Name: 인체 골격근의 섬유 유형 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 MyDoBID 기법을 활용한 인체 골격근 섬유 유형 식별 방법입니다. 동결건조된 근육에서 단일 섬유를 분리하고 미오신 중쇄 동형체를 기반으로 I형과 II형 섬유를 분류하여 세포 수준에서 단백질 발현 차이를 분석할 수 있습니다.

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이 연구에 사용된 MHC I(A4.840) 및 MHCIIa(A4.74)에 대한 항체는 H. M. Blau 박사에 의해 개발되었으며 MHCIIx(6H1)에 대한 항체는 Dr. C. A. Lucas에 의해 개발되었으며 National Institute of Child Health and Human Development의 후원 덕분에 Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)에서 획득했으며 아이오와 대학교에서 유지 관리했습니다. 생명과학부(아이오와주 아이오와시티). 이 연구를 위해 인체 근육 샘플을 제공한 Victoria L. Wyckelsma에게 감사드립니다. 그림 1의 이미지 대부분은 BioRender.com 에서 가져온 것입니다.
자금: 이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.

MyDoBID- 근육 섬유 유형을 효율적으로 식별하기 위한 새로운 기술

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

섬유 수집 수년간의 경험을 바탕으로 대부분의 연구원은 이 기술을 마스터할 수 있습니다. 그러나 연습을 통해 다운스트림 분석을 위한 더 빠르고 효율적인 섬유 수집이 가능합니다. 풀링을 위해 품질의 단일 섬유 세그먼트 30개를 분리할 수 있으려면 샘플당 50개의 섬유 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다. 섬유 수집 비디오를 주의 깊게 연구하고 두 번의 연습 세션(세션당 ~50개의 섬유)을 수행한 후 합리적인 기준을 달성하는 것이 좋습니다. 수집된 모든 섬유는 섬유 유형을 식별하기 위해 MyDoBID를 거치며, 이를 통해 기술이 얼마나 효과적으로 수행되고 있는지 알 수 있습니다. 이는 광섬유 샘플에서 감지된 낮은 수의 '광섬유 없음' 또는 '희미한' MHC 신호로 볼 수 있습니다(프로토콜 섹션 5.1 참조).
근육은 MHCI와 MHCIIa가 모두 존재하는 하이브리드 섬유 또는 MHCIIa 및 IIx ...

골격근은 세포(섬유)가 느린 경련(유형 I)인지 빠른 경련(유형 II)인지에 따라 달라지는 뚜렷한 세포 대사 및 수축 특성을 가진 이질적인 조직입니다. 섬유 유형은 수축 시간, 단축 속도 및 피로 저항을 포함하여 여러 면에서 서로 다른 미오신 중쇄(MHC) 동형을 검사하여 식별할 수 있습니다1. 주요 MHC 동형에는 유형 I, 유형 IIa, 유형 IIb 및 유형 IIx가 포함되며 대사 프로파일은 산화(유형 I 및 IIa) 또는 해당작용(IIx, IIb)입니다1. 이러한 섬유 유형의 비율은 근육 유형과 종에 따라 다릅니다. IIb형은 설치류 근육에서 널리 발견됩니다. 인체 근육은 IIb형 섬유를 포함하지 않으며 주로 MHC 동형 I형 및 IIa 섬유로 구성되며 IIx 섬유의 비율은 적습니다2. 단백질 발현 프로파일은 섬유질 유형에 따라 다르며 노화3, 운동4,5 및 질병6에 따라 변경될 수 있습니다.
다양한 골격근 섬유 유형에서 세포 반응을 측정하는 것은 근육 균질화(모든 섬유 유형의 혼합)의 검사로 인해 종종 간과되거나 불가능합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯은 개별 근육 섬유에서 여러 단백질을 조사할 수 있습니다7. 이 방법론은 이전에 균질한 제제를 사용하여 얻을 수 없었던 새롭고 유익한 단일 섬유 특성을 생성하는 데 활용되었습니다. 그러나 원래의 단일 섬유 웨스턴 블롯 방법론에는 시간이 많이 걸리는 특성, 샘플 복제를 생성할 수 없음, 고가의 고감도 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약 사용 등 몇 가지 한계가 있습니다. 신선한 조직을 사용하는 경우 이 방법은 제한된 시간(즉, 1-2시간) 내에 개별 섬유를 분리해야 하는 시간 제약으로 인해 더욱 제한됩니다. 다행히도, 이러한 억제는 동결 건조된 조직으로부터 단일 섬유 분절을 분리함으로써 완화된다8. 그러나 동결 건조된 샘플에서 섬유를 수집하는 것은 생검 조직의 크기와 품질에 의해 제한됩니다.
도트 블로팅 방법(dot blotting method)9을 이용한 섬유 유형 식별은 이 포괄적인 프로토콜에서 상당히 정교화되고 확장되었다. 이전에, 2~10 mg의 습식 근육 조직이 동결 건조 및 단일 섬유 MHC 동형 단백질 분석에 적합하다는 것이 입증되었다9. Christensen et al.9은 ~1mm 섬유 세그먼트의 30%를 사용하여 도트 블로팅에 의해 존재하는 MHC 동형을 검출했으며, 이는 웨스턴 블로팅으로 확인되었습니다. 이 연구는 웨스턴 블로팅을 도트 블로팅으로 대체함으로써 전체 비용이 ~40배(50개 섬유 세그먼트의 경우) 감소했음을 보여주었습니다. 그런 다음 섬유를 유형 I 및 유형 II 샘플로 "통합"하여 실험적 복제를 허용했습니다9. 그럼에도 불구하고 한계는 유형 I(MHCI 양성) 및 유형 II(MHCII 양성 섬유)의 두 가지 섬유 유형 특이적 샘플만 획득되었으며 유형 II 샘플에는 MHCIIa와 MHCIIx 6,10의 혼합물이 포함되어 있습니다. 특히, 현재 프로토콜은 순수 IIx 유형 광섬유를 식별하는 방법을 보여주며 일반적인 프로토콜 문제에 대한 문제 해결 전략을 포함하여 매우 상세한 워크플로(그림 1에 요약됨)를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1x 변성 완충액</td><td>레시피에 따라 제조</td><td>구성 요소는 Sigma-Aldrich 또는 다른 화학 유통 회사에서 공급받을 수 있습니다</td><td>&nbsp; 1X 변성 완충액은 3X 변성 완충액 1을 1X Tris-HCl (pH 6.8)로 3 V / V로 희석하여 만듭니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>3x Denaturing buffer</td><td>레시피에 따라 제조</td><td>구성 요소는 Sigma-Aldrich 또는 다른 화학 분배기에서 출처를 찾을 수 있습니다.</td><td>3x denaturing buffer는 다음을 포함합니다: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.&nbsp; -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>N/A</td><td>100% 에탄올은 모든 회사에서 공급할 수 있으며</td><td>초순수 H2O로 95%로 희석합니다.</td></tr><tr><td>액틴 토끼 다클론 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>BSA 버퍼로 1/1,000을 희석합니다.</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>모델 번호: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Antibody enhancer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>제품명은 Miser Antibody Extender Solution NC입니다.</td></tr><tr><td>Beaker (100 mL)</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>모델 이름: Mini Spin.</td></tr><tr><td>차단 버퍼: 워시 버퍼에 5% 탈지유.</td><td>디플로마</td><td>스토어 구매</td><td></td></tr><tr><td>BSA 버퍼: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: 바이오-라드 연구소(Bio-Rad Laboratories). NaN3 : 시그마-알드리치&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>소 혈청 알부민(BSA), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 아지드화나트륨(NaN3). 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>카세트 개방 레버&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>프리캐스트 겔 카세트를 여는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP 이미저&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>모델 번호: Universal hood III</td><td>염색 방지 젤 이미징 기능이 있는 모든 이미징 시스템.</td></tr><tr><td>Criterion 블로터</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>아이스팩, 전사 트레이, 롤러, 카세트 홀더 2개, 여과지, 폼 패드 및 케이블이 있는 뚜껑이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (enhanced chemiluminescence)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>제품명: Clarity Max Western ECL Substrate.</td></tr><tr><td>전기영동 완충액 1x Tris Glycine SDS(TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>초순수 H2O로 10개 중 1개를 희석합니다.</td></tr><tr><td>여과지, 0.34mm 두께</td><td>의 Whatmann</td><td>3030917</td><td>벌크 크기 3MM, 100매, 315 x 335mm 포장.</td></tr><tr><td>미세조직 절개 겸자</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Jeweler' S 겸자 번호 5.</td></tr><tr><td>플랫 플라스틱 트레이/뚜껑&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>멤브레인을 놓을 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 표면이 완전히 평평한지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>동결 건조 시스템</td><td>Labconco 7750030</td><td></td><td>Freezone 4.5 L, 유리 챔버 시료 스테이지 포함.</td></tr><tr><td>냉동고 -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-80°C의 일정한 온도를 가진 모든 냉동고; C가 적합합니다.</td></tr><tr><td>겔 방출기는</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Slide를 멤브레인 아래로 밀어 멤브레인을 모으거나 이동시킬 1653320</td></tr>.<tr><td>회색 연필</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 이미지 랩 소프트웨어&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Figures는 소프트웨어 버전 5.2.1을 참조하지만 다른 버전도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1660521</td><td>37 &deg로 설정할 수 있는 모든 인큐베이터; C로 충분합니다.</td></tr><tr><td>램프</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반기 벼룩</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 롤러&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Transfer 번들 팩에서 구매할 수 있습니다. 그러나, 이 제품을 사용할 수 없다면, 멤브레인 위로 굴러갈 수 있을 만큼 충분히 긴 매끄러운 표면의 원통형 튜브로 충분합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브&nbsp; (0.6 밀리리터)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG HRP 보조</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>염소 안티 마우스 IgG(H+L), RRID AB_228341. 블로킹 버퍼에서 20,000분의 1로 희석합니다.</td></tr><tr><td>마우스 IgM HRP 보조</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>염소 안티 마우스 IgM 뮤 체인. 마우스 IgG와 동일한 희석액으로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain I (MHCI) 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1.</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1.</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain IIx(MHCIIx) 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1</td></tr>.<tr><td>니트로 셀룰로오스 멤브레인 0.45 &micro; 엠&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>웨스턴 블로팅용.</td></tr><tr><td>페트리 접시 뚜껑</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 핀셋</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>파워 팩&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050</td><td>제품명: 기본 전원 공급 장치.</td></tr><tr><td>단백질 래더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 - 180 kDa.</td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인 0.2 &마이크로; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>토끼 HRP 2차</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>염소 항토끼 IgG (H+L), RRID AB_228341. 희석은 마우스 2차 항체와 동일합니다.</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ruler</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>스트리핑 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>제품 이름: Restore Western Blot Stripping Buffer.</td></tr><tr><td>티슈(보푸라기 없음)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>제품명: Kimwipe.</td></tr><tr><td>전송 버퍼 (1x Tris Glycine 버퍼 (TG), 20% 메탄올)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; 메탄올 : Merck</td><td>TG 버퍼 : 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 메탄올 : 1.06018</td><td>초순수 H2O로 10x TG 버퍼를 1x로 희석합니다. 20 % 메탄올의 최종 농도에 100 % 메탄올을 첨가합니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>트랜스퍼 트레이</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV-활성화 프리캐스트 젤</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>젤 유형: 4&ndash; 15% Criterion TGX 염색 무료 단백질 겔, 26 웰, 15 &L.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>세척 버퍼 (1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Scientific&nbsp; 트윈 20: 시그마</td><td>&nbsp; BIOA0027-4L</td><td>1x TBST 레시피: 10x Tris-buffered saline(TBS)을 초순수 H2O로 1x로 희석하고 Tween 20을 첨가하여 최종 농도 0.1%를 만듭니다. 버퍼를 4°C로 저장합니다.</td></tr><tr><td>세척 용기</td><td>Sistema</td><td>Store에서 구입</td> 멤브레인의 <td>대략적인 치수에 맞는 모든 타파웨어 용기로 충분합니다.</td></tr></tbody></table>

인체 골격근의 섬유 유형 식별

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

여기에 설명된 기술은 도트 블로팅(dot blotting)을 사용하여 개별 근육 섬유의 세그먼트에서 특정 미오신 중쇄(MHC) 동형을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이하 MyDoBID(Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type)에 의한 Myosin 중쇄 검출이라고 합니다. 이 프로토콜은 인간의 골격근을 동결 건조시키고 단일 근육 섬유의 세그먼트를 분리하는 과정을 설명합니다. MyDoBID를 사용하여 유형 I 및 II 섬유는 각각 MHCI 및 IIa 특이적 항체로 분류됩니다. 그런 다음 분류된 섬유는 각 생검을 위해 섬유 유형별 샘플로 결합됩니다.
각 샘플의 총 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 및 UV 활성 겔 기술에 의해 결정됩니다. 섬유 유형의 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검증됩니다. 여러 웨스턴 블롯에서 표적 단백질 검출을 향상시키기 위해 단백질 로딩 정규화를 수행하는 것의 중요성도 설명합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯과 비교하여 분류된 섬유를 섬유 유형별 샘플로 통합하면 시료의 다양성, 시료 처리량 증가, 투자 시간 단축 및 비용 절감 조치의 이점이 있으며, 균질화된 근육 시료를 사용하여 자주 간과되는 중요한 섬유 유형별 정보를 유지할 수 있습니다. 프로토콜의 목적은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 분리된 유형 I 및 유형 II 섬유를 정확하고 효율적으로 식별하는 것입니다.
이러한 개별 섬유는 이후에 결합되어 유형 I 및 유형 II 섬유 유형별 샘플을 생성합니다. 또한, 프로토콜은 웨스턴 블로팅에 의해 IIx 섬유로 확인된 MHCI 및 MHCIIa에 대해 음성인 섬유에 대한 마커로 Actin을 사용하여 IIx 유형 섬유의 식별을 포함하도록 확장됩니다. 그런 다음 각 섬유 유형별 샘플을 사용하여 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 다양한 표적 단백질의 발현을 정량화합니다.

도트 블로팅을 사용한 개별 MHCI, MHCIIa 및 MHCIIx 근육 섬유 식별 MyDoBID의 특징은 주어진 광섬유에서 다양한 MHC 및 Actin 신호 강도 강도를 분류하는 것입니다(그림 4A). 섬유 유형은 MHCI 및 IIa 동형의 존재 유무에 의해 식별되었습니다(그림 4B). 6개의 섬유는 MHC 또는 액틴 검출이 나타나지 않았으며, 이는 수집된 섬유가 없음을 나타냅니다. 이 특정 도트 블롯의 결과는 22개의 유형 II 섬유, 7개의 유형 I 섬유 및 3개의 잠재적인 유형 IIx 섬유의 식별이었습니다. 2개의 미확인 샘플과 6개의 샘플이 '섬유질 없음'으로 분류되었습니다(그림 4B, C). 검출 가능한 MHCI 또는 MHCIIa 신호가 없지만 Actin에 대해 양성인 섬유는 제거 과정을 통해 잠...

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

우리의 연구는 느리거나 빠른 경련 섬유를 특징으로 하는 독특한 대사 및 수축 특성을 가진 세포로 구성된 골격근을 중심으로 합니다. 우리는 이러한 차이에 기여하는 요인을 탐구하고 노화, 운동 및 다양한 질병의 맥락에서 그 의미를 탐구합니다. 다양한 골격근 섬유의 세포 반응을 측정하는 것은 종종 간과되거나 근육 균질액 검사로 인해 불가능합니다.MyDoBID 기법을 사용하면 이전에는 측정할 수 없었던 섬유질 유형의 단백질 차이를 반복적으로 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 유형 1 및 유형 2 근육 섬유를 정확하고 효율적으로 식별합니다. 이 새로 개정된 방법은 연구자들이 세포 수준에서 골격근의 단백질 차이를 조사할 수 있는 간단한 접근 방식을 제공합니다.특히, 유형 2 X 섬유의 식별을 용이하게 하며, 이는 역사적으로 구별하기가 어려웠습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 찾기 어려운 유형 2 X 섬유를 포함하여 모든 섬유 유형을 밝힐 수 있습니다. MyDoBID 기법을 사용하면 이제 수많은 질문에 답할 수 있습니다.예를 들어, 제2형 X 근섬유의 특성을 발견하고, 노화나 질병 중에 제2형 X 근섬유의 우선적 위축을 나타내는 증거가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 특정 운동 개입이 각 섬유 유형에 어떤 영향을 미치는지 관찰할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 세포 내 글리코겐 분포를 시각화하고 정량화하기 위해 인간 골격근 조직의 샘플 준비와 투과 전자 현미경을 위한 염색을 보여줍니다.

인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

여기에서는 개선 된 염색 품질함으로써 자동 취득하고 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용 ImageJ에 섬유 집단의 정량화를 허용 빠른 근섬유 분석을위한 프로토콜을 제시한다.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

이 기술 보고서는 섬유 손상을 제한하는 근육 티비알리스 전방의 생검을 위한 수정된 Bergström 기술의 변형을 설명합니다.

기계적 평가를 위한 인간 근육 티비아리스 전방의 우수한 구획에서 골격 근육 생검 의 컬렉션

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

우리는 지방산을 정제할 필요 없이 지방산을 식별할 수 있는 프로토콜을 제안합니다. 머무름 시간에 대한 정보와 지방산 유도체의 세 가지 유형, 즉 지방산 메틸 에스테르(FAME), 4,4-디메틸 옥사졸린 유도체(DMOX) 및 3-피리딜카르비닐 에스테르(피콜리닐)의 질량 스펙트럼을 결합합니다.

지방산의 확인 시험<em&gt; 바실러스 세레 우스</em

배우세요 MyDoBID 기법을 활용한 인체 골격근 섬유 유형 식별 방법입니다. 동결건조된 근육에서 단일 섬유를 분리하고 미오신 중쇄 동형체를 기반으로 I형과 II형 섬유를 분류하여 세포 수준에서 단백질 발현 차이를 분석할 수 있습니다.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

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