X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화
2023년 8월 25일
이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.
안녕하세요, 우리 팀은 세포막을 가로지르는 단백질 손실 유형을 연구하고 있으며, 의학 및 생물학과의 관계를 살펴보고 있습니다. 특히, 우리는 ATP가 그 기능을 구동해야 하는 특정 단백질을 살펴보고 있으며, 그 이름은 ATP 결합 카세트 수송체라고 합니다. 특히, 우리는 그들의 근본적인 구조, 기능 관계를 살펴본 다음 이를 사용하여 많은 만성 질환, 특히 심혈관 질환을 이해합니다.
멤브레인 단백질 정제의 복잡성과 네이티브 온도에서의 안정성으로 인해 3D 단백질 결정을 얻는 것이 이 분야의 주요 과제이며 약물 발견 응용 분야도 제한됩니다. 우리 팀은 막 수송체 단백질의 구조 연구를 위한 Cryo-EM 및 X-Ray 결정학 방법을 확립했습니다. 그리고 이전에 우리 연구실은 최초의 인간 ABCG5/G8 의무 이종체의 결정 구조를 아포 상태와 콜레스테롤 결합 상태 모두에서 해결했습니다.
우리의 결과는 저분자 약물 발견 또는 약물 용도 변경에 돌파구를 제공할 수 있습니다. 3D 단백질 결정을 얻으면 단백질 및 리간드 복합체의 공결정화를 위한 담금 실험도 가능합니다. 우리 실험실은 ATP 의존성 지질 수송 단백질에 의한 지질 인식 및 전위의 분자적 기초를 결정하는 것을 목표로 합니다.
또한 ABC 수송체의 분자 역학 및 구조적 측면을 연구하기 위한 약물 개발의 새로운 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다.
개요
본 프로토콜은 행잉 드롭(hanging-drop) 결정화법을 위한 바이셀(bicelles)을 활용하여 스테롤 수송체 ABCG5/G8을 결정화하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 간단하며 다양한 실험실 환경에 적용 가능하도록 설계되어, X선 결정학을 통한 단백질 구조 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 구조생물학
- 막 수송 단백질
배경
- ABCG5/G8은 지질 운송에 관여하는 ATP-결합 카세트 수송체입니다.
- 이 단백질의 구조를 이해하는 것은 만성 질환, 특히 심혈관 질환에 대한 통찰을 얻는 데 매우 중요합니다.
- 막 단백질 정제의 어려움은 신약 개발 노력을 저해하는 요소입니다.
- 이전 연구들을 통해 다양한 상태의 ABCG5/G8 결정 구조가 밝혀졌습니다.
연구 목적
- ABC 수송체에 의한 지질 인식 및 전위의 구조적 기초를 조사하기 위함입니다.
- 막 수송 단백질과 관련된 신약 개발을 위한 새로운 방법론을 개발하기 위함입니다.
- 단백질-리간드 상호작용 연구를 위한 공결정화 실험을 가능하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 환원적 메틸화를 통한 단백질 분획의 화학적 수식.
- 단백질 정제를 위한 니켈 NTA 컬럼의 사용.
- 결정화를 위한 B-세포 스톡 용액의 조제.
- 결정화 셋업을 위한 현수적 증기 확산법.
주요 결과
- ABCG5/G8의 성공적인 결정화가 1~2주 이내에 관찰되었습니다.
- 데이터 수집에 적합한 결정의 크기는 통상적으로 50 microns × 100 microns × 2 microns였습니다.
- 본 방법론을 통해 지질 상호작용 및 약물 개발에 관한 추가 연구가 가능합니다.
- 이 결과는 ABC 수송체의 구조-기능 관계를 이해하는 데 기여합니다.
결론
- 본 프로토콜은 ABCG5/G8 구조를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 연구 결과는 관련 질환의 신약 개발 발전에 기여할 수 있습니다.
- 향후 연구는 지질 운송 메커니즘의 역동성을 탐구하는 데 집중할 예정입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
지질 바이셀 환경에서 ABCG5/G8의 고해상도 구조 규명은 막 단백질 신약 개발의 결정적인 병목 지점을 해결합니다. 이러한 접근 방식은 표적 검증의 예측 신뢰도를 높이며, 수송체 중심 포트폴리오의 메커니즘적 리스크 감소를 지원합니다. ABC 수송체의 안정적인 결정화는 구조 기반 리간드 설계를 가능하게 하며, 초기 단계의 스크리닝 의사 결정을 가속화합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 원자 수준의 해상도로 ATP 의존성 지질 수송체 메커니즘의 분석을 가능하게 합니다.
- 바이셀(bicelle) 환경에서 단백질의 천연 구조를 유지함으로써 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 만성 질환과 관련된 수송체 표적의 메커니즘적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 가설 기반의 포트폴리오 우선순위 선정을 위한 구조적 템플릿을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 리간드 소킹 및 공결정화 연구에 적합하며 검증된 단백질 결정을 제공합니다.
- 재현 가능한 다운스트림 스크리닝 워크플로를 위해 막 단백질 준비 과정을 표준화합니다.
- X-선 결정학을 통한 단백질-리간드 상호작용의 정량적 평가를 가능하게 합니다.
- 수송체 타겟 화합물 라이브러리를 위한 확장 가능한 분석법 개발을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 심혈관 연구에서 구조적 통찰을 질환 관련 수송체 기능과 연계합니다.
- 분자적 발견부터 수송체 조절제의 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 바이오마커 및 기전 연구에 정보를 제공하여 중개 연구의 위험을 줄입니다.
- 수송체의 구조-기능 관계를 기반으로 한 전임상 모델의 합리적 설계를 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 바이셀(bicelle) 기반 결정화 방법은 초기 표적 검증부터 리드 화합물 도출 및 전임상 연구에 이르는 신약 개발 연속 과정에 통합됩니다.
- 발견 생물학: ABC 수송체 기능에 대한 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 구조 기반 스크리닝 및 리간드 평가를 위해 재현성 있는 고품질 결정을 제공합니다.
- 분석: 리간드 결합 상태와 apo 상태를 비교하기 위한 정량적 구조 판독을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 분자 구조를 질병 관련 수송체 활성 및 바이오마커 정렬과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 신약 개발 파이프라인에서 다양한 막 단백질을 결정화할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 수송체 표적 검증에서 예측 신뢰도를 높이고 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 재현성과 확장성을 위해 막 단백질 결정화 과정을 표준화합니다.
- 전략적 가치: 수송체 중심 프로그램에서 go/no-go 결정에 정보를 제공하고 자본 효율성을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 수송체 표적의 위험 조정 우선순위 지정 및 구조 기반 자산의 발전을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 막 단백질 정제 및 결정화 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- X선 회절 및 단백질 특성 분석을 위한 분석 인프라 접근이 필요합니다.
- 바이셀(bicelle) 조제 및 결정화 프로토콜의 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 서로 다른 운반체(transporter) 패밀리나 지질 조성에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 일부 시스템에서는 단백질의 안정성과 수율이 처리량과 확장성을 제한할 수 있습니다.
