SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발
2023년 11월 10일
일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.
이 분석의 전반적인 목표는 SARS-CoV-2, MERS, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B와 같이 일반적으로 순환하는 호흡기 바이러스를 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 접근법을 관리하는 것입니다. 우리 분야의 발전을 주도하는 지배적인 기술에는 CRISPR, 측면 유동 아미노 분석, 종이 기반 생체 분자 센서, 단일 냄비에서 Sherlock 테스트, DNA 압타머 및 루프 매개 등온 증폭과 통합된 다중 RT-qPCR이 포함됩니다. 램프. 그러나 멀티플렉스 RT-qPCR은 가장 민감하고 일반적이며 다양한 바이러스를 진단하기 위한 황금 표준입니다. 현재 실험적 과제는 10개 미만의 RNA 사본을 검출하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 확립하는 것입니다.
분석을 위해 자체 RT-qPCR 키트를 사용했는데, 이는 시간과 비용 효율적입니다. 시작하려면 DNA/RNA가 없는 물에서 RT-qPCR을 위한 2x 완충액을 준비합니다.완충액을 추가로 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 다음으로, 프라이머와 프로브를 1.5ml 튜브에 혼합합니다.
용리 완충액으로 부피를 보충한 다음 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 얼음 위에 1.5ml 튜브에 taq 중합효소와 MMLV-RT가 혼합된 효소 혼합물을 준비합니다. Taq 중합효소 보관 버퍼로 부피를 구성합니다.
이제 바이러스 합성 RNA를 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액이 있는 별도의 튜브에 재현탁하여 마이크로리터당 10-6번째 RNA 사본을 저장합니다. 바이러스 스톡을 혼합하려면 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 B를 각각 5마이크로리터씩 Tris-EDTA 완충액 50마이크로리터에 추가합니다. 마찬가지로 SARS-CoV-2와 MERS-CoV를 혼합하여 두 번째 바이러스 혼합물을 얻습니다.
두 혼합물을 모두 10배 희석하여 마이크로리터당 10개의 RNA 복제의 최종 희석을 얻습니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 2x 버퍼, 프라이머, 효소, DNA/RNA가 없는 물 및 해당 RNA 혼합물을 피펫으로 주입합니다. 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉합니다.
그런 다음 플레이트를 1분 동안 원심분리하여 웰 바닥에 액체를 수집합니다. 다음으로, 실험 유형이 표준 곡선으로 설정된 고속 96웰 블록 유형을 수용하도록 PCR 기계를 프로그래밍합니다. 시약을 TaqMan 시약으로 설정하고 표준 실행 속성을 선택합니다.
유전자 표적과 리포터 염료를 정의합니다. 그런 다음 테스트할 각 반응에 대한 샘플 이름을 정의하고 타겟 및 샘플을 플레이트 레이아웃에 할당합니다. 이제 사이클 프로그램을 기기에 입력합니다.
플레이트를 올바른 방향으로 실시간 QPCR 기계로 옮기고 run을 눌러 사이클을 시작합니다. 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택합니다. 그런 다음 QPCR 프로그램에서 제공하는 증폭 플롯을 검토합니다.
개발된 두 개의 키트는 반응당 10개의 RNA 사본으로 세 가지 표적 유전자를 모두 동시에 성공적으로 증폭할 수 있었습니다. 모든 바이러스 적정에 대한 증폭 효율은 99% 이상이었습니다.
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개요
본 연구에서는 SARS-CoV-2, MERS 및 다양한 인플루엔자 변종을 포함한 일반적인 호흡기 바이러스를 동시에 검출하도록 설계된 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트의 개발을 제시합니다. 이 키트들은 비용 효율적이고 시간 효율적인 접근 방식을 통해 전문 실험실의 진단 능력을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 호흡기 바이러스 검출
- RT-qPCR 기술
- 멀티플렉스 분석법 개발
배경
- 호흡기 바이러스의 신속하고 민감한 진단의 필요성.
- 현재 검출 기술의 한계점.
- 동시 검출을 위한 다중 분석법 접근 방식의 중요성.
사용된 방법
- 자체 개발 RT-qPCR 키트
- 바이러스 RNA 검출
- 특이적 프로브를 결합한 멀티플렉스 RT-qPCR
주요 결과
- Influenza A 및 B와 더불어 SARS-CoV-2 및 MERS를 성공적으로 검출하였습니다.
- 반응당 10 copy의 낮은 RNA copy 수에서도 증폭을 달성하였습니다.
- 표적 유전자에 대해 99% 이상의 높은 증폭 효율을 입증하였습니다.
결론
- 개발된 RT-qPCR 키트는 호흡기 바이러스의 다중 검출에 효과적입니다.
- 본 연구는 바이러스학 연구에서 보다 향상된 진단 전략 수립에 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
SARS-CoV-2, Influenza A/B 및 MERS-CoV를 대상으로 하는 멀티플렉스 실시간 RT-qPCR 분석법은 탐색 및 중개 연구에서 동시 유행하는 호흡기 바이러스를 신속하고 민감하며 특이적으로 검출해야 하는 중요한 요구를 충족합니다. 이러한 분석법은 바이러스 표적의 높은 신뢰도 구분을 가능케 하여, 강력한 표적 검증을 지원하고 초기 단계의 진단법 개발 시 모호성을 줄여줍니다. 이를 통합함으로써 감염병 위협에 집중하는 R&D 포트폴리오 전반의 예측 신뢰도와 운영 효율성을 높일 수 있습니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 호흡기 질환 모델의 기능적 검증을 위해 바이러스 표적을 정밀하게 분석할 수 있습니다.
- 복잡한 시료 내에서 밀접하게 연관된 바이러스 병원체를 구별함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 진단 및 치료 프로그램의 표적 선정과 우선순위 결정에 있어 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 항바이러스 화합물이나 진단법의 하위 스크리닝을 위한 검증된 멀티플렉스 분석 시스템을 준비합니다.
- 분석 벤치마킹 및 최적화를 위해 표준화되고 재현 가능하며 정량적인 결과물을 제공합니다.
- 후보 중재 방안의 신속한 평가를 위해 확장 가능한 고처리량 스크리닝 준비 상태를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 여러 호흡기 바이러스를 동시에 검출함으로써 중개 바이오마커 전략과 부합합니다.
- 강력하고 정량적인 바이러스 검출을 제공하여 발굴 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 질환 관련 시스템에서 정확한 병원체 식별을 보장함으로써 후보 물질 개발 과정의 리스크를 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
Multiplex RT-qPCR 분석법은 발견 단계부터 전임상 단계에 이르는 연속 과정에 적합하며, 감염병 포트폴리오를 위한 초기 가설 검증, 분석법 개발 및 중개 연구를 지원합니다.
- 발견 생물학: 가설 기반의 바이러스 표적 검증을 위한 고감도 검출 기능을 제공합니다.
- 스크리닝: 어세이 표준화 및 화합물 평가를 위한 재현 가능하고 정량적인 결과값을 제공합니다.
- 분석: 비교 분석을 위한 강력한 증폭 데이터와 특이성 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 연구 단계 전반에 걸친 바이오마커 일치 및 연속성을 가능하게 합니다.
- 기업 내 재사용: 다양한 R&D 환경에서 다중 바이러스 검출을 위해 재사용 및 조정이 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 바이러스 검출의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 진단 워크플로우의 표준화, 재현성 및 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 병원균의 조기 및 정확한 구분을 가능하게 하여 go/no-go 의사결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 감염병 프로그램의 위험 조정 우선순위 설정 및 발전을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 분자 바이러스학 및 정량 PCR 분석 설계에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 실시간 PCR 장비 및 분석 소프트웨어 인프라에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 분석 설정, 데이터 해석 및 품질 관리를 위해 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 시료 유형이나 신종 바이러스 변이체에 따른 조정이 필요할 수 있습니다.
- 성능은 소스에서 뒷받침되는 프라이머/프로브 특이성 및 RNA 품질에 따라 달라집니다.
