Name: 냉동 보존된 전혈에 대한 소핵 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 냉동 보존 전혀를 이용한 소핵 분석법으로 방사선에 의한 DNA 손상을 평가하는 방법입니다. 이 프로토콜은 대규모 다기관 연구에서 반복 분석이 가능하여 세포유전학 및 방사선생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원에 대해 L. Pieters, T. Thiron 및 G. De Smet에게 감사의 뜻을 전합니다. 연구를 위해 헌혈해 주신 모든 자원 봉사자들에게 감사드립니다. 이 연구는 그랜트(T000118N)가 이끄는 플랑드르 연구재단(FWO)의 재정 지원을 받았다.

이 연구를 위해 17세에서 65세 사이의 건강한 기증자 30명으로부터 정맥 천자로 혈액 샘플을 수집했습니다. 20명의 기증자로부터 얻은 MN 데이터는 Beyls et al.8 의 논문에서 재사용되었으며, 혈액 샘플 수집은 벨기에 겐트 대학 병원 윤리 위원회(등록 번호: 2019/1565)의 지침을 따릅니다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 혈액 샘플 채취
<ol><li>시작하기 전에 참가자의 서면 동의서가 제공되고 윤리 지침이 적절하게 준수되는지 확인하십시오.</li>
	<li>혈액을 Li-Heparin 튜브에 모으고 냉동 보존을 위해 처리할 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다.</li>
</ol>2. 전혈의 냉동 보존
알림: 세포 수확까지의 모든 단계는 멸균 층류 공기 흐름에서 무균 상태로 수행됩니다.
<ol><li>혈액 1mL를 냉동 보존하려면 800μL의 FCS(Fetal Calf Serum)와 200μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 혼합하여 1mL의 동결 배지를 만듭니다. 알림: 냉동 매체는 냉동해야 하는 혈액 샘플과 동일한 부피로 준비됩니다.</li>
	<li>전혈의 동결 보존을 위해 혈액 샘플을 헤파린화 튜브에서 15 또는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다 알림: 튜브의 용량은 혈액의 양에 따라 다릅니다.</li>
	<li>동일한 양의 동결 매체를 연속적이지만 적하적으로 추가하여 저속으로 혈액을 소용돌이칩니다.</li>
	<li>2mL의 혈액 동결 혼합물을 극저온 산소(2mL)로 옮기고, 각 부분 표본에는 1mL의 혈액 샘플과 1mL의 동결 혼합물이 혼합되어 있습니다.</li>
	<li>단계적 점진적 동결<ol><li>극저온 에너지를 이소프로판올이 들어 있는 극저온 상자에 옮기고 냉동실(-80°C)에 하룻밤 동안 넣습니다.</li>
		<li>장기간 사용을 위해 극저온을 액체 질소로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 냉동 보존된 혈액의 해동
알림: 해동 과정의 총 시간을 제한하려면 한 번에 최대 8개의 극저온 파일(각각 2mL)을 처리해야 합니다.
<ol><li>준비<ol><li>혈액을 해동하기 전에 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 200mL를 37°C로 예열합니다.</li>
		<li>멸균 조건에서 필요한 배양 배지의 작업 용액을 준비합니다. 배양당 배지에 1.6mL의 완전한 배지가 포함되도록 합니다: 페니실린/스트렙토마이신(0.5%), FCS 0.2mL, 피루브산나트륨 20μL, β-메르캅토에탄올 2μL가 보충된 Rosewell Park Memorial Institute(RPMI) 배지. 참고: 해동하는 동안 상당한 수의 혈액 세포가 손실될 수 있기 때문에 해동된 혈액은 총 부피가 2mL인 24웰 플레이트와 같은 작은 웰에서 배양됩니다. 투여량당 하나의 멀티웰 플레이트가 사용됩니다.</li>
		<li>각 배양 웰에 대해 아래 제안된 대로 날짜 및 투여량과 함께 뚜껑에 donor 코드 및 A/B를 표시합니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig01.jpg"> 그림 1: 소핵 분석을 위해 전혈을 배양하기 위한 24웰 플레이트의 제안된 레이아웃. 우물을 표시하고 뚜껑의 적절한 위치에 기증자 코드를 표시하십시오. 각 환자 샘플에 대해 중복 웰은 서로 인접해야 합니다. 10 x 10 콜리메이터에 대한 암시적인 레이아웃이며 콜리메이터 또는 샘플의 크기에 따라 변경할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>전혈 해동 및 배양 단계<ol><li>수조를 37°C로 데우십시오.</li>
		<li>액체 질소에서 필요한 극저온을 꺼냅니다(숫자는 투여 횟수와 같은 요구 사항에 따라 다름). 알림: 하나의 냉동 용기에는 1mL의 혈액과 1mL의 동결 배지가 들어 있습니다. 따라서 하나의 냉동 혈액으로 두 가지 배양을 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>따뜻한 수조에서 냉동 에너지를 부분적으로 해동합니다(작은 얼음 결정이 여전히 보일 때까지).</li>
		<li>수조에서 바이알을 꺼내고 멸균 티슈 페이퍼로 바이알 외부를 청소합니다.</li>
		<li>멸균 층류 후드에서 튜브 내부에 형성된 기포가 쏟아지는 것을 방지하기 위해 바이알을 매우 천천히 엽니다.</li>
		<li>각 바이알의 내용물을 재현탁하고 개별적으로 15mL 원뿔형 원심분리 튜브(바이알당 튜브 1개)로 옮깁니다.</li>
		<li>각 튜브에 튜브를 부드럽게 휘젓면서 따뜻한(37°C) PBS 1mL를 적하 방향으로 추가합니다. P1000 파이펫으로 재현탁합니다.</li>
		<li>희석 및 균일한 세척을 위해 예열된 PBS(37°C) 7mL를 적가하고 P1000 피펫으로 재현탁합니다.</li>
		<li>실온에서 8 × g ( 가속 1, 브레이크 1로 설정)에서 1분 동안 혈액을 원심분리합니다.</li>
		<li>이 대기 단계에서 빈 웰(세포가 배양될 웰 제외)을 500μL의 PBS로 채웁니다.</li>
		<li>웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 예열합니다.</li>
		<li>원심분리가 완료되면 세포 펠릿을 방해하지 않도록 약 1mL를 남기고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>P1000 피펫으로 펠릿을 나머지 상층액에 재현탁시킵니다.</li>
		<li>튜브를 부드럽게 휘젓면서 따뜻한 PBS(37°C) 8mL를 각 튜브에 적하시킵니다. 그런 다음 P1000 피펫으로 재현탁합니다.</li>
		<li>재현 탁 혈액을 180× g 에서 8분 동안 원심분리합니다( 가속 9, 브레이크 9로 설정).</li>
		<li>이 대기 단계 동안 200μL의 배양 배지를 표시된 각 웰에 옮깁니다.</li>
		<li>플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 37°C로 유지합니다.</li>
		<li>원심분리 후 상층액을 연속적으로 제거하되(느슨한 세포 펠릿을 방해하지 않기 위해) 약 80μL의 상층액을 남깁니다.</li>
		<li>펠릿에 280μL의 FCS(실온)를 추가하고 재현탁(총 부피 360μL까지)합니다.</li>
		<li>세포 현탁액 180μL를 각 웰로 옮기고 재현탁합니다(= 0.5mL의 "혈액"/배양). 각 웰의 총 부피는 이제 380μL이며, 그 결과 2mm 중간 층이 생성됩니다.</li>
		<li>방사선 조사 전에 37°C의 CO2 인큐베이터에서 최소 10분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. G0 MN 분석
<ol><li>인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 실온에서 0.5, 1, 2Gy X선(220kV, 13mA, 0.15mm Cu)과 같은 필요한 선량으로 세포 배양을 조사합니다. 가짜 방사선 조사 샘플을 대조군으로 사용하여 자발적인 MN 수율을 식별합니다.</li>
	<li>방사선 조사 직후 각 웰에 1.62mL의 배양 배지(37°C)를 추가합니다.</li>
	<li>T-림프구의 세포 분열을 자극하기 위해 각 웰에 40μL의 피토헤마글루티닌(PHA)을 첨가하고 완전히 재현탁합니다.</li>
	<li>이 플레이트를 인큐베이터(5% CO2, 37°C)에 다시 넣습니다. 참고: 이것은 분석의 시작 시간 입니다.</li>
	<li>웰당 8μL의 cytochalasin B(6μg/mL)를 추가하여 자극 23시간 후 사이토카인시스를 차단하고 적절하게 재현탁합니다.</li>
	<li>자극/배양 시간 후 70시간 후에 세포 배양을 수확합니다. 세포를 재현탁하여 15mL 튜브로 옮깁니다. PBS 2mL로 각각을 잘 헹구고 이 PBS를 각각의 15mL 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>실온에서 180× g에서 8분 동안 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액은 버리고 펠릿 위에 약 500μL를 남겨 둡니다.</li>
	<li>펠릿을 소용돌이치고(최고 속도로) 소용돌이치는 동안 차가운 염화칼륨(KCl, 4°C) 2mL를 천천히 적하합니다.</li>
	<li>즉시 세포를 180× g 에서 8분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 약 500μL의 상층액을 남깁니다.</li>
	<li>펠릿을 소용돌이치고(최대 속도로) 소용돌이치는 동안 차가운 고정액 2mL (4:1:5의 비율로 메탄올/아세트산/링거 용액)를 천천히 적가합니다.</li>
	<li>샘플 튜브를 4°C(최소 12시간 및 최대 96시간)에서 밤새 그대로 둡니다.</li>
	<li>180 × g에서 8분 동안 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 버리십시오.</li>
	<li>펠릿을 소용돌이치고(최대 속도로) 소용돌이치는 동안 차가운 고정제 2 (4:1 비율의 메탄올/아세트산) 2mL를 천천히 적가합니다.</li>
	<li>180× g에서 8분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리십시오.</li>
	<li>펠릿을 소용돌이치고(최대 속도로) 소용돌이치면서 2mL의 냉 정착액 2 를 펠릿에 천천히 추가합니다(적하).</li>
	<li>샘플 튜브를 4°C(최소 12시간 및 최대 96시간)로 둡니다.</li>
	<li>이소프로판올로 슬라이드를 청소하고 적절하게 라벨을 붙입니다. 알림: 인쇄된 스티커를 사용하여 라벨을 부착하면 마커 잉크가 처리하는 동안 쉽게 닦아낼 수 있습니다.</li>
	<li>샘플 튜브를 180× g에서 8분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 다른 튜브로 옮겨 펠릿의 크기에 따라 세포를 농축합니다.</li>
	<li>펠릿을 소용돌이치게하십시오.</li>
	<li>40μL의 고정 셀을 건조하고 깨끗한 슬라이드에 떨어뜨립니다.</li>
	<li>슬라이드를 실온에서 말리십시오. 관찰을 위해 슬라이드를 상자에 보관하거나 즉시 얼룩을 지으십시오.</li>
</ol>5. アクリッチン 오렌지 (AO) 염색
<ol><li>슬라이드를 AO 스테인에 1분 동안 담근 다음 증류수로 빠르게 세척한 다음 슬라이드를 인산염 완충액(pH 6.8)에 1분 동안 넣습니다.</li>
	<li>완충액에서 슬라이드를 꺼내 깨끗한 티슈 페이퍼로 슬라이드 뒷면을 말리고 깨끗한 티슈 페이퍼에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드 위에 인산염 완충액 20μL를 떨어뜨리고 기포를 피하면서 깨끗한 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.</li>
	<li>이 슬라이드를 실리콘 시멘트로 밀봉하십시오. 알림: AO는 빛에 민감하고 시간이 지남에 따라 희미해지기 때문에 좋은 대비와 형광을 위해 염색 후 5일 이내에 슬라이드에 점수를 매기는 것이 좋습니다. 슬라이드를 검사하지 않을 때는 항상 차가운 방(4°C)에 보관하십시오.</li>
</ol>6. 스테인드 슬라이드 채점
<ol><li>슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓고 1,000개의 이핵 세포(BN)를 검사합니다. 독성의 6가지 바이오마커 중 하나인 MN을 수동으로 계산합니다. 이를 위해 두 명의 독립적인 scorer가 동일한 배율에서 500BN 세포/슬라이드를 검사하도록 합니다. 알림: 다음은 페네치가 스테인드 슬라이드9를 채점하기 위해 권장하는 채점 기준의 몇 가지 주요 사항입니다.<ol><li>거의 동일한 크기, 규칙적인 모양 및 염색 패턴의 잘 구별되는 두 개의 핵을 가진 온전한 세포질을 가진 멋지게 둥근 세포를 찾아 BN 세포를 선택합니다. BN 세포의 세포질이 인접 세포의 세포질과 구별할 수 있는지 확인합니다.</li>
		<li>MN을 점수화하여 형태학적으로 동일하지만 주요 핵보다 작다는 점에 주목합니다. 가장 큰 MN조차도 주핵 직경의 1/3을 넘을 수 없습니다. MN은 주핵에 닿지 않거나 적어도 미세핵 경계가 주핵의 경계와 구별될 수 있는 경우에만 점수를 매깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

방사선 조사된 전혈 샘플에서 미세핵 수율 검사

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<li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li>
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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

CBMN 분석의 적용을 위한 수정된 프로토콜은 혈액 샘플을 대량으로 저장하는 비교적 쉽고 편리한 방법입니다. 이 절차는 동결 보존 및 CBMN 분석 중에 처리해야 하는 모든 미세하지만 중요한 세부 사항을 간략하게 설명합니다. 다른 실험실 프로토콜은 일반적으로 동결 혼합물에 10% DMSO를 사용하는 반면, 당사의 동결 혼합물에는 80% FCS와 함께 20% DMSO가 포함되어있습니다 7. 이 동결 혼합물이 전혈 샘플에 동일한 부피로 첨가되기 때문에 최종 농도도 10% DMSO입니다. 세포 생존율을 높이고 세포 분열을 촉진하기 위해 1% 피루브산 나트륨과 0.1% 베타-메르캅토에탄올을 완전 배양 배지(cRPMI)에 첨가합니다. 이는 당사 연구 그룹 6,8에서 수립한 세포 배양 프로토콜에 따른 것입니다.
해동 중 세포 응집 문제는 이 프로토콜에서 완전히 해결할 수 없었지만 세포 분리는 다른 기존 프로토콜보다 우수했습니다. 해동 후 세포를 회수하기 위해 배양 배지를 일관되고 갑작스럽게 추가하는 대신, 세척 단계에서 예열된 PBS(37°C)를 적가했을 때 더 나은 결과를 얻었습니다. 이러한 개선은 세포 스트레스를 줄이는 데 도움이 되며 입증된 높은 세포 회수율로 뭉침을 최소화합니다. 또한, RPMI를 통해 PBS를 사용했을 때 세포 생존율의 명확한 차이는 관찰되지 않았습니다. 동결 보존 기간(최대 1년)의 길이가 방사선 조사 및 비방사선 시료 모두에서 MN 수율에 영향을 미치지 않는다는 것이 그룹에 의해 검증되었습니다 6,8. 연구에 따르면 PBMC의 우수한 세포 생존율과 증식은 저온(액체 질소)에서 점진적으로 동결한 후10,11을 해동하는 동안 예열된 배지를 점진적으로 첨가하여 달성할 수 있습니다. 연구자들은 해동된 전혈에서 T-림프구의 하위 집단이 해동된 PBMC에서 관찰된 것과 비슷하다는 것을 보여주었다12. 또한, 냉동보존된 전혈 샘플로부터 회수된 세포 아형은 신선한 전혈 샘플에서 관찰된 것과 유사하다는 것이 입증되었다 13,14.
보고서에서 얻은 지표 결과를 검토하면 선량에 따른 선형 2차 증가(그림 3)가 선형 에너지 전달(LET) 유도 소핵15,16에 대한 다른 문헌 보고서와 일치함을 알 수 있습니다. 냉동 보존된 전혈 샘플(표 1)에서 관찰된 MN 수율의 변동성은 신선한 전혈 배양에 대해 보고된 것과 범위 내에 있습니다 8,17,18. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 20명의 건강한 지원자의 신선하고 냉동 보존된 전혈에서 검증되었습니다8. 이 보고서에서 관찰된 세포 증식의 중요한 매개변수인 핵 분열 지수(NDI)는 신선한 전혈19,20에 대해 제안된 것과 일치했다. 종합하면, 전혈 및 변형된 소핵 분석의 최적화된 동결 보존 프로토콜은 더 나은 세포 수율을 제공하므로 방사선 민감도 평가에 이 프로토콜의 적응이 권장됩니다. 프로토콜의 재현성은 이미 검증되었기 때문에8, 대규모 및 다기관 연구에 적용할 수 있는 것이 제안된다.

발견 이후 이온화 방사선(IR)의 사용은 생명체에 대한 악영향 때문에 연구자들 사이에서 논쟁의 대상이 되어 왔습니다. 해로운 영향은 일반적으로 이중 가닥 절단(DSB)과 같은 DNA 손상에 의해 나타나며, 이러한 DSB를 복구하지 못하면 암의 중요한 특징인 염색체 이상 및 돌연변이가 발생합니다 1,2. 이러한 염색체 이상은 사이토키네시스 블록 소핵(cytokinesis-block micronucleus, CBMN) 분석과 같은 세포형성 분석법으로 검사할 수 있다. 소핵은 딸핵에 통합될 수 없는 후행 염색체 조각이므로 유사분열 중에 남게 됩니다.
CBMN은 생체 내 또는 체외 이온화 방사선에 노출된 개인의 염색체 손상을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 신뢰할 수 있는 세포유전학 기술입니다. 신선한 전혈 또는 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CBMN 분석에 사용할 수 있습니다. PBMC의 분리 및 처리는 시간이 많이 걸리고 세포 생존 및 성장을 위한 지지 매체 역할을 하는 혈청 혈장의 손실이 수반될 수 있기 때문에 신선한 전혈이 대부분 선택되는 생물학적 물질입니다. 양호한 이핵 세포 수율을 달성하려면 채취 직후 신선한 전혈을 처리해야 합니다. 그러나 즉각적인 처리의 필요성은 시간 제약으로 인해 물류적으로 어려울 수 있습니다. 더욱이, 많은 샘플이 장기간에 걸쳐 수집되거나 처리 센터에서 멀리 떨어진 지점에서 수집되어야 하는 경우, 신선한 혈액 샘플의 보관은 제한 요인이 될 수 있습니다 3,4.
또한, 동일한 개인/환자에서 반복적인 MN 분석을 허용하려면 혈액 샘플을 동결하는 것이 좋습니다. CBMN 분석실험의 나중에 적용을 위해 림프구를 저장하는 한 가지 방법은 분리된 PBMC 5,6을 동결하는 것입니다. 그러나 이 기술은 PBMC를 동결하기 전에 몇 가지 처리 단계를 거쳐야 합니다. 따라서 전혈의 동결 보존은 분리된 PBMC의 동결 보존에 대한 간단하고 시간 효율적인 대안이 될 것입니다. 림프구의 증식이 필요한 세포유전학 분석 또는 분석을 위한 냉동 전혈의 사용에 관한 정보는 거의 없습니다. 중기 분석을 위해 냉동 보존된 전혈을 사용한다고 보고한 논문은단 한 편뿐이다 7.
전혈의 동결 보존은 생체 모니터링, 생체 선량 측정 및 방사선 민감도 평가 분야에서 많은 이점을 제공하기 때문에 우리 그룹은 CBMN 분석의 적용이 가능한 전혈에 대한 동결 보존 프로토콜을 최적화했습니다8. 우리는 냉동 보존된 전혈 배양에 존재하는 림프구가 최소 1년 동안 게놈 무결성과 증식 능력을 유지한다는 것을 입증했습니다. 이 방법 논문에서는 Beyls et al.8에 의해 최적화된 동결 보존 절차 및 CBMN 분석 프로토콜을 자세히 설명하고 30명의 건강한 개인의 냉동 혈액 샘플에 대해 얻은 결과를 보고합니다. CBMN 분석의 경우, 동결 보존된 전혈 샘플의 림프구에서 MN 반응을 평가하기 위해 0.5, 1 및 2 Gy의 용량으로 혈액 배양을 시험관 내에서 조사했습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>24-well cell suspension plate&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2779</td><td></td></tr><tr><td>96% 알코올</td><td>ChemLab</td><td>CL00.1807.2500</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Merck 생명 과학</td><td>8,18,75,52,500</td><td></td></tr><tr><td>아크리딘 오렌지</td><td>Merck 생명 과학</td><td>235474-5g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck 생명 과학</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>631-1365</td><td>22 x 50</td></tr><tr><td>Cryobox (Mr.Frosty)</td><td>Nalgene, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials 2ml</td><td>Novolab</td><td>A04573</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalsin B&nbsp;</td><td>Merck 생명과학</td><td>C6762-10</td><td>10mg</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Merck 생명과학</td><td>D4540-500ml</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fixative 1</td><td></td><td></td><td>메탄올/아세트산/링거(4:1:5 비율</td></tr>) <tr><td>Fixative 2</td><td></td><td></td><td>메탄올/아세트산(4:1</td></tr><tr><td>GURR 비율) 완충</td>액 <td>Thermo Fischer scientific</td><td>10582013</td><td>인산염 완충액 (pH 6.8)</td></tr> <tr><td>KCl</td><td>Merck 생명 과학</td><td>1,04,93,60,250</td><td>75 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck 생명 과학</td><td>1,04,87,30,250</td><td></td></tr><tr><td>Li-heparin 튜브</td><td>BD Life sciences</td><td>367526-LH170 I.U.</td><td>BD 바쿠테이너</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 scinetific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO2</td><td>Merck 생명 과학</td><td>10,65,80,500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck 생명 과학</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>개체 슬라이드</td><td>VWR</td><td>MENZAA00000112E04</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/mL + 10,000 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin (PHA-M)</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Ringer 용액</td><td></td><td></td><td>에는 NaCl, KCl, CaCl2 가 증류수에 용해되어 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>52400041</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 접착 씰런트</td><td>콜랄</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td> <td>나트륨Thermo Fischer scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>멸균 온난 PBS (37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td>는 NaCl을 함유하고 있습니다. Na2HPO2, KH2PO4 증류수</td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr>에 용해</tbody></table>

냉동 보존된 전혈에 대한 소핵 분석

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

체외 사이토카인시스 블록 소핵(CBMN) 분석은 방사선 생물학 연구, 생물학적 선량 측정, 유전 독성 연구 및 체외 방사선 민감도 검사에서 널리 사용되는 기술입니다. 이 세포유전학적 방법은 세포 분열 중에 지연되는 염색체 조각으로 인한 이핵 세포의 미세핵 검출을 기반으로 합니다. 신선한 전혈 샘플은 CBMN 분석에 가장 선호되는 샘플 유형입니다. 그러나 신선한 혈액 샘플로 작업할 때의 단점은 혈액 채취 후 즉시 처리되고 추가 혈액 샘플링 없이 수행할 수 있는 반복 분석 횟수가 제한되어 있다는 것입니다.
신선한 혈액 샘플에 대한 필요성이 논리적으로 어려울 수 있기 때문에 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 CBMN 분석은 특히 대규모 환자 연구에서 큰 이점이 될 것입니다. 이 논문은 전혈 샘플을 동결하고 이러한 동결 혈액 샘플에 대해 CBMN 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 건강한 지원자의 혈액 샘플은 서로 다른 시점에서 동결 및 해동된 다음 수정된 소핵 분석 프로토콜을 거쳤습니다. 결과는 이 최적화된 절차가 냉동 혈액 샘플에 대한 CBMN 분석의 수행을 허용한다는 것을 보여줍니다. 설명된 동결 보존 프로토콜은 또한 다른 세포유전학 분석 및 증식하는 림프구를 필요로 하는 다양한 기능적 분석에 매우 유용할 수 있다.

프로토콜의 재현성을 검증하기 위해 17세에서 65세 사이의 건강한 지원자 30명의 냉동 보존된 혈액 샘플에 대해 MN 분석을 수행했습니다. 그룹의 평균 연령은 35세입니다. 냉동 보존 기간은 1주일에서 154주 사이였습니다. 전혈 세포 배양을 다양한 방사선량(0.5, 1 및 2Gy)에 노출시킨 후, 1,000개의 BN 세포에서 미세핵 수율을 현미경으로 검사했습니다. 멋지게 둥근 이핵 세포( 그림 2에서 볼 수 있음)는 냉동 보존된 전혈 샘플에서 건강한 생존 가능한 세포를 성공적으로 회수했음을 나타냅니다. 주목할 점은 림프구의 방사선 반응이 초저온(액체 질소)에서 장기간 보관한 후에도 안정적으로 유지되었다는 것입니다. 이 관찰은 신선한 혈액 샘플에서 예상되는 반응과 일치합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg"> 그림 2: 1년 전에 냉동 보존된 냉동 전혈 샘플에서 채취한 이핵 세포에서 관찰된 미세핵. (a) 배율 200x, (b) 배율 400x; MN을 가리키는 화살표. 눈금 막대 = 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
방사선량(0.5, 1 및 2 Gy)이 증가함에 따라 소핵 수율의 선형-2차 증가가 관찰되었습니다(표 1 및 그림 3). 가짜 방사선 조사 대조군 샘플(0Gy)의 MN 수율은 주로 지연 염색체의 결과인 배경 MN 수율을 나타냅니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>복용량 (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>평균의</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr><tr><td>SD</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr><tr><td>이력서 (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr><tr><td>레인지</td>
			<td>5-41</td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 30명의 건강한 기증자의 냉동 보존된 전혈 샘플에서 관찰된 평균 MN 수율에 따른 변동 범위 및 변동 계수는 개인 간 변동성을 나타냅니다. 약어: CV = 변동 계수; SD = 표준 편차.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg"> 그림 3: 30명의 기증자의 대조군 및 방사선 조사된 냉동 보존된 전혈 샘플에서 관찰된 소핵 수율. 냉동 보존 기간은 1주일에서 154주까지 다양했습니다. 산점도 그래프는 개별 값을 보여줍니다. 군집의 선은 그룹의 평균± SD를 나타냅니다. 약어: MN = 소핵; BN = 이핵. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
사람의 MN 수율의 개인 간 변동을 조사하기 위해 변동 계수(CV)를 계산했습니다( 표 1 참조). 방사선 유도 MN의 경우, 모든 선량(0.5, 1 및 2 Gy)에 대해 25%&lt; CV가 얻어졌으며, 이는 수정된 프로토콜의 우수한 재현성을 나타냅니다.

여기서는 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 사이토카인시스 블록 소핵 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 소핵 분석을 위한 전혈의 이 최적화된 냉동 보존 방법은 대규모 샘플링 및 다기관 연구에 신뢰할 수 있는 기술이며 다른 혈액 관련 분석에도 사용할 수 있습니다.

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, ...

우리의 연구는 주로 전리 방사선이 건강한 조직에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다. 우리는 암에 걸린 사람과 DNA 복구 장애가 있는 사람의 염색체 전파 민감도를 연구하고 있습니다. 또한 생물학적 비대칭성(biological dissymmetry)에 관여하여 전리 방사선 노출로 인한 DNA 손상을 평가합니다.이 분야의 연구를 발전시키기 위해 당사는 고처리량 분석을 위해 자동화된 현미경 시스템을 사용합니다. 신선한 전혈 샘플은 환자의 불편함을 최소화하면서 쉽게 얻을 수 있기 때문에 소핵 분석에 가장 선호되는 샘플 유형입니다. 그러나 즉각적인 처리의 필요성은 시간 제약으로 인해 물류적으로 어려울 수 있습니다.전혈 샘플의 동결은 추가 샘플링 없이 반복적인 분석이 가능합니다. 이 절차는 대규모 및 다기관 연구에서 혈액 샘플을 저장하는 쉽고 시간 효율적인 방법입니다. 전혈의 동결 보존 프로토콜은 소핵 분석뿐만 아니라 림프구의 증식이 필요한 다른 세포유전학적 분석 또는 기능 분석에도 이점을 제공합니다.

the-micronucleus-assay-on-cryopreserved-whole-blood

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

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