Name: 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 Drosophila 유충 신경근 접합부와 근육 세포에서 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을. 공초점 현미경과 면역염색을 활용하여 신경계 미세소관 조절 단백질을 연구하고 신경발달 및 신경질환의 기전을 규명합니다.

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원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Ying Xiong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립과학재단(NSFC)이 C. M.(31500839)에 제공한 보조금으로 지원됩니다.

1. 유충 해부
알림: 해부 용액 혈림프 유사 식염수(HL3.1)18 및 고정 용액 4% 파라포름알데히드(PFA)19,20은 온도가 너무 낮을 때 미세소관이 해중합되기 때문에 실온에서 사용됩니다.
<ol><li>길고 뭉툭한 집게로 방황하는 3번째 인스타 유충을 골라냅니다. HL3.1로 세척하고 실체현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다. 참고: 방황하는 3번째 인스타 유충은 분지된 전방 나선으로 식별되며 약 96시간(25°C)21에서 튜브 주위를 기어 다닙니다.</li>
	<li>등쪽이나 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 두 개의 긴 기관으로 등쪽을 식별하고 복부 치아 벨트로 복부를 식별합니다.<ol><li>관찰할 조직에 따라 등쪽 또는 복부 절개를 선택하십시오. 이렇게 하면 특정 관심 영역을 보다 정확하고 자세하게 볼 수 있습니다. NMJ 및 근육 세포 관찰을 위해 유충 등쪽과 복부 부위를 각각 절개합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>입 고리와 꼬리를 고정합니다. 핀을 조정하여 유충을 확장된 상태로 유지합니다. HL3.1 한 방울을 유충에 떨어뜨려 유충이 마르지 않도록 합니다. 알림: Ca2+ -free HL 3.1은 해부 중 근육 수축을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 뒤쪽 끝 가까이에 작은 가로 절단을 하되 뒤쪽 끝을 자르지 마십시오. 그런 다음 복부 정중선을 따라 앞쪽 끝을 향해 자릅니다.</li>
	<li>유충의 네 모서리에 4 개의 곤충 핀을 삽입하십시오. 유충이 모든 방향으로 최대한 늘어나도록 곤충 핀을 다시 조정하십시오.</li>
	<li>집게를 사용하여 근육을 손상시키지 않으면서 내부 장기를 제거합니다.</li>
</ol>2. 고정
<ol><li>100μL의 PFA(4%)를 추가하여 사체가 해부 접시에 고정되어 있는 동안 사체를 40분 동안 담그십시오. 주의 : PFA는 위험하므로 피부와의 직접적인 접촉이나 흡입을 피하기 위해 효과적인 보호 조치를 취합니다.</li>
	<li>핀을 분리하고 샘플을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 0.2% Triton X-100(0.2% PBST)을 함유한 1x 인산염 완충 식염수로 PFA를 헹구어 15rpm의 탈색 셰이커에서 10분 동안 2mL 미세 원심분리기 튜브를 채웁니다. 세탁 과정을 5회 반복합니다.</li>
</ol>3. 면역세포화학
<ol><li>사체를 차단제(0.2% PBST에 5% 염소 혈청)에 담그고 실온에서 40분 동안 차단합니다.</li>
	<li>차단제를 제거하고 4°C에서 밤새 0.2% PBST로 희석한 200μL의 1차 항체(예: anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50)로 교체합니다. 단클론 항α-튜불린(anti--tubulin)으로 면역염색을 통해 근육 미세소관을 시각화합니다. Anti-Futsch는 NMJ의 미세소관 형태를 간접적으로 반영할 수 있습니다.</li>
	<li>1차 항체를 배양한 후 0.2% PBST로 유충을 10분 동안 세척하고 5회 반복합니다.</li>
	<li>0.2% PBST로 희석한 200μL의 2차 항체(예: goat anti-Mouse-488, 1:1000)로 유충을 어두운 곳에서 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음으로, 어두운 곳에서 미세소관을 염색할 때 3605:1000 농도의 TO-PRO(R) 3 요오드화물(T20,22)과 같은 핵 염료를 배양 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>2차 항체와 핵 염료를 0.2% PBST로 10분 동안 헹굽니다. 어둠 속에서 5회 반복합니다.</li>
</ol>4. 장착
<ol><li>유충 사체를 유리 슬라이드에 0.2% PBST로 놓고 실체현미경으로 조정합니다. 유충 사체의 내부 표면이 위를 향하고 모든 유충 사체가 원하는 대로 배열되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>물티슈로 과도한 PBST 용액을 흡수하고 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 추가합니다.</li>
	<li>슬라이드에 커버슬립을 놓아 해부된 유충을 천천히 부드럽게 덮어 기포가 생기지 않도록 합니다.</li>
	<li>커버슬립 주위에 손톱 광택제를 바릅니다. 형광 감쇠를 줄이기 위해 슬라이드를 어두운 공간에 놓으십시오.</li>
</ol>5. 이미지 취득
<ol><li>이미지를 획득하려면 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(개구수 1.42) 또는 이와 유사한 것을 선택하고 실험에 따라 레이저 출력과 파장을 조정합니다.</li>
	<li>NMJ를 식별하려면 세그먼트 A4의 근육 3에서 이미지를 캡처합니다( 그림 1F의 위치 참조). 488nm 레이저를 선택하여 α-tubulin 또는 Futsch를 활성화하고 543nm를 선택하여 HRP 이미징 트랙을 활성화합니다. 파라미터를 800픽셀 x 800픽셀의 프레임 크기, 2.0의 디지털 줌, 0.8μm의 이미징 간격(NMJ)으로 조정합니다(그림 2).</li>
	<li>근육의 미세소관을 식별하려면 기관 가지가 더 적기 때문에 세그먼트 A3-A5( 그림 1G의 위치 참조)에서 근육 2의 이미지를 캡처합니다. α-튜불린을 활성화하기 위해 488nm 레이저를 선택하고 T3605 이미징 트랙을 활성화하기 위해 635nm 레이저를 선택하십시오. 파라미터를 1024픽셀 x 1024픽셀의 프레임 크기, 3.0의 디지털 줌, 근육 세포의 이미징 간격 0.4μm로 조정합니다(그림 3).</li>
</ol>

Observation Microtubule networks in Drosophila Neuromuscular junctions and muscle cells(초파리 신경근 접합부 및 근육 세포의 미세소관 네트워크 관찰)

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

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여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 방지하려면 세척 및 배양 중에 셰이커의 속도가 15rpm을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한 NMJ 형태를 선명하고 완벽하게 촬영하기 위해서는 피부 확장에 대한 정밀한 제어가 필요합니다. 항체 농도, 고정, 차단 및 배양 시간을 최적화하기 위해 예비 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 고정 시간은 약 40분으로 제한됩니다. 너무 짧거나 너무 길면 미세소관 네트워크의 면역염색에 도움이 되지 않습니다.
뉴런의 미세소관은 조밀하게 밀집되어 있어 기존 현미경으로 명확하게 시각화하기 어렵습니다. ...

미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.
뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다6. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.
신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유 사이에 형성된 말초 시냅스로, 시냅스 구조와 기능을 연구하기 위한 우수하고 강력한 모델 시스템이다7. Futsch는 포유류에서 발견되는 미세소관 결합 단백질 MAP1B와 상동적인 초파리의 단백질입니다8. 그것은 뉴런에서만 발현되며 NMJ의 시냅스 버튼 8,9의 발달에 중요한 역할을합니다. 야생형에서 NMJ 공정의 중심을 따라 흐르는 사상 다발은 anti-Futsch를 사용한 면역염색을 통해 시각화됩니다. NMJ의 말단에 도달하면, 이 다발은 미세소관으로 구성된 고리를 형성하거나 사상 구조를 잃게 되어, 확산 및 반점 모양(10)을 형성할 수 있다. 미세소관 고리는 일시 중지된 성장 원뿔과 관련이 있으며, 이는 미세소관 배열이 안정적임을 시사한다11. 따라서 Futsch 염색을 통해 NMJ에서 안정적인 미세소관 발달을 간접적으로 확인할 수 있습니다. 초파리 유충의 근육 세포의 크기가 크기 때문에 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 미세소관 네트워크의 안정성에 영향을 미치는 요인은 미세소관의 밀도와 모양을 분석하여 찾을 수 있습니다. 동시에 근육 세포의 미세소관 네트워크 상태를 NMJ 결과와 교차 검증하여 보다 포괄적인 결론을 얻을 수 있습니다.
미세소관의 네트워크와 역학을 조사하기 위해 많은 프로토콜이 사용되었습니다. 그러나, 이러한 연구들은 종종 시험관 내 연구(in vitro studies)12,13,14,15,16에 초점을 맞추었다. 대안적으로, 일부 생체내 실험은 세포골격(17)을 검출하기 위해 전자 현미경을 이용하였다. 형광 표지된 항체 또는 화학 염료가 단백질 또는 DNA에 특이적으로 결합하는 것에 따르면, 여기에 제시된 방법을 사용하면 생체 내 개별 뉴런 수준에서 NMJ의 미세소관 네트워크를 검출할 수 있으며, 결과는 근육 세포의 관찰에 의해 확증됩니다. 이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구와 결합할 때 간단하고 안정적이며 반복 가능하여 생체 내 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 다양한 표현형 검사 및 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>향상된 퇴색 방지 장착 매체</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat 안티 마우스 항체, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>레이저 컨포칼 현미경 LSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-Futsch 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank&nbsp; &nbsp;</td><td>22C10</td><td>묽게 된 1:50</td></tr><tr><td>마우스 안티-&알파;-튜불린 항체</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td>묽은 1:1,000</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Wako</td><td>168-20955</td><td>최종 농도: PB 완충액</td></tr><tr><td>스테인리스강 Minutien Pins</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>0.1mm Diam</td></tr><tr><td>Stereomicroscope SMZ161</td><td>Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>입체 형광 현미경 BX41</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>텍사스 레드-콘공이티드 염소 안티-HRP</td><td>잭슨 면역 연구</td><td></td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 요오드</td><td>인비트로젠</td><td>T3605</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>전사 탈색 쉐이커 TS-8</td><td>Kylin-Bell 실험실 기기</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>핀셋&nbsp;</td><td>듀몽</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.

우리는 신경근 접합부(NMJ)와 근육 세포 모두에서 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 단계별 절차를 시연했습니다. 개략도(그림 1A-E)에 따라 해부한 후 면역염색을 수행하고 레이저 컨포칼 현미경 또는 입체 형광 현미경(그림 1F,G)으로 이미지를 관찰 및 수집합니다.
NMJ의 시냅스 전후 미세소관 조직 모두 항α-튜불린으로 표지할 수 있으며, 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 층 두께를 선택하여 다양한 절편의 미세소관 형태를 표시할 수 있습니다(그림 2A-C). Futsch는 또한 뉴런의 축삭에 있는 미세소관 조직을 밝혀 신경 추적에 사용되었습니다. Anti-HRP는 신경 세포막 10,23,24를 표시하는 데 사용됩니다.<sup c...

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

현재 미세소관 역학은 EB1과 같은 미세소관 결합 단백질을 통해 간접적으로 관찰됩니다. 알파벳 튜불린 헤테로이디머는 세포질에 풍부하기 때문에 직접 접히기 때문에 인접한 튜불린 헤테로다이머는 생체 내 미세소관 네트워크의 역학이 부족합니다. 당사의 프로토콜은 신경근 시냅스와 근육 세포의 미세소관을 시각화합니다.Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구와 결합하면 다양한 표현형 검사 및 생체 내 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝이 가능합니다. 우리의 연구는 세포골격과 신경 발달 사이의 관계와 신경 질환에 대한 영향에 중점을 둡니다. 우리는 세포골격 조절 단백질이 뉴런에 미치는 영향을 강조함으로써 신경 발달의 메커니즘과 신경 질환에 대한 단형성을 발견하기를 희망합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 해부하다하는 방법을...

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

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Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

학습하세요 Drosophila 유충 신경근 접합부와 근육 세포에서 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을. 공초점 현미경과 면역염색을 활용하여 신경계 미세소관 조절 단백질을 연구하고 신경발달 및 신경질환의 기전을 규명합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

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