌 수치, 피험자의 공복 여부 등과 같은 환경 요인의 영향을 추가로 받습니다 3,4.
PBMC의 생체 에너지학에 대한 연구를 바탕으로 여기서는 다른 방법에도 적합한 PBMC의 분리, 동결 보존 및 배양 방법을 설명합니다. 근육 생검은 미토콘드리아 에너지 대사의 황금 표준으로 간주되지만5 혈액 세포 검사는 빠르고 최소 침습적인 절차입니다. 이 외에도 점점 더 많은 연구에서 노화와 알츠하이머병(AD)의 미토콘드리아 기능 변화가 뇌뿐만 아니라 말초에서도 발생한다는 것을 시사합니다 6,7,8,9,10. 이 방법은 또한 당뇨병 및 비만을 포함한 다른 상태 및 질병에 대한 조사를 가능하게 한다 11,12,13. 다발성 경화증 환자의 유전자 발현 패턴은 일반적으로 면역 기능 및 영향을 분석할 수 있습니다 14,15,16.
PBMC는 일반적으로 산화적 인산화(OXPHOS)에 의존하여 아데노신 삼인산(ATP)17,18을 생성합니다. 따라서 PBMC는 대리자로서 광범위한 응용 분야를 포괄합니다. 이전 보고에서, PBMC의 에너지 대사는 미토콘드리아 기능의 초기 심부전19, 패혈성 쇼크20 또는 성별 관련 차이4와 같은 장기 기능 장애를 해결하는 데 사용되었다. PBMC의 동결 보존 분리 및 배양을 위한 일반화된 방법은 다른 기관에서 얻은 결과의 비교 가능성에 이점이 있습니다. 각 단계(21,22)에 대한 프로토콜에는 많은 변이가 있으며, 이 방법의 목표는 PBMC에서 생체 에너지 측정에 대한 지침을 제공하는 것이다.
이 기사에서는 PBMC에서 생체 에너지 파라미터를 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 인간 혈액에서 PBMC의 생체 에너지를 분리, 동결 보존 및 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 환자의 생체 에너지 매개변수를 결정하고 임상 맥락에서 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 측정을 적용하기 위해 연구자들은 신선한 혈액 샘플을 얻을 수 있는 환자 집단에 접근할 수 있어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 m 트리에탄올 아민 -HCl- 완충액 (pH = 8,0)</td> <td>자체 준비</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 트리에탄올 아민 -HCl 버퍼</td><td>자체 준비</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M 트리스 -HCl- 버퍼 (pH = 8,1)</td> <td>자체 준비</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.01 mM DTBB</td><td>자체 준비</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>10 % 트리톤 X-100</td><td>자체 준비</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>10 mM 옥살라세탓</td><td>자체 준비-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14&ndash; 20G 멸균 채혈 바늘 멀티 어댑터 Sarstedt Safety-Multifly</td><td>Sarstedt</td><td>156353_v</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG-70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 에탄올(EtOH)</td><td>자가 준비-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세틸-CoA</td><td>췌장 Applichem</td><td>A3753</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>알코올 물티슈</td><td></td><td></td><td>&nbsp;( 70% 이소프로필 알코올)</td></tr><tr><td>안티마이신 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아(bidest.)</td><td>MilliQ Academic(자체 제작)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6016949</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll Seperating Solution</td><td>Biochrom</td><td>6115</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛 MSC Advantage</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카르보닐시아니드-p-트리플루오로메톡시-페닐히드라존(FCCP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기 TC20 자동 세포 계수</td>기 <td>바이오-라드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 헤레우스 메가퓨지 16 R</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카운팅 슬라이드, 세포 계수기용 이중 챔버</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube Cryo.S</td><td>Grainer Bio-One</td><td>126263-2DG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37008</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102952</td><td></td></tr><tr><td>소독 스프레이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 장갑 라텍스, 고무 또는 비닐.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distrips (12.5 ml) DistriTips</td><td>Gilson</td><td>F164150</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS; 10x)</td><td>Gibco(Thermo Scientific)</td><td>15217168</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(EtOH 100%)</td><td>Carl ROTH GmbH & Co. KG</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Frezer(-80&deg; C)</td> <td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>홀더/어댑터&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 Midi 40 CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주입 주사기</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>MIR05</td><td>Self-prepared-Mr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Frosty 냉동 용기</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>10110051</tr><tr><td>멀티리더 CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질소 탱크 로케이터 6 플러스</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>옥살라세테이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>옥시그래프-2k</td><td>오로보로러스 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>피펫 성능 피펫 10&mu; L, 100 &뮤; L, 1000 &뮤; L</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로스웰 파크. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)</td><td>Gibco (Thermo Scientific)</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Carl ROTH GmbH & Co. KG</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>숙시네이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸페닐렌디아민(TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>지혈대/혈압 커프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸)아미노-메탄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108382</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Biochrom</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Vaccubrand GmbH & Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViewPlate-96</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005181</td><td></td></tr><tr><td>수조 WNB22</td><td>Memmert GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

진핵 세포의 생리적 기능은 주로 미토콘드리아가 제공하는 에너지에 의존합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 질환 및 노화와 관련이 있습니다. 산화적 인산화는 에너지 항상성 유지에 중요하기 때문에 결정적인 역할을 합니다. PBMC는 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 최소 침습 샘플로 확인되었으며 질병 상태를 반영하는 것으로 나타났습니다. 그러나 미토콘드리아 생체 에너지 기능의 측정은 인간 샘플의 여러 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 제한 사항은 채취한 샘플의 양, 종종 며칠에 걸쳐 분산되는 샘플링 시간 및 위치입니다. 수집된 샘플의 냉동 보존은 샘플의 일관된 수집 및 측정을 보장할 수 있습니다. 측정된 매개변수가 냉동 보존된 세포와 새로 준비된 세포 간에 비교할 수 있도록 주의해야 합니다. 여기에서는 이러한 세포에서 미토콘드리아의 생체 에너지 기능을 분석하기 위해 인간 혈액 샘플에서 PBMC를 분리하고 냉동 보존하는 방법을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 동결 보존된 PBMC는 갓 수확한 세포와 비교하여 세포 수 및 생존력, 아데노신 삼인산 수치 및 측정된 호흡 사슬 활성에서 약간의 차이만 보여줍니다. 설명된 제제에는 8-24mL의 인간 혈액만 필요하므로 임상 연구 중에 다중앙에서 샘플을 수집하고 현장에서 생체 에너지를 측정할 수 있습니다.

세포 생존율 및 수 성공적인 분리 및 동결 보존을 달성하려면 세포 수와 생존율이 최대한 높아야 합니다. 냉동 보존 전후에 세포를 계수하고 세포의 건강과 품질을 보장하기 위해 생존율을 결정합니다. 그림 3 은 냉동 보존 전과 후의 PBMC를 대표적으로 나타낸 것으로, 세포 수와 생존율은 거의 차이가 없습니다. 이는 PBMC의 성공적인 격리 및 보존을 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65730/65730fig03.jpg"> 그림 3: 세포 수 및 생존율에 대한 동결 보존의 효과. 테스트 그룹은 새로 분리된 PBMC가 있는 대조군과 1개월 동결 보존...

분리된 말초 혈액 단핵 세포는 면역 기능 및 장애, 대사 질환 또는 미토콘드리아 기능의 분석에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 전혈에서 PBMC를 준비하고 후속 냉동 보존을 위한 표준화된 방법을 설명합니다. 냉동 보존은 이 시간과 장소를 독립적으로 만듭니다.

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...

이 방법의 도움으로 해동 후 생체 에너지 매개변수가 변경되지 않는 방식으로 PBMC를 동결 보존하는 데 적합한 절차를 설명하고자 합니다. 냉동 보존의 주요 실험 과제 중 하나는 냉동 및 해동 과정이 PBMC를 손상시킬 수 있으며, 이는 다음과 같은 생체 에너지 측정에 영향을 미친다는 것입니다. 당사의 프로토콜을 통해 측정된 생체 에너지 매개변수가 영향을 받지 않도록 세포에 손상을 주지 않고 PBMC를 안정적으로 보존하는 방법을 보여주려고 합니다.PBMC를 보존할 수 있기 때문에 여러 센터에서 샘플을 수집하고 한 위치에서 측정할 수 있습니다. 또한 측정 시간을 더 독립적으로 만듭니다. PBMC의 냉동 보존을 통해 세포를 수집하고 보존하는 여러 부위에서 동시에 연구를 수행할 수 있습니다.수집된 샘플은 중앙에서 측정할 수 있습니다. 이를 통해 연구 프로세스와 계획을 간소화할 수 있습니다.

cryopreservation-bioenergetic-evaluation-human-peripheral-blood

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

여기서는 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 사이토카인시스 블록 소핵 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 소핵 분석을 위한 전혈의 이 최적화된 냉동 보존 방법은 대규모 샘플링 및 다기관 연구에 신뢰할 수 있는 기술이며 다른 혈액 관련 분석에도 사용할 수 있습니다.

냉동 보존된 전혈에 대한 소핵 분석

이 프로토콜은 유세포 분석 및 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석 및 워크플로우에 적합한 말초 혈액 단핵 세포를 수집, 보관 및 해동하기 위한 접근 가능한 가이드를 제공합니다. 플라즈마와 버피 코트 컬렉션도 시연됩니다.

전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

포유류의 복막 캐비티는 타고난 면역 반응에 중요한 다른 면역 세포 인구가 포함되어 있습니다. 효율적인 분리 방법은 이러한 세포의 생화 학적 및 기능적 분석이 필요합니다. 여기서 우리는 마우스의 복막 공동 세포의 격리를위한 포괄적인 방법을 제공합니다.

마우스 복막 구멍 세포의 분리

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 γδ T 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. PBMC - 파생 γδ T 세포는 자극과 zoledronate과 인터루킨 - 2 (IL - 2)를 사용 확장됩니다. γδ ​​T 세포의 대규모 확장이 암의 autologous 세포 immunotherapy에 적용할 수 있습니다.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

학습하세요 인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가 방법을. 해동 후 생체 에너지 매개변수가 변하지 않도록 세포를 안정적으로 보존하여 다기관 연구와 면역 기능 연구의 재현성을 높입니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

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