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방법 논문

마우스의 급성 신장 손상에 대한 양측 신장 허혈-재관류 모델

3.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65838

⸱

2024년 2월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

허혈-재관류 손상(IRI) 모델은 특히 AKI에서 만성 신장 질환(CKD)으로 진행되는 동안 급성 신장 손상(AKI) 발달의 여러 단계에서 사용할 수 있습니다. 여기에서는 허혈성 손상을 유도하기 위해 혈관 클립을 통해 신장 척추경을 고정하는 경복부 접근법을 통해 마우스에서 IRI 모델을 개발하는 절차를 설명합니다.

초록

급성 신장 손상(AKI)은 신장 기능의 급격한 저하로 정의되며, 지속적인 신장 기능 장애는 네프론의 돌이킬 수 없는 손실과 부적응 복구로 인해 점차 만성 신장 질환(CKD)으로 진행됩니다. 최근 몇 년 동안 허혈-재관류 손상(IRI)이 대부분의 에피소드를 차지하는 체적 고갈, 패혈증, 신독성, 근육 손상 및 주요 외상을 포함한 다양한 병인과 관련하여 AKI의 발병률이 증가하고 있습니다. 마우스에서 IRI 모델의 개발은 신장 척추경의 외과적 클램핑에 의해 유도되며, 이는 AKI의 전임상 모델을 위한 강력하고 제어 가능한 도구를 제공합니다. 중요한 것은 IRI 모델이 AKI 개발의 여러 단계, 특히 AKI에서 CKD로의 프로세스에 배포된다는 것입니다. IRI 모델이 많은 실험실에서 널리 시행되고 있음에도 불구하고 일련의 변수가 여전히 이 모델의 결과에 영향을 미칩니다. 여기에서는 연구자가 AKI의 발병과 AKI에서 CKD로의 진행의 기저 발병기전을 탐구할 수 있도록 반복 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하기 위해 IRI 모델 개발 절차를 설명합니다.

서론

급성 신장 손상(AKI)은 이환율과 사망률이 높은 중증 임상 증후군으로, 48시간 이내에 혈청 크레아티닌이 0.3mg/dL(26.5μM/L) ≥ 증가하거나 7일 이내에 혈청 크레아티닌이 기준선의 1.5배로 증가하거나6시간 동안 소변량이 0.5mL/kg/h ≥< 증가하는 것으로 정의됩니다. 2,3. 수십 년에 걸친 연구에도 불구하고 AKI에 대한 효과적인 치료법은 신장 손상을 완화하거나 신장 회복을 가속화하지 못하며, 상당수의 AKI 환자가 만성 신장 질환(CKD)으로 진행되고 있습니다4,5,6. 복잡한 분자와 경로는 AKI와 그 진행에 부분적으로 관여하므로 전임상 모델은 효율적인 치료 양식의 개발을 위해 이러한 복잡성을 해결할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

임상적으로 허혈-재관류 손상(IRI) 손상은 심장 및 간 수술, 순환 쇼크, 체적 고갈, 패혈증, 신장 혈관 폐색 또는 폐색, 신장 이식 등 다양한 조건에서 AKI의 주요 원인이다7. IRI-AKI 마우스 모델은 1960년대부터 사용되어 왔습니다. 이 모델은 허혈을 유발하는 생쥐에서 비외상성 클램프로 신추경을 외과적으로 클램핑한 후 클램프를 제거하여 신장 혈류를 재관류하여 개발되었습니다. IRI-AKI 모델은 일반적으로 신장 세뇨관 세포 사멸 및 진행성 신장 조직 손상이 특징입니다. IRI는 다음과 같은 몇 가지 이유로 AKI의 발병 기전 및 치료 개입에 사용되는 가장 일반적인 모델 중 하나입니다: (1) 수술 절차의 단순성과 안전성은 IRI-AKI 모델8의 생존율과 성공률을 향상시킵니다. (2) 허혈은 인간 AKI의 주요 병인이기 때문에 IRI-AKI 모델은 임상 AKI 이벤트9를 평가하는 데 더 잘 사용됩니다. (3) IRI 모델은 AKI의 여러 단계에서 신장 손상 및 조직병리학적 변화를 나타낼 수 있으며, 이는 AKI에서 CKD10으로의 진행을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 실험 설계에 따라 IRI 유도 AKI 모델에는 양측 IRI, 반대측 신장이 손상되지 않은 편측 IRI, 동시 반대측 신장 절제술을 통한 편측 IRI가 포함됩니다. 특히, 양측 IRI 모델은 양쪽 신장이 혈액 공급의 영향을 받기 때문에 AKI의 인간 병리학적 상태와 더 관련이 있는 것으로 간주된다11. IRI 모델은 신장 이식, 심장 우회술, 신장 혈관 또는 네프론 보존 수술 후 감소된 신장 혈류의 영향을 시뮬레이션하는 데 적용할 수 있을 뿐만 아니라 저혈압 환경에서도 적용할 수 있다9. 여기에서는 연구자가 허혈 유발 AKI의 기저 발병 기전을 탐색할 수 있도록 일관되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하기 위해 양측 IRI 모델의 절차를 설명합니다.

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프로토콜

생후 8주령, 체중 25g의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 양측 허혈-재관류에 의한 AKI 모델을 확립했습니다. 이전 연구에 따르면, 우리는 약 36.5 °C-37 °C에서 체온을 유지하고, IRI 수술에서 신장 허혈 지속 시간은 30 분입니다12,13. 각 그룹에는 총 6마리의 마우스가 필요했으며, 가짜 작동 마우스가 대조군 역할을 했습니다. 이 연구의 동물 실험은 동물의 복지를 보호하기 위해 Zhejiang University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 연구 절차는 Zhejiang University의 윤리 지침과 원칙에 따라 수행되었습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 모든 수술 기구를 고압 살균합니다.
  2. 멸균 식염수 7.6mL에 케타민 2mL와 자일라진 0.4mL를 첨가하여 마취액을 준비합니다. 복강내 주사로 케타민(80mg/kg)과 자일라진(16mg/kg)의 혼합물로 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 사용하여 마취 깊이를 평가합니다.
  3. 마취된 마우스를 항상열 담요 위에 올려 놓고 기도가 막히지 않도록 합니다. 체온을 36.5-37 °C 범위로 유지하십시오.
  4. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 1% 테트라사이클린 염산염 안연고로 마우스의 눈을 덮습니다.
  5. 이발기로 복부의 털을 면도하고 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위의 피부를 3배 청소합니다.

2. 수술

  1. 수술 용 가위로 피부와 근육층을 통해 복부 중간 절개를 약 1-1.5cm 만들고 스프레더로 복강을 엽니 다.
  2. 후복막 지방을 이동하고 면봉으로 장 및 기타 장기를 오프사이드로 밀어 신장을 노출시킵니다. 신장은 척추 측면에서 약 0.5cm, 13번째 갈비뼈 아래에 있는 후복막 공간에 있습니다.
  3. 가늘고 뾰족한 겸자로 신추경을 절개하여 근막과 지방 조직을 분리 및 제거하고 왼쪽 신장 척추경을 노출시킵니다.
  4. 집게를 사용하여 혈관 클립으로 신장 척추경을 고정하고 혈관 손상이 가능한 한 경미한지 확인합니다. 불완전 신장 허혈을 유발할 수 있는 불필요한 신장 부비동 지방을 클램핑하지 마십시오.
  5. 30분 동안 클램핑하는 것부터 시작하여 신장 허혈 지속 시간을 설정합니다. 성공적인 허혈의 특징은 신장이 몇 분 안에 점차 빨간색에서 짙은 보라색으로 변하는 것입니다.
  6. 신장을 후복막 공간으로 이동합니다. 반대쪽 쪽에서 절차를 반복하여 오른쪽 신장 척추를 노출시키고 고정합니다.
  7. 양쪽 신장이 정확한 허혈 기간을 받을 수 있도록 양쪽의 허혈 시간을 별도로 기록합니다. 절개 부위를 다시 열고 허혈 기간이 끝나면 혈관 클립을 해제합니다.
  8. 신장을 후복막 공간으로 교체한 다음 Vicryl 4-0 봉합사로 근육과 피부를 층별로 봉합합니다.
    참고: 수술 절차는 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 필요할 때 수술 중 75% 에탄올로 수술대와 기구를 세척하십시오.

3. 수술 후 관리

  1. 체액 손실을 보상하기 위해 복강내 주사로 0.5-1mL의 따뜻하고 멸균된 식염수를 투여합니다.
  2. 마우스가 충분한 의식을 회복할 때까지 주의를 기울여 흉골 누운 자세를 유지하십시오. 마우스가 완전한 의식을 얻을 때까지 항상성 담요 위에 마우스를 올려 놓은 다음 케이지로 돌아갑니다. 완전히 회복될 때까지 마우스를 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
  3. 수술 후 통증을 완화하기 위해 처음 3일 동안 12시간마다 부프레노르핀을 0.05-0.10mg/kg씩 투여합니다. 수술용 마우스를 매일 모니터링합니다.

4. 모델 평가

  1. Hematoxylin-Eosin (HE) 염색
    1. IRI 후 1일, 3일, 7일 또는 14일에 복강내 주사로 펜토바르비탈 나트륨을 사용하여 동물을 안락사시킵니다.
    2. 4% 파라포름알데히드(PFA)가 함유된 신선한 신장 조직을 하룻밤 동안 고정하고 4°C에서 75% 에탄올을 사용하여 보관하십시오.
    3. 탈수 및 포매 후 얻어진 샘플을 염색을 위해 8μm 두께로 절단합니다.
    4. 조직 부분을 자일렌으로 탈왁스한 다음 감소하는 에탄올 농도로 재수화합니다.
    5. 조직 부분을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색합니다.
    6. 에탄올과 자일렌의 농도를 증가시켜 조직 부분을 탈수시킵니다.
  2. 신장 기능 분석
    1. 마취 후 안구 채혈 방법을 이용하여 혈액 검체를 채취합니다.
    2. 혈청을 분리하기 위해 12000 x g 에서 10분 동안 혈액 샘플을 원심분리합니다.
    3. 자동 건조 화학 분석기로 혈청 크레아티닌과 혈액 요소 질소(BUN)를 측정하여 신장 기능을 모니터링합니다.
  3. 실시간 PCR (RT-PCR)
    1. Quick RNA 추출 키트를 사용하여 신장 조직에서 총 RNA를 추출한 다음 역전사 효소 혼합 키트로 cDNA를 합성합니다. SYBR Green Premix Kit로 RT-PCR을 수행하고 RT-PCR 기기에서 실행합니다. 여기에 사용된 프라이머 서열은14 이전에 보고되었다: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; 역 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL 포워드, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; 역 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH 포워드, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; 역 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

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결과

수술 중 신장의 상태

성공적인 허혈의 특징은 신장이 1-2분 이내에 빨간색에서 짙은 보라색으로 서서히 변하는 것이며, 성공적인 재관류는 신장이 1-2분 이내에 짙은 보라색에서 빨간색으로 점차 변하는 것이 특징입니다.

수술 후 신장의 조직학

HE 및 PAS(Periodic Acid Schiff) 염색은 급성 신장 손상을 확인하는 직접적인 방법입니다. 허혈-재관류 손상 모델에서 지배적인 부상 부위는 근위세뇨관의 S3 분절입니다. 신장 세뇨관 손상의 전형적인 징후로는 심각한 세뇨관 확장 및 파괴, 덤불 테두리 손실, 벗겨진 파편, 세포 사멸 등이 있습니다. 세뇨관 손상은 또한 맹검 방식으로 손상된 세뇨관의 백분율에 의해 점수가 매겨집니다: 점수 0, 손상 없음; 점수 1, <25% 손상된 세뇨관; 점수 2, 25%-50%...

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토론

본 논문에서는 신장 IRI 모델에 대한 자세한 절차를 제공했으며, 이후 이 모델이 AKI 및 AKI에서 CKD로의 진행을 위한 강력한 모델임을 강조했습니다. 또한, 우리는 신장 조직학과 기능을 포함한 신장 손상의 두 가지 주요 기준의 영향을 입증합니다.

반복 가능하고 신뢰할 수 있는 모델을 위해 수술 절차의 몇 가지 핵심 사항을 강조해야 합니다. 복부 수술의 경우 수술과 관련된 외상을 최소화하기 위해 신장을 노출시키기 위해 정중선 절개를 권장합니다. 후복막 지방으로 인해 신장 척추경을 완전히 절개하기 어렵기 때문에 신장을 앞뒤로 통해 한 쌍의 집게로 지방에서 신장 척추경을 벗겨냅니다. 또한, 수술 과정의 안정성을 유지하기 위해 동일한 혈관 클램프를 적용하는 것이 좋으며, 시술 중 혈관 클램프에 마모가 있는지 여부에 주의하는 것이 좋습니다. 또한 수술 중 신장 손상의 원인이 될 수 있는 체액 손실로 인해 식염수 보충제를 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구에서 협력해 주신 모든 참가자분들께 감사의 말씀을 드립니다. 이 연구는 중국 저장성 자연과학재단(LZ22H050001)과 저장성 프로그램의 자금 지원을 받아 진행되었으며, 이는 웨이창 린(Weiqiang Lin)에 대한 고급 혁신 건강 인재 양성을 위한 저장성 프로그램이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동물 이발기FEIYUBIO19-7002
1ml 주사기LongreenSR60061
에탄올MacklinE885996
거즈FEIYUBIO19-5022
동종 모니터 시스템Warmmate40 x 50
바늘 홀더DKBTCZQ-00160
스프레더RWDR22029-03
멸균 식염수BiosharpBL158A
조직 가위DKBTDC-YKJ1002
조직 핀셋DKBTDK079904
혈관 클립미세 과학 도구18055-02
Vicryl 봉합사Shanghai Jinhuan4 -0 

참고문헌

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