단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리
2023년 10월 27일
본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.
우리는 세포외 소포체 기반 바이오마커 발견을 위해 노력하고 있습니다. 한 가지 중요한 단계는 효율적이고 선택적으로 격리하는 것입니다. 마그네틱 비드 기반 분리를 기반으로 하는 EVtrap은 높은 처리량, 사용하기 쉬우며 특히 임상 응용 분야에 쉽게 사용할 수 있도록 하여 실제로 도움이 될 수 있습니다.
우리는 유방암, 신장암 및 파킨슨병과 같은 다양한 질병에 대한 단백질 및 인단백질 바이오마커의 발견을 위해 이 프로토콜을 사용해 왔습니다. 이 바이오마커는 생체액에서 파생됩니다. EV는 잠재적으로 액체 생검에 사용될 수 있으며, 이는 임상 진단 및 치료를 더욱 개선할 수 있습니다.
현재 세포외 소포체 분리에 가장 일반적으로 사용되는 접근법은 초원심분리 및 침전이지만, 이러한 방법은 오염 물질의 동시 분리와 낮은 효율로 제한됩니다. 따라서 당사의 EVtrap 분석법은 EV를 분리하는 보다 효과적인 방법을 제공하여 보다 재현성 있고 민감한 방법을 가능하게 하고 다운스트림 분석에도 도움이 됩니다. 우리는 두 가지를 위해 노력하고 있습니다.
첫째, EV 격리 및 다운스트림 분석, 특히 대량 백업 기반 분석을 위한 방법과 프로토콜을 지속적으로 개발하고 있습니다. 두 번째는 EVtrap의 장점 때문에 임상 분야에서 다양한 응용 분야를 모색하고 있다는 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 기능화된 자기 비드를 사용하여 요중 세포외 소포체(EVs)를 효율적으로 분리하는 방법을 설명합니다. 또한 바이오마커 발굴에 필수적인 웨스턴 블로팅, 프로테오믹스 및 인산화 프로테오믹스와 같은 후속 분석 방법에 대해 상세히 다룹니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 바이오마커 발굴
- 세포외 소포체
배경
- 세포외 소포체는 액체 생검에 있어 중요합니다.
- 이들은 다양한 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 효율적인 분리는 임상 적용에 있어 매우 중요합니다.
- 생체 시료 내의 단백질과 인산화 단백질은 잠재적인 바이오마커입니다.
연구 목적
- 바이오마커 발굴을 가속화하기 위함입니다.
- EV를 효율적이고 선택적으로 분리하기 위함입니다.
- 임상 진단 및 치료를 개선하기 위함입니다.
사용된 방법
- 자기 비드를 이용한 소변 세포외 소포체 분리.
- 단백질 분석을 위한 웨스턴 블롯팅.
- 바이오마커 식별을 위한 단백질체학 및 인산화 단백질체학.
- 임상 적용을 위한 고처리량 방법.
주요 결과
- 생체 시료로부터 EV의 성공적인 분리.
- 질병과 관련된 단백질 및 인산화 단백질의 식별.
- 액체 생검 응용 분야에서의 잠재력 입증.
- 암 및 파킨슨병의 바이오마커 발견 촉진.
결론
- 본 프로토콜은 EV 분리 효율을 높여줍니다.
- 임상적으로 유의미한 바이오마커의 발견을 지원합니다.
- 진단 및 치료 전략을 개선할 가능성이 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
생체 시료로부터 세포외 소포체(EVs)를 효율적이고 선택적으로 분리하는 것은 바이오 제약 R&D의 프로테오믹스 기반 바이오마커 발굴에 있어 매우 중요한 전환점입니다. 본 화학적 친화성 기반 자성 비드 프로토콜은 고수율의 재현 가능한 EV 분리를 가능하게 하여, 조기 질병 진단 및 타겟 검증에 필수적인 정량적 프로테오믹스 및 인산화 프로테오믹스 분석을 직접적으로 지원합니다. 이 방법은 중개 바이오마커 파이프라인의 예측 신뢰도를 높이며, 리스크가 조정된 포트폴리오의 발전을 뒷받침합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 환자 유래 생체 시료로부터 질환 관련 단백질 및 인산화 단백질 시그니처의 강력한 분석이 가능합니다.
- 후속 기전 연구를 위한 고품질 EV 화물을 제공함으로써 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 재현 가능하고 정량적인 분자 프로파일링을 통해 생물학적 리스크 감소를 촉진합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정량적 질량 분석 워크플로우에 적합한 표준화된 고순도 EV 시료를 제공합니다.
- 오염 물질을 최소화하고 EV 수율을 최대화하여 분석의 재현성과 민감도를 향상시킵니다.
- 고처리량 스크리닝 및 플랫폼 재사용을 위한 확장 가능한 EV 샘플 준비가 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 임상 생체 시료로부터 실시간 분자 스냅샷을 포착함으로써 중개 바이오마커 전략과 부합합니다.
- 일관된 EV 단백질체 및 인산화 단백질체 분석을 가능하게 하여, 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 임상 개발 전 후보 바이오마커에 대한 기전적 리스크 감소(de-risking)를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 EV 분리 프로토콜은 초기 발견 단계와 중개 연구의 접점에 위치하며, 시료 준비 단계와 정량적 프로테오믹스 및 포스포프로테오믹스 분석을 연결합니다.
- 발견 생물학: EV 유래 분자 화물을 이용할 수 있게 하여 가설 검증 및 경로 규명을 촉진합니다.
- 스크리닝: 하위 분석 개발 및 화합물 평가를 위해 재현 가능하고 정량적인 EV 샘플을 제공합니다.
- 분석: 다양한 조건에서 단백질 및 인산화 단백질 풍부도에 대한 고처리량의 통계적으로 견고한 측정을 지원합니다.
- 중개 연구: 환자 샘플부터 전임상 모델까지 바이오마커의 일치성과 연속성을 가능하게 합니다.
- 기업 내 재사용: 다양한 R&D 프로그램을 위해 표준화되고 확장 가능한 EV 분리 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 바이오마커 발굴에 있어 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 프로테오믹스 워크플로우를 위해 표준화되고 재현 가능하며 확장 가능한 EV 분리를 제공합니다.
- 전략적 가치: 견고한 분자 프로파일링을 가능하게 함으로써 go/no-go 결정의 품질과 자본 효율성을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 기반의 우선순위 설정과 바이오마커 및 치료제 후보 물질의 개발 추진을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 최적의 실행과 데이터 해석을 위해 프로테오믹스, 인산화 프로테오믹스 및 EV 생물학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 자기 비드 기반 분리 시스템과 고해상도 질량 분석 플랫폼의 사용이 필요합니다.
- 재현성을 위해 시료 처리 및 분석 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 생체 유체 유형에 적용 가능하지만, 매질에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 정량적 재현성과 민감도는 엄격한 프로토콜 준수 및 분석 교정에 따라 달라집니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
