Name: Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 배우세요 iPSC 유래 간엽기질세포를 이용하여 Scleraxis 과발현과 2D 단축 장력을 결합해 iTenocytes를 생성하는 방법을. 이 기술은 건 손상 치료와 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH/NIAMS K01AR071512 및 CIRM DISC0-14350에서 Dmitriy Sheyn에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 두 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 Simon Knott 실험실(Cedars-Sinai Medical Center, Department of Biomedical Sciences)에서 기증한 것입니다.

효과적인 세포 기반 치료를 위한 iPSC 유래 iTenocyte 활용

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<li>Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tendon+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tendon cell fate during development.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).</li>
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<li>Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+behavior+using+biophysical+and+biochemical+cues%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).</li>
<li>Papalamprou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+iPSC+differentiation+into+iTenocytes+using+combined+scleraxis+overexpression+and+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).</li>
<li>Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+tendon+reporters%2C+ScxGFP+and+ScxAP%2C+using+regulatory+elements+of+the+scleraxis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-based+product+characterization+for+clinical+trials%3A+an+FDA+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).</li>
<li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal%2Fstem+cells%3A+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+%28IFATS%29+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li>
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<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neo-genesis+of+tendon%2Fligament-like+tissue+by+combination+of+mohawk+and+a+three-dimensional+cyclic+mechanical+stretch+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).</li>
</ol>

모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜에서 iTenocyte는 (1) iMSC에 대한 iPSC의 유도, (2) 렌티바이러스 벡터를 사용한 SCX의 과발현, (3) 2D 단축 장력을 통한 세포 성숙의 세 가지 주요 단계를 통해 생성됩니다.
iPSC를 iMSC로 구별하기 위해 제시된 프로토콜은 이전에 그룹2에서 설명했습니다. 이 발표 이후, 임상시험에서 iMSC를 사용하기 위한 확립된 프로토콜(21,22,23)과 상업적으로 이용 가능한 분화 키트를 포함하여 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. iMSC의 삼계보 잠재력에 대한 검토도 이전에 조사된 바 있다2. 방법론은 다르지만, 모든 프로토콜은 MSC 표면 마커의 안정적인 발현을 보장하기 위해 여러 통로에 대한 iMSC의 분화 후 확장의 필요성을 강조합니다. 이 단계에서 약 70% 합류점에서 1:3 분할 비율을 사용하면 통과 후 4-6일 이내에 상대적으로 합류하는 플레이트가 생성됩니다.
형질도입을 위한 최적의 titer를 선택할 때는 세포 생존율과 효율성 사이의 균형을 맞추는 것이 중요합니다. 100% 역가로 transduction된 iMSC는 가장 높은 수준의 SCX-GFP 양성 세포를 나타낼 수 있지만, 이러한 세포가 DNA 유도 독성으로 인해 transduction 후 3개의 통로 분열을 멈췄다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 3C). 따라서 100% 미만의 역가를 사용하는 것이 좋습니다. 실리콘 플레이트를 파종하기 전에 유세포 분석을 사용하여 SCX-GFP 수준을 재평가하는 것이 좋습니다. 데이터가 효율이 원하는 임계값 미만임을 나타내는 경우, 특히 in vivo 응용 분야의 경우 파종 전에 iMSCSCX+ 세포를 분류하는 것이 좋습니다.
iMSCSCX+ 세포를 실리콘 플레이트에 파종한 후에는 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 늘어나기 전에 세포가 부착될 수 있도록 해야 합니다. 실리콘 플레이트에서 기술된 1.25 x 104 cells/cm2의 세포 밀도는 정적 장력(24)에 기여할 수 있는 단층 과성장을 방지하도록 최적화되었다. 또한, 연구에 따르면 다양한 강성의 기질에서 합류 배양에서 직접 세포 간 접촉이 세포 거동을 변경할 수 있음을 시사합니다 24,25,26. 파일럿 실험 중에 실리콘 플레이트에서 일부 눈에 띄는 세포 분리가 관찰되었으며, 특히 이후 시점에서 관찰되었습니다(그림 4D). 이는 과잉 합류(overconfluence)로 인한 ECM 세포 시트의 형성에 기인할 수 있다24. 따라서 중요한 매개변수에는 세포 밀도와 스트레치 시합 수가 포함됩니다. 현재 방법에서는 유전자 발현 분석을 통한 테노겐 잠재력의 평가를 위해 3일째 및 7일에 세포를 수집했습니다. 그러나 2D 바이오리액터에서 세포를 최소 3일 동안 스트레칭하고 과잉 증식 및 세포 분리를 방지하기 위해 스트레칭 및 정적 플레이트를 모니터링하는 것이 좋습니다.
몇 번의 스트레치 시합 후에 어느 정도의 세포 정렬과 조직을 관찰할 수 있습니다(그림 4C1,E). 이는 시험관 내 단축 변형에 대한 반응으로 변형 축에 수직인 세포 정렬이 관찰되는 많은 연구와 일치합니다 24,27. 이에 비해 정적 플레이트는 확률적 세포 조직을 표시합니다(그림 4C2,E).
우리가 아는 한, MSC를 건세포 또는 리가멘토세포로 분화시키기 위한 SCX 과발현 및 기계적 자극의 시너지 효과를 탐구한 연구는 소수에 불과하다 24,28,29. Gaspar et al.은 여기에 설명된 것과 유사한 2D 바이오리액터 시스템을 사용했지만 더 높은 수준의 총 변형률(12시간/일 동안 1Hz에서 10%)을 적용했습니다. 흥미롭게도, 그들은 BM-MSC와 인간 건세포에서 SCX, TNMD 및 COL1a1의 발현 변화를 감지할 수 없었습니다. 그러나, 이것은 그들의 연구에서 사용된 더 높은 적용 균주에 기인할 수 있다24. Chen et al.은 다층 시트로 조립된 hESC-MSC에서 SCX를 과발현하기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용했습니다. 그들은 단축 순환 하중(최대 21일 동안 2시간/일 동안 1Hz에서 10% 변형률)을 적용하고 COL1a1, COL1a2, COL14 및 TNMD의 상향 조절과 ECM 증착 증가를 관찰했습니다29. Nichols et al.은 전장 쥐 Scx cDNA로 C3H10T1/2 세포를 일시적으로 transfection하고 단축 고리 변형(1%, 1Hz, 최대 14일 동안 30분/일) 하에서 3D 콜라겐 하이드로겔에서 세포를 배양했습니다. 우리의 발견과 유사하게, 그들의 그룹은 변형되고 과발현된 구성물에서 SCX 및 COL1A1의 상승된 발현을 관찰했지만, 주기적 스트레칭에 대한 반응으로 TNMD 발현의 변화는 발견하지 못했다28.
또한 MKX와 같은 다른 힘줄 관련 마커의 과발현을 고려하는 것이 흥미로울 수 있습니다. Tsutsumi et al.은 C3H10T1/2 세포에서 MKX를 과발현하고 3D 시스템에서 주기적인 기계적 스트레칭을 적용하는 복합적인 효과를 탐구했습니다. 그들은 콜라겐 피브릴 다발 및 액틴 필라멘트30의 정렬과 함께 SCX, COL1a1, DCN 및 COL3a1의 상당한 상향 조절을 입증했습니다.
iTenocyte를 생성하는 이 방법에는 한계가 있다는 것을 인정하는 것이 중요합니다. 상업적으로 이용 가능한 2D 바이오리액터는 개념 증명 작업에 유리하지만 크기가 수율을 제한합니다. 이러한 세포가 고처리량 분석에 필요하거나 힘줄 복구 요법을 위한 잠재적인 기성 세포 공급원으로 필요한 경우 더 큰 규모로 단축 스트레칭을 구현할 수 있는 시스템을 탐색하는 것을 고려해야 합니다. 또한, 추가 조사는 안정적인 tenogenic 발현을 확인하기 위해 iTenocyte의 확장을 포함해야 하며, in vivo 재생에 대한 기여도를 평가하는 것은 tenogenic 잠재력을 평가하는 데 중요합니다.

힘줄과 인대 복구의 현대 문제를 해결하기 위해서는 세포 기반 치료에 적합한 적절한 세포 후보가 필요합니다. 힘줄 복구를 위한 조직 공학의 한 가지 연구 방법은 골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 지방 조직 유래 기질 세포(ASC)를 잠재적 전략으로 탐색하는 것입니다. 이 세포는 다능 능력, 매우 풍부하며 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 향상된 치유 능력과 향상된 기능적 결과를 보여주었습니다1. 그럼에도 불구하고 이러한 세포는 제한된 자가 재생 능력, 표현형 다양성, 특히 힘줄 형성 능력이 제한되어 있습니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기술은 뛰어난 자가 재생 능력과 타의 추종을 불허하는 발달 적응성으로 인해 이러한 제약에 대한 솔루션을 제공합니다. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 iPSC를 중간엽 기질 세포 유사 개체(iMSC)로 성공적으로 분화시켰습니다2,3. 따라서 iMSC는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 공급원이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
공막(SCX)은 힘줄 발달에 필수적인 전사 인자이며 분화된 건세포에 대해 가장 먼저 검출할 수 있는 마커로 간주됩니다. 또한 SCX는 유형 1a1 사슬 콜라겐 1(COL1a1), 모호크(MKX) 및 테노모듈린(TNMD)을 포함한 다운스트림 힘줄 분화 마커를 활성화합니다 4,5,6. 힘줄 성숙 중에 발현되는 다른 유전자로는 튜불린 중합 촉진 단백질 패밀리 멤버 3(TPPP3) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)7가 있습니다. 이러한 유전자는 힘줄의 발달과 성숙에 필수적이지만, 불행히도 힘줄 조직에만 국한된 것은 아니며 뼈나 연골과 같은 다른 근골격계 조직에서 발현됩니다 5,7.
힘줄 발달 중 마커의 발현 외에도 기계 자극은 배아 힘줄 발달 및 치유에 필수적인 요소입니다 4,5,6. 힘줄은 기계적으로 반응하며 성장 패턴은 환경에 따라 변화합니다. 분자 수준에서, 생체역학적 단서는 건세포의 발달, 성숙, 유지 및 치유 반응에 영향을 미친다8. 다양한 바이오리액터 시스템이 생리학적 부하와 생체역학적 단서를 모델링하는 데 활용되었습니다. 이러한 모델 시스템 중 일부에는 생체 외 조직 로딩, 이축 또는 단축 장력을 적용하는 2D 세포 로딩 시스템, 스캐폴드 및 하이드로겔을 사용하는 3D 시스템이 포함됩니다 9,10. 2D 시스템은 힘줄 특이적 유전자 또는 세포 운명의 맥락에서 세포의 형태에 대한 기계적 자극의 효과를 연구할 때 유리한 반면, 3D 시스템은 세포-ECM 상호 작용을 보다 정확하게 복제할 수 있습니다 9,10.
2D 로딩 시스템에서는 세포와 배양 기질 사이의 변형률이 균일하며, 이는 세포의 세포골격에 가해지는 하중을 완전히 제어할 수 있음을 의미합니다. 이축 로딩(bi-axial loading)과 비교하여, 일축 로딩(uniaxial loading)은 생리학적으로 더 관련성이 높은데, 이는 텐노사이트(tenocyte)가 생체 내 콜라겐 다발(collagen bundle)로부터 일축 로딩(uniaxial loading)을 주로 받기 때문이다 9. 일상 활동 중에 힘줄은 최대 6%의 변형률(11)까지 단축 인장 하중을 받는 것으로 나타났다. 특히, 이전 연구에서는 4%-5%의 생리학적 범위 내에서 로딩이 SCX 및 TNMD와 같은 힘줄 관련 마커 발현을 보존하고 콜라겐 생산을 증가시켜 테노겐 분화를 촉진하는 것으로 나타났습니다 9,10. 10% 이상의 균주는 외상적으로는 관련이 있지만 생리적으로는 관련이 없을 수 있다12,13.
여기에서는 건세포 생성에 필수적일 수 있는 기계적 및 생물학적 자극의 시너지 효과를 고려한 프로토콜이 제시됩니다. 먼저 유세포 분석을 사용하여 MSC 표면 마커로 확인된 배아체를 성장 인자에 단기간 노출 시켜 iPSC를 iMSC로 유도하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 그런 다음 SCX(iMSCSCX+)의 안정적인 과발현을 갖도록 iMSC를 엔지니어링하는 렌티바이러스 형질도입 방법을 자세히 설명합니다. 추가 세포 성숙을 위해 iMSCSCX+ 는 피브로넥틴 코팅 실리콘 플레이트에 파종되고 CellScale MCFX 바이오리액터를 사용하여 최적화된 단축 장력 프로토콜을 거칩니다. tenogenic 잠재력은 이른 힘줄 마커와 늦은 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰함으로써 확인되었다14. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 무제한 기성품 동종 소스를 제공할 수 있는 개념 증명입니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Thermofisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105</td><td>Ancell</td><td>326-050</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 anti-human CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 IgG2 K isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 소 태아 혈청</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00959143_m1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3733</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00164004_m1</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 III 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 저포도당, 피루베이트, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>Thermofisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Eagle의 최소 필수 매체 (EMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin 소 혈장</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr>돼지 껍질에서 추출한 <td>FITC 마우스 안티 휴먼 CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>젤라</td>틴 <td>시그마 알드리치</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG1-PE</td><td>바이오 라드</td><td>STAR117</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T/17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, 페놀 레드</td><td>써모피셔</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>iPSC: 83i-cntr-33n1</td><td>Cedars-Sinai iPSC 핵심 시설</td><td>N/A</td><td>https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/</td></tr> <tr><td>Isotype Control 항체, 마우스 IgG2a-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-271</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 혈청 교체</td><td>Thermofisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Thermofisher</td><td>2503081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>MechanoCulture FX</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td>스트레칭 장치</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액</td><td>Thermofisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mohawk human Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00543190_m1</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 유래 성장 인자 수용체 A 인간 Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00998018_m1</td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 감염/형질 주입 시약</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간&nbsp; TGF-beta 1 단백질 인간 Taqman 프라이머</td><td>RnD 시스템</td><td>240-B</td><td></td></tr><tr><td>Scleraxis 인간 Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03054634_g1</td><td></td></tr><tr><td>SCXA (SCX) (NM_00108050514) 인간 태그 ORF 클론</td><td>OriGene</td><td>RC224305L4</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 플레이트</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>Millipore 시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin C human Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00370384_m1</td><td></td></tr><tr><td>Tenomodulin human Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00223332_m1</td><td></td></tr><tr><td>Thrombospondin 4 human Taqman 프라이머</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00170261_m1</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약, BioT</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>B01-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermofisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>단백질족 구성원 3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043892_m1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cell-derived itenocytes via combined scleraxis overexpression and 2d uniaxial tension(공막 과발현 및 2d 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 itenocytes 생성)

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

힘줄과 인대 복구에 대한 오늘날의 과제는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 세포 기반 치료에 적합하고 효과적인 후보를 식별해야 합니다. 중간엽 기질 세포(MSC)는 힘줄 복구를 위한 잠재적인 조직 공학 전략으로 연구되어 왔습니다. 그들은 다능하고 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있지만 자체 재생 능력이 제한되어 있으며 표현형 이질성을 나타냅니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 높은 자가 재생 능력과 탁월한 발달 가소성으로 인해 이러한 한계를 우회할 수 있습니다. 건세포 발달에서 공막(Scx)은 힘줄 분화의 중요한 직접 분자 조절자입니다. 또한 기계 조절은 배아 힘줄의 발달과 치유를 이끄는 핵심 요소인 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 힘줄 생성에 필수적일 수 있는 생물학적 및 기계적 자극의 시너지 효과를 캡슐화하는 프로토콜을 개발했습니다. iPSC는 중간엽 기질 세포(iMSC)가 되도록 유도되었으며 유세포 분석을 통해 고전적인 중간엽 기질 세포 마커로 특성화되었습니다. 다음으로, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 iMSC를 안정적으로 과발현하도록 형질주입했습니다(iMSCSCX+). 이러한 iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터를 사용하여 단축 인장 하중을 통해 iTenocyte로 더 성숙할 수 있습니다. 결과 세포는 초기 및 후기 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰하는 것이 특징이었습니다. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 잠재적으로 무제한의 기성품 동종 세포 소스를 개발하는 연구원을 지원하는 데 사용할 수 있습니다.

인간 iPSC와 iMSC의 분화 앞서 설명한 바와 같이, iPSC를 iMSC로 분화하기 위한 현재의 프로토콜은 배아체(embryoid body)의 형성을 포함한다(2). 이 과정은 iPSC에서 iMSC를 유도하는 데 약 10일이 걸립니다(그림 1A). 그러나 새로 생성된 iMSC를 최소 두 번 통과하는 것이 좋습니다. 이는 젤라틴 코팅 플레이트의 필요성을 없애는 데 도움이 될 뿐만 아니라 안정적인 MSC 발현을 확립하는 데 도움이 됩니다. 분화 후 6번의 통과 후에 수행된 유세포 분석 정량화는 CD44(83.1%), CD90(88.4%) 및 CD105(99.2%)를 포함한 고전적인 MSC 표면 마커의 높은 발현으로 거의 순수한 세포 집단을 보여줍니다17,18(그림 1B). 형태학적 측면에서 iMSC는 골수 MSC와 매우 유사하며 길쭉하고 섬유아세포와 유사해야 합니다(그림 1C).
렌티바이러스 형질도입을 이용한 SCX를 과발현하기 위한 iMSC의 유전공학 Lentivirus는 2개의 패키징 플라스미드와 함께 SCXB를 삽입하여 SCX-GFP+를 발현하는 pLenti-C-mGFP 벡터로 HEK293T/17 세포를 transfection하여 생성되었습니다. 형질주입은 BioT(μl) 대 DNA(μg)의 1.5:1 비율로 BioT 방법15,16을 사용하여 수행하였다.
HEK293T/17 세포는 형질주입 전 5.3 x 104 cells/cm2 18-24 시간의 밀도로 파종되었습니다. transfection 시 세포는 저효율 역가를 피하기 위해 80%-95% 밀도에 도달해야 합니다(그림 2B1, 왼쪽). 플라스미드 칵테일을 첨가한 후 24시간 이내에 약간의 독성이 관찰되었으며, 이는 48시간에 최고조에 달했습니다(그림 2B2). SCX 렌티바이러스 벡터는 GFP 접합체이므로 GFP 발현은 48시간 후에 관찰할 수 있어야 합니다(그림 2B3). GFP 발현과 결합된 높은 독성의 존재는 성공적인 transfection의 신뢰할 수 있는 지표입니다. 렌티바이러스는 48시간 및 72시간에 수집하고, 유세포 분석 및 유전자 발현 분석을 사용하여 형질도입 효율을 평가하였다. GFP 양성 세포의 절대 강도는 SCX 통합의 대용물로 사용되었으며, 역가가 높을수록 훨씬 더 높았습니다(그림 3A). SCX-GFP+ 세포의 백분율로 측정된 transduction 효율은 렌티바이러스 부하에 따라 용량-반응 효과를 입증했습니다(그림 3B). 다른 통로에서 iMSCSCX+ 의 유세포 분석도 전이유전자 발현 수준이나 형질도입된 세포의 비율에 변화가 없는 높은 안정성을 보여주었습니다(그림 3C). 또한, 분류하지 않고 4주 동안 규칙적으로 배양한 후 iMSCSCX+ 는 SCX의 안정적인 과발현을 유지했습니다(그림 3D). 대규모 transduction은 75% 렌티바이러스를 사용하여 역가를 기반으로 수행되었습니다(그림 2C).
iMSCSCX+의 기계적 로딩 iMSCSCX+ 세포는 스트레칭 프로토콜을 시작하기 전에 세포 부착을 허용하기 위해 1.25 x 104 cells/cm2(그림 4A,B)의 세포 밀도로 변형 가능한 실리콘 플레이트에 파종되었습니다. 최종 파종 밀도는 단층 과잉 증식을 방지하기 위해 최적화되었습니다. 과도하게 높은 파종 밀도가 조기 세포 수축과 조기 세포 사멸을 초래했다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 4D). 정적 대조군의 경우, 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭을 거치지 않았습니다. iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터에서 하루 2시간 동안 4% 단축 변형률 및 0.5Hz에서 최소 3일, 최대 7일 동안 스트레칭되었습니다. 이 스트레칭 요법은 생리학적으로 관련이 있는 것으로 기술된 것과 일치한다9. 며칠 동안 스트레칭을 한 후, 무작위 세포 조직을 나타낸 정적 그룹과 비교하여 어느 정도의 세포 조직을 관찰할 수 있습니다(그림 4C). 액틴 필라멘트의 팔로이딘 염색은 정적 플레이트에서 관찰되는 무작위 세포 조직과 달리 세포가 늘어나는 방향에 수직으로 성장하는 것처럼 보이는 방식을 더욱 강조합니다(그림 4E). 새로 생성된 iTenocyte를 특성화하기 위해, 이전에 보고된 바와 같이 유전자 발현 분석을 위해 3일 및 7일에 세포를 수집하였다14. 유전자 발현 분석은 0일째에 iMSC만 있는 것에 비해 3일과 7일 모두에서 tenogenic 유전자(SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX 및 TPPP3)5,7,19,20에서 상당한 상향 조절이 있기 때문에 iMSCSCX+ 세포가 기계적 반응성이 있음을 보여줍니다(그림 5A). 또한, 스트레칭 7일 후 배지 내 콜라겐 침착은 iMSCSCX+ 스트레칭 그룹에서 다른 모든 그룹에 비해 유의하게 높았습니다(그림 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig01.jpg"> 그림 1: iMSC 분화 회로도 및 유세포 분석 특성화. (A) iMSC 유도를 위한 iTenocyte 생성 및 타임라인의 전체 개략도. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. (B) 유세포 분석 정량화는 분화 후 6개 통과 후 iPSC 유래 MSC에 대한 고전적인 MSC 표면 마커를 발현하는 세포의 높은 비율을 보여줍니다. Sheyn D. et al.2의 허가를 받아 각색했습니다. (C) 분화 후 세포의 위상차 이미지는 섬유아세포와 유사한 형태를 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig02v2.jpg"> 그림 2: iMSCSCX+ 생산 회로도. (A) 2세대 SCX 렌티바이러스 벡터를 사용한 transfection 및 iMSC의 transduction의 전체 개략도. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. (나1) 플라스미드 칵테일을 첨가하기 전의 HEK293T/17 세포. (나2) HEK293T/17 세포는 48시간 후에 GFP를 발현하고 독성을 나타냅니다. (나3) HEK293T/17 세포에서 관찰할 수 있는 GFP의 발현은 성공적인 transfection을 나타냅니다. (C) 생성된 iMSCSCX+ 세포(75% 역가)는 핵에서 SCX-GFP+ 를 발현합니다. 스케일 바 = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig03.jpg"> 그림 3: 유세포 분석 및 유전자 발현을 통한 transduction 효율 측정. GFP 양성 세포의 절대 강도는 유세포 분석을 사용하여 SCX 통합을 위한 프록시로 사용되었습니다. 벡터 역가는 렌티바이러스 MOI를 평가하기 위해 모든 세포에 대한 유세포 분석을 통해 검증되었습니다. (A) 바이러스 역가당 절대 형광. (B) SCX-GFP+ 세포의 백분율로 평가된 형질도입 효율. 형질도입 효율에 대한 렌티바이러스 부하의 용량-반응 효과는 흐름 결과가 GFP+ 세포의 백분율로 제시되었을 때 관찰되었습니다. MOI, 감염의 다중성, n = 3개의 독립적인 형질도입. 역가를 비교하기 위해 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용했습니다. 데이터는 평균± SD입니다. *p &lt; 0.05. (C) 여러 차례의 passaging 후 iMSCSCX+ 의 유세포 분석은 안정적인 전이유전자 발현 수준의 변화와 형질도입된 세포의 비율에 변화가 없음을 나타냅니다. 100% 역가로 형질도입된 iMSC는 P3에서 분열을 멈췄습니다. (D) SCX-GFP+ 렌티바이러스 벡터(75%, MOI = 2.9 e5 TU/mL)로 transduction한 iMSC를 분류하지 않고 4주간의 정규 배양에서 SCX의 유전자 발현을 평가했습니다. SCX 발현은 iMSCSCX+ 에서 현저하게 상향 조절되어 4주 후 SCX의 안정적인 과발현을 보여주었습니다. TU, 형질 주입 장치; data는 평균± SD, **p &gt; 0.01입니다. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig04.jpg"> 그림 4: iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에 파종하고 주기적 스트레칭을 거칩니다. (A) 2D 바이오리액터 개략도. Papalamprou A. et al.12의 허가를 받아 복제했습니다. (B) 세포는 먼저 유연한 실리콘 플레이트에 파종되고 37°C에서 배양되어 2D 바이오리액터에서 주기적으로 늘어나기 전에 부착할 수 있습니다. (C) iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에서 최대 7일 동안 연신하였다. 정적 제어의 경우 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭은 없었습니다. (다1) 7일 후 정적 제어판은 세포의 확률적 배열을 나타냅니다. (다2) 7일 후 늘어난 플레이트는 상대적으로 더 많은 세포 조직을 보여줍니다. (D) 준수하지 말아야 할 것의 세 가지 예. 세포 파종 밀도가 너무 높거나 세포가 너무 많은 날 동안 늘어나면 세포가 분리되기 시작합니다. (1일차) 세포는 약간만 과도하게 자랍니다. 노란색 화살표는 조기 세포 수축의 시작을 나타냅니다. (2일) 중간 정도의 과성장. 세포가 플레이트에서 분리되기 시작합니다. (3일차) 심각한 수준의 과잉 성장. 세포는 더 이상 단층에서 자라지 않고 3D 구조를 형성합니다. 블랙 스케일 바 = 400 μm. 백색 스케일 막대 = 1000 μm. (E) 7일간의 스트레칭 후(또는 정적 플레이트의 경우 배양 중) 액틴 필라멘트(빨간색)에 대해 팔로이딘으로 세포를 고정하고 핵(파란색)에 대해 DAPI로 대조염색했습니다. 흰색 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig05.jpg"> 그림 5: 2D 바이오리액터에서 Scx 과발현 및 단축 스트레치에 의한 tenogenic marker 유전자 발현 자극. (A) iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에서 7일 동안 연개했습니다. 정적 제어의 경우 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭은 없었습니다. 유전자 발현 분석 결과 iMSCSCX+ 는 기계적 반응성이 있는 것으로 나타났습니다. ND = 감지 없음. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 각 시점에서의 유전자 발현을 비교했습니다. d0입니다. N = 8/그룹. (B) 2D 생물반응기에서 7일간의 스트레칭 후 콜라겐 침착. 데이터는 SD± 평균입니다. n = 8/그룹; *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001. Papalamprou A. et al.12의 허가를 받아 복제했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to ...

힘줄 부상은 미국에서 가장 흔한 근골격계 문제 중 하나로, 매년 약 3,300만 명에게 영향을 미칩니다. 우리의 연구는 환자의 결과를 크게 개선할 수 있는 힘줄 복구를 위한 세포 및 조직 공학 접근 방식을 개발하는 데 중점을 둡니다. 힘줄 연구를 발전시키는 데 사용되는 현재 기술에는 힘줄에 필요한 환경 신호를 모방하기 위해 생물 반응기, 유전 공학 생체 재료 및 기타 조직 공학 기술의 사용과 함께 유도 만능 줄기 세포와 같은 다양한 출처의 줄기 세포 사용이 포함됩니다.힘줄이 그 기원에서 어떻게 발달하는지에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 힘줄 성숙 중에 매우 높게 발현되는 잘 알려진 몇 가지 유전자가 있습니다. 그러나 불행히도 힘줄 조직에만 있는 것은 아니다.이로 인해 연구자들은 성공적인 힘줄 분화를 표준적으로 평가하기가 어렵습니다. 프로토콜은 놀라운 IPC 차별화 잠재력과 힘줄 발달에 대해 지금까지 알고 있는 것을 활용합니다. 우리의 목표는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 세포 소스를 개발하는 것입니다.우리 연구실은 힘줄 발달을 더 잘 이해하기 위해 황산힘과 관련된 경로를 설명하는 데 중점을 두었습니다. 우리는 이 지식을 조직 공학 기술 및 생체 재료와 결합하여 구현하여 전통적인 힘줄 복구를 위한 보다 효과적인 대안을 개발하고자 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

선물이 여기 각 somite 파생 (myotome, sclerotome, dermatome, 및 syndetome)에 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대 한 프로토콜 정의 화학적 조건에서 미래의 질병 모델링에 응용 프로그램에는 고 정형 외과에서 세포 기반 요법입니다.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

배우세요 iPSC 유래 간엽기질세포를 이용하여 Scleraxis 과발현과 2D 단축 장력을 결합해 iTenocytes를 생성하는 방법을. 이 기술은 건 손상 치료와 조직 공학 연구에 활용됩니다.

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성) (동영상) | JoVE Journal

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)

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