Name: 쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 쥐 폐 정맥의 미세 해부 및 면역형광 염색법을 통해 심방세동 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 심근 슬리브 조직 분석과 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 독일 심혈관 연구 센터(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), 중국 장학위원회(CSC201808130158 to R.X.), 독일 연구 재단(DFG; 혈관 의학 임상 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.), Corona Foundation(S199/10079/2019 to SC).

Revealing Murine Pulmonary Veins Myocardial Architecture

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜을 통해 쥐 심장의 PV를 구별 및 분리하고 면역형광 염색을 수행하는 방법을 공유합니다. 장기 적출 후, 심장과 폐를 멸균된 자당 용액에서 탈수한 후, 현미경 유도 하에 심방과 폐엽에서 심실을 분리하였다. 그 후, 심장 베이스는 PV를 시각화하기 위해 준비되었으며, 그 후 hilum에서 폐에서 PV를 절단했습니다. 후속 면역형광 염색은 조직을 O.C.T. 화합물에 매립하고, 빙정체로 절단하고, cTNT 및 Cx43에 대한 면역형광 염색을 수행함으로써 냉동 기법을 사용하여 수행되었습니다.
PV를 분리하는 것은 심방세동 부정맥 발생에서 PV의 역할을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 마우스의 PV 분리는 까다롭습니다. PV는 크기가 작을 뿐만 아니라 주요 기관지와 심장 기저부의 눈에 띄는 혈관 뒤에 숨겨져 있어 검출이 매우 복잡합니다. 이 프로토콜은 쥐 PV를 조사할 수 있는 간단하고 투명한 방법을 제공하며 형태학적 특성을 자세히 연구할 수 있는 경제적 접근 방식을...

심방세동(AF)은 가장 흔한 지속 부정맥이다1. 심방세동 유병률은 더욱 증가하여 2060년에는 유럽에서 ~1,790만 명의 환자가 발생할 것으로 예상됩니다1. 심방세동은 심근경색, 심부전 또는 뇌졸중의 발병에 필수적인 위험 요소이기 때문에 임상적으로 매우 중요하며, 이는 엄청난 개인적, 사회적, 사회경제적 부담을 초래한다1. 심방세동은 수십 년 동안 알려져 왔지만, 심방세동의 병태생리학은 아직 완전히 이해되지 않았다2.
이미 1990년대 후반에 여러 연구에서 폐정맥(PV)이 심방세동을 유발하는 이소성 박동(ectopic beats)의 주요 원인이기 때문에 심방세동을 시작하고 유지하는 데 큰 영향을 미친다는 사실이 입증되었습니다3. PV는 구조적으로 다른 혈관과 다르다는 것이 입증되었습니다. 일반적인 혈관에는 평활근 세포가 포함되어 있지만, PV의 튜니카 배지에는 심근세포도 포함되어 있다4. 설치류에서, 이 심장 근육계는 폐내 및 폐외 부분뿐만 아니라 오리피스 영역(5)을 포함한 전체 PV에 걸쳐 어디에나 존재한다. 인간의 경우 PV에는 좌심방(LA) 심근 슬리브(MS)6,7라고 하는 심근의 확장 내에서 관찰할 수 있는 심근세포도 포함되어 있습니다.
다발성경화증은 심방심근(atrial myocardium8)과 형태학적 유사성을 가지고 있다. 심방과 PV 심근세포의 모양과 크기는 서로 크게 다르지 않으며 유사한 전기생리학적 특성을 나타낸다8. PV 내의 전기 생리학적 기록은 다발성경화증의 전기적 활성을 입증했으며, 혈관 조영술은 심장 박동 9,10과 동기화된 수축을 밝혀냈다.
간극연접(gap junction)은 6개의 커넥신 소단위체(connexin subunit)로 구성된 기공 형성 단백질 복합체로, 이온과 소분자(11)의 통과를 허용한다. 간극연접(gap junction)은 세포-세포 접합부(cell-to-cell appositions)에 존재하고, 이웃한 심근세포를 상호 연결하며, 심근세포(cardiomyocyte) 사이의 세포간 전기적 결합을 가능하게 한다(12,13). 여러 개의 커넥신 동형이 심장에서 발현되며, 커넥신 43(Cx43)은 심장의 모든 영역에서 발현되는 가장 흔한 동형이다14. 이전 연구는 PVs15,16의 심근세포에서 Cx43의 발현에 대한 증거를 제공합니다.
온전한 PV의 섬세한 구조로 인해, 특히 작은 동물 모델에서 MS를 조사하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에서는 현미경 유도 미세해부를 사용하여 마우스에서 LA 및 폐엽과 함께 PV를 식별하고 분리하는 방법을 보여줍니다. 또한 PV의 면역형광(IF) 염색을 시연하여 심근세포와 PV 내 상호 연결을 시각화합니다.

<table><tbody><tr><td>접착 슬라이드</td><td>Epredia</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>AF568-2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>숙주: 염소, 반응성: 토끼</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym LE</td><td>840104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-2차 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4408S</td><td>숙주: 염소, 반응성: 마우스</td></tr><tr><td>Anti-Connexin 43 /GJA1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>다클론 항체, 클론: GJA1, 숙주: 토끼&nbsp;</td></tr><tr><td>항-cTNT 항체</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-12960</td><td>단클론 항체, 클론: 13-11, 호스트: 마우스</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>브러시</td><td>Lukas&nbsp;</td><td>5486</td><td>사이즈 6</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Epredia</td><td></td><td>24 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Cryotome Cryo Star NX70</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td>설정: 표본 온도: -18 > C, 블레이드 온도 : -25 > C</td></tr><tr><td>DFC365FX 카메라</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DM6 B 형광 현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드라이아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dubecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1x conc.</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dumont #5FS 집게</td><td>F.S.T.91150-20</td><td></td> <td>2 개 필요</td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>F.S.T.</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>세포핵 대조염색</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI</td><td></td><td>분석 및 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Leica DM6 B</td></tr><tr><td>Microtome blades S35</td><td>Feather</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S26-M</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Pierce</td><td>28908</td><td>methanol-free</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫용</td> 이미징 소프트웨어<td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>100 mm 직경</td></tr><tr><td>로커 3D 디지털</td><td>IKA Sch &uuml; ttler</td><td>00040010000</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 염색 용기</td><td>EasyDip</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>시편 금형</td><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>4557</td><td>25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>StainTray M920 염색 시스템</td><td>StainTray</td><td>631-1923</td><td>20 슬라이드용 염색 시스템</td></tr><tr><td>Sterican Needle</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>G 27 - Student Vannas Spring Scissors F.S.T 프로토콜에서 주입(<강한>단계 2</강>) 및 고정(<강한>단계 3 및 4</강>)에 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 PAP 펜 리퀴드 블로커</td><td>슈퍼 PAP 펜</td><td>N71310-N</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>브라운</td><td>4606108V</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>로슈</td><td>트리스-RO</td><td>구성 요소 1x 트리스 버퍼 식염수(TBS)</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

폐정맥(PV)은 심방 부정맥에서 이소성 박동의 주요 원인이며 심방세동(AF)의 발생과 진행에 중요한 역할을 합니다. PV에는 심근세포로 구성된 심근 슬리브(MS)가 포함되어 있습니다. 다발성경화증은 이소성 전기 충격을 생성하는 능력을 포함하여 심장 작동 심근과의 유사성을 보존하기 때문에 심방세동의 시작 및 유지와 관련이 있습니다. 설치류는 널리 사용되며 심근세포가 혈관 벽 전체에 널리 존재하기 때문에 폐 정맥 심근을 연구하는 데 우수한 동물 모델을 나타낼 수 있습니다. 그러나 쥐 PV의 정확한 미세해부 및 준비는 작은 장기 크기와 복잡한 해부학적 구조로 인해 어렵습니다.
PV와 함께 쥐 좌심방(LA)을 분리하기 위한 현미경 유도 현세해부 프로토콜을 시연합니다. 심장 Troponin-T(cTNT) 및 connexin 43(Cx43) 항체를 사용한 면역형광 염색을 수행하여 LA 및 PV를 전체 길이로 시각화합니다. 10x 및 40x 배율의 이미징은 PV 구조에 대한 포괄적인 보기와 심근 구조에 대한 자세한 통찰력을 제공하며, 특히 MS 내에서 connexin 43의 존재를 강조합니다.

우리는 12-16주 된 쥐 10마리에서 PV의 미세 해부, 염색 및 이미징을 수행했습니다. 프로토콜에 따라 모든 실험용 마우스에서 LA와 함께 PV를 성공적으로 미세 해부하고 8개 마우스에서 PV를 포괄적으로 볼 수 있는 섹션을 얻었습니다. 개요 이미지는 LA-PV 접합부의 PV 오리피스(PVO) 영역, 폐 외 PV(PVex)(폐 힐럼과 LA-PV 접합부 사이의 PV) 및 폐 내 PV(PVin)(폐 조직으로 둘러싸인 PV)를 식별하기 위해 10배 배율로 촬영되었습니다(그림 2). 언급된 영역의 확대 이미지는 40x 배율 대물렌즈에서 획득되었습니다(그림 3).
PVO, PVex 및 PVin 에서 전형적인 근육 줄무늬가 있는 특정 cTNT 신호를 발견했습니다(그림...

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

심방세동은 가장 흔한 부정맥이지만 복잡한 병태생리학은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 우리의 연구를 통해 우리는 심방세동의 시작과 유지로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 의학 연구를 벤치에서 병상으로 옮기는 것은 중요한 과제입니다.이 문제를 해결하기 위해 우리는 마우스 모델에 대한 세포 모델에서 대형 동물 모델 및 돼지에 이르는 중개 파이프라인을 구축하여 새로운 치료 표적을 식별하고 검증할 수 있었습니다. 생쥐는 부정맥을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 그러나 쥐의 폐 정맥을 연구하는 것은 어렵습니다.폐정맥은 환자의 심방세동을 유발하는 주요 원인입니다. 당사의 프로토콜은 추가 조사를 수행하기 위해 폐 정맥을 식별하고 미세 해부하기 위한 효과적인 지침을 제공합니다.

microdissection-immunofluorescence-staining-myocardial-sleeves-murine

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이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

출처: Brown, A. O., Orihuela, C. J. 심장 미세병변 및 이후 심장 재형성 내 폐렴연쇄상구균의 시각화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 감염으로 인한 미세병변 내에 국한된 병원성 박테리아를 화학적으로 고정한 마우스 심장 조직 절편의 면역 염색을 시연합니다. 이 과정에는 조직 세척, 막 투과, 비특이적 부위 차단, 항체 표지, 핵 염색, 공초점 현미경을 통해 박테리아 군집을 검출하고 위치시키는 작업이 포함됩니다.

마우스 심장 조직 절편에서 박테리아가 채워진 미세병변의 면역염색 검사

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

최소한의 침습적 조작으로 마우스의 심근 경색에 대한 재현성이 높은 모델을 설명합니다. 모델을 쉽게 수행할 수 있어 재현성과 생존율이 높습니다. 따라서 설명된 모델은 3R 원칙(Replacement, Refinement and Reduction)에 의해 요청되는 대로 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

여기에서는 Isolectin B4의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

학습하세요 쥐 폐 정맥의 미세 해부 및 면역형광 염색법을 통해 심방세동 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 심근 슬리브 조직 분석과 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

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