Name: 전동 장치를 사용한 단일 세포 분석을 위한 조직의 기계적 해리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 학습하세요 저비용 전동 장치를 활용한 조직의 기계적 및 효소적 해리 방법으로 단일 세포 현탁액을 제조하는 기술입니다. 이 프로토콜은 면역학 및 생물의학 연구에서 유세포 분석을 위한 신뢰할 수 있는 세포 분리를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fischell Department of Bioengineering(KM), T32 GM080201(MA), Vogel Endowed Summer Fellowship(MA), LAM Foundation(KM) 및 American Lung Association(KM)에서 자금을 지원받았습니다. 저자는 편집에 도움을 준 Michele Kaluzienski에게 감사의 뜻을 전합니다.

이 프로토콜은 UMD IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 7주에서 9주령의 암컷 C57BL/6J 마우스의 조직을 이 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).
1. 수동 해리
참고: 이 단계는 Maisel K. et al.7에서 발췌한 것입니다.
<ol><li>절개된 조직을 제거하고 5% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 저온 세포 배양 배지에 넣습니다.</li>
	<li>파편이 치수에서 1mm보다 작아질 때까지 날카로운 해부 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.</li>
	<li>다진 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 배지 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>분리되는 조직과 세포 유형에 따라 소화 효소를 추가합니다. 제시된 실험에는 콜라겐분해효소 4(1mg/mL), 콜라겐분해효소 D(1mg/mL) 및 DNase(40μg/mL)를 사용합니다.</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 셰이커 또는 로커에서 배양 내내 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 샘플을 위아래로 100회 피펫팅합니다.</li>
	<li>EDTA를 추가하여 5mM 농도의 시료 부피를 얻습니다. 샘플을 위아래로 100회 피펫팅한 다음 샘플을 위아래로 100회 세게 피펫팅합니다.</li>
	<li>샘플을 70μm 세포 스트레이너에 통과시키고 50mL 또는 15mL 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>수집된 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 실온에서 1분간 배양합니다.</li>
	<li>9mL의 차가운 1X 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 용해 완충액을 중화합니다.</li>
	<li>수집된 세포를 다시 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 원하는 완충액 또는 배지에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
</ol>2. 반자동 기계적 해리
<ol><li>절개된 조직을 5% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 저온 세포 배양 배지에 넣습니다. 참고: 이 프로토콜은 고형 조직에서 세포를 분리하기 위한 것입니다.</li>
	<li>조직 조각이 치수에 관계없이 약 5mm가 될 때까지 날카로운 해부 가위를 사용하여 조직을 자릅니다. 잘게 썬 조직을 C-튜브에 옮기고 배지 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>C-튜브를 장치에 로드합니다. 튜브 홀더 플레이트(보충 그림 1A)를 D자형 튜브 바닥에 맞춥니다.</li>
	<li>텐션 암을 아크릴 플레이트에 래치하여 튜브를 모터 플레이트에 고정합니다(보충 그림 3).</li>
	<li>사용자 지정 프로그램 설정: 전진, 30초; 후진, 10초; 루프, 4회.<ol><li>파란색 버튼을 눌러 메인 메뉴에서 사용자 지정 모드를 선택합니다.</li>
		<li>첫 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 30초가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 정방향 회전 시간을 30초로 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 다음 메뉴 화면으로 이동합니다.</li>
		<li>두 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 10초가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 역회전 지속 시간을 10초로 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 다음 메뉴 화면으로 이동합니다.</li>
		<li>세 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 2.5.2X가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 2.5.2-2.5.3단계에서 설정한 선택을 반복할 횟수를 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 프로그램을 시작합니다. 알림: 사용자 지정 프로그램은 장치 메모리에 저장되지 않지만 더 빠른 작동을 위해 사전 설정 프로그램 중 하나로 프로그래밍할 수 있습니다(장치 프로그래밍 지침은 보충 파일 1).</li>
	</ol></li>
	<li>볼륨을 조정하여 200rpm에서 사용자 지정 프로그램 실행tage LCD 화면의 오른쪽 하단 모서리에 계산된 rpm 값이 3(추가 그림 4)이 표시될 때까지 제어 다이얼(보충 그림 4).</li>
	<li>분리되는 조직 및 세포 유형에 따라 4mL 배지에 분해 효소를 추가합니다. 참고: 제시된 실험에는 콜라겐분해효소 4(1mg/mL), 콜라겐분해효소 D(1mg/mL) 및 DNase(40μg/mL)를 사용합니다.</li>
	<li>C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 200rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 10초; 루프, 4회.</li>
	<li>튜브가 로드된 상태로 장치를 37°C 인큐베이터로 45분 동안 옮깁니다.</li>
	<li>C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 50rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 30초; 루프, 9회.</li>
	<li>EDTA를 추가하여 샘플에서 5mM 농도를 얻습니다.</li>
	<li>C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 100rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 10초; 루프, 2회.</li>
	<li>70 μm 셀 스트레이너를 통해 샘플을 밀어 넣고 50 mL 또는 15 mL 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>수집된 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 1mL의 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 실온에서 1분간 배양합니다.</li>
	<li>9mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 용해 완충액을 중화합니다.</li>
	<li>수집된 세포를 다시 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 원하는 완충액 또는 배지에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>그래프 및 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>쌍을 이루지 않은 Welch t-검정 을 사용하여 표본 크기 n > 마우스 4마리가 2번의 반복 실험을 나타내는 표본 쌍 또는 그룹을 비교합니다. 참고: 차이는 (p < 0.05)일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.</li>
</ol>

단일 세포 분석을 위한 반자동 기계-효소 조직 분리

<ol><li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).</li>
<li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeiskirchen%2C+S+%22Fibrosis%3A+Methods+and+Protocols%22">Fibrosis: Methods and Protocols</a>. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).</li>
<li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+CIRP%22%5BJournal%5D)">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li>
<li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).</li>
<li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li>
<li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Hematology+and+Blood+Transfusion%22%5BJournal%5D)">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carpal+tunnel+syndrome%3A+a+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333(2020).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 장치는 후속 단일 세포 분석을 위해 전체 조직에서 단일 세포 현탁액을 제공하기 위해 연구 환경에서 쉽게 조립할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 기능은 기본적이지만 학술 환경 및 그 밖의 분야에서 연구자의 요구를 충족하기에 충분합니다. 이 장치 사용의 주요 이점은 변동성을 줄임으로써 단세포 현탁액의 준비를 개선할 수 있다는 것입니다. 또한 12+ 시료를 동시에 처리할 수 있는 기능은 시료 간 일관성을 향상시킬 수 있으며, 이는 수동 해리 프로토콜에 필요한 시간 증가의 영향을 받을 수 있습니다. 연구 기관 및 산업 환경에서 이와 같은 장치 및 기타 상업적으로 이용 가능한 장치를 사용하면 더 빠르고 사용자 정의 가능한 조직 처리를 수행할 수 있습니다. 그러나 상용 장치는 여기에 설명된 장치 비용의 10배가 넘기 때문에 특히 리소스가 부족한 연구 환경에서 접근성이 제한됩니다 8,9. 학술 실험실에서 이 장치를 사용하면 연수생(...

단일 세포 분석은 유세포 분석, 다양한 세포 유형 식별, 단일 세포 염기서열 분석 또는 세포 간 게놈 또는 전사체 변이 식별과 같은 응용 분야에서 새로운 생물의학적 발견에 빠르게 중요해지고 있습니다1. 관심 조직에서 이러한 세포 분리를 수행하려면 절개된 조직을 다지고 미세한 세포 여과기를 통해 밀어 넣어 원하는 세포에서 결합 조직을 걸러내야 합니다(그림 1A). 수지상세포나 대식세포와 같은 부착성 세포 유형 또는 특히 섬유질 조직에서 세포를 분리하려면 추가적인 기계적 또는 효소적 분리 단계가 필요합니다 2,3,4. 이 공정은 일반적으로 수동으로 수행되므로 시간이 많이 소요되고 세포 수율과 시료 생존율을 평가할 때 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 따라서 자동화된 조직 해리를 위한 맞춤형 옵션을 도입하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템을 설계하려는 시도가 있었지만 기존 옵션은 특히 학술 실험실과 자원이 부족한 환경에서 항상 쉽게 접근할 수 있는 것은 아니며, 이는 주로이러한 장치의 비용 부담으로 인해 5. 더욱이, 이러한 장치들이 항상 연구 그룹의 개별적인 필요에 맞게 맞춤화될 수 있는 것은 아니다6.
여기서, 조직 해리기 장치는 소화 효소 및 기계적 파괴의 도움으로 전체 조직 또는 조직 조각의 소화를 단일 세포 현탁액으로 자동화하도록 설계되었습니다. 이 장치는 실험실에서 쉽게 조립할 수 있고, 온도 조절을 위해 가열 또는 냉각 챔버에 배치할 수 있으며, 해리하는 데 필요한 조직 수에 맞게 맞춤화할 수 있으며, 원하는 해리 프로토콜로 프로그래밍할 수 있습니다. 이 장치를 광범위하게 사용하면 세포 추출 프로토콜의 재현성을 크게 개선하고 수동 해리에 대한 시간 절약형 대안을 제공할 수 있습니다.
이 설계는 자동화된 프로세스를 통해 최대 12개의 조직을 동시에 분해할 수 있습니다. 이 장치는 병렬로 연결된 12개의 개별 모터로 구성되며 모터의 회전/속도를 제어하기 위해 조정 가능한 전압 다이얼이 있는 AC/DC 어댑터를 통해 표준 벽면 플러그로 전원이 공급됩니다. 모터는 C-튜브 상단에 꼭 맞는 육각 볼트를 돌립니다. C-튜브는 모터가 고정되는 상단 플레이트에 양쪽으로 고정되는 아크릴 판의 아래쪽 장력에 의해 제자리에 고정됩니다(그림 1B). 모터는 병렬로 배선되어 있기 때문에 주어진 전압에서의 속도는 크게 변하지 않아야 하지만 전압이 일정하게 유지되더라도 부하(장치에 장착된 C-튜브의 수)는 속도에 영향을 미칩니다. 분당 회전수(rpm)를 측정하기 위해 홀 효과 센서와 모터 샤프트 중 하나에 고정 자석을 사용하여 회전 속도계가 통합되었습니다(보충 그림 1). 모터 어레이 구축을 위한 CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에 나와 있습니다. 또한 모터에 전달되는 양전하/음전하를 역전시켜 회전 방향을 반전시키는 프로그래밍 가능한 스위치가 포함되어 있습니다. 이러한 모든 기능은 Arduino Nano(보충 코딩 파일 2)에서 코딩된 소프트웨어(Arduino IDE 소프트웨어, 재료 표 참조)를 사용하여 통합됩니다. 연결된 버튼과 LCD 패널(보충 그림 2)을 사용하여 저장된 프로토콜과 사용자 지정 프로토콜을 생성 및 실행하고, 프로토콜의 지정된 시간에 회전 방향을 자동으로 반전하고, 전압(보충 그림 3)을 사용하여 속도를 조정하고, 프로그래밍된 프로토콜을 완료하는 데 남은 현재 모터 속도와 시간을 표시할 수 있습니다(보충 그림 4).
본 연구의 경우, 이 장치를 사용한 기계-효소 조직 해리와 수동 효소 조직 해리를 모두 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비하여 다운스트림 응용 분야를 위해 회수된 세포에서 차이점이 있는 경우 이를 측정했습니다. 세포 제제는 조직당 총 세포 수율과 세포 생존율 비율을 기준으로 평가되었습니다. 유세포 분석은 표면 마커 발현의 전위차를 비교하는 데 사용되었습니다. 데이터는 그래프 및 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 짝을 이루지 않은 Welch t-검정 을 사용하여 표본 크기 n > 4마리의 마우스가 2번의 반복 실험을 나타내는 표본 쌍 또는 그룹을 비교했습니다. 이 장치의 제조 및 조립에 대한 자세한 지침은 보충 파일 1. 이 프로토콜에 필요한 자료는 재료 목차에 나열되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&frac14; 인치 아크릴 시트&nbsp; 12" x 24"</td><td>아크릴 Mega Store</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&frac12; 인치 아크릴 시트 12" x 12"</td><td>SimbaLux</td><td>SL-AS13-12x12</td><td></td></tr><tr><td>12 G 스테인레스 스틸 와이어 (텐션 암용)</td><td>Everbilt</td><td>1000847413</td><td></td></tr><tr><td>16 G 전선 (연선)</td><td>최고의 연결</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 mm 자석&nbsp; &nbsp;</td><td>SU-CRO0587</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2채널 릴레이 보드(모터에 대한 전류의 극성 반전)</td><td>AEDIKO</td><td>AE06233</td><td></td></tr><tr><td>37mm 직경 DC 모터(12V, 200rpm) x 12Greartisan</td><td></td><td>N/A</td><td>정격 토크: 2.2 Kg.cm 감속비: 1:22 정격 전류: 0.1 A D 모양 출력 샤프트 크기: 6 x 14mm(0.24" x 0.55")(D x L) 기어박스 크기: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) 모터 크기: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) 장착 구멍 크기: M3 (포함되지 않음)</td></tr><tr><td>가변 전압 컨트롤러가 있는 AC/C 전원 어댑터&nbsp; &nbsp; (5 암페어, 3-12볼트)</td><td>Mo-gu</td><td>J19091-2-MG-US</td><td></td></tr><tr><td>AC-DC 5 V 1 A 정밀 버크 컨버터 스텝 다운 변압기</td><td>Walfront</td><td>1A</td><td>(아두이노 나노 전원을 공급하기 위한 전원 어댑터)</td></tr><tr><td>아두이노 나노&nbsp; &nbsp; (라프빈)</td><td>LAFVIN 8541582500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>버튼&nbsp;</td><td>Awpeye</td><td>푸시 버튼</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J 마우스&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 4</td><td>Worthington</td><td>CLS4 LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>양면 폼 테이프</td><td>SANKA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>양면 프로토 타이핑 회로 기판</td><td>deyue</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>전기 납땜 및 납땜 인두</td><td>LDK</td><td>1002P</td><td></td></tr><tr><td>전기 테이프</td><td>3M</td><td>03429NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS (소 태아 혈청)</td> <td>Gibco</td><td>16140089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad, La Jolla, CA</td><td></td><td>그래프 및 통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>홀 효과 센서 치수 : 0.79 x 0.79x 0.39 인치</td><td>SunFounder</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>육각 커플러 6 mm 보어 모터 황동 x 2 x 12</td><td>Uxcell</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>육각 머리 볼트(M4-.70 X 12 육각 머리 캡 나사) x 12</td><td>FAS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>점퍼 와이어(Arduino Nano용)</td><td>ELEGOO</td><td>EL-CP-004</td><td></td></tr><tr><td>LCD 화면</td><td>JANSANE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>M3 육각 소켓 헤드 캡 나사 x 12</td><td>Shenzhen Baishichuangyou Technology co. Ltd</td><td>310luosditaozhuang</td><td></td></tr><tr><td>M3 스테인리스 스틸기계 나사 플랫 헤드 헥스 소켓 캡 나사 (30 mm) x 36</td><td>아직 깨어 있음</td><td>a52400001</td><td></td></tr><tr><td>빠른 분리 단자 커넥터</td><td>IEUYO</td><td>22010064</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼 (10x)</td><td>셀 신호</td><td>46232</td><td></td></tr><tr><td>단자 어댑터 실드 확장 보드 Arduino Nano&nbsp; 12" x 24"</td><td>Shenzhen Weiyapuhua 기술</td><td>60-026-3</td><td></td></tr></tbody></table>

전동 장치를 사용한 단일 세포 분석을 위한 조직의 기계적 해리

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

조직 샘플 분석을 위해 단일 세포를 분리하고 준비할 수 있는 능력은 새로운 생물의학 발견 및 연구에 빠르게 중요해지고 있습니다. 단일 세포 분리를 위한 수동 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 자동화된 기계 프로토콜은 처리 시간과 시료 변동성을 줄일 수 있지만 리소스가 부족한 연구 환경에서는 쉽게 접근할 수 없거나 비용 효율적이지 않습니다. 여기에 설명된 장치는 학술 실험실을 위한 저비용 대안으로 상업적으로 이용 가능한 재료를 사용하여 반자동 조직 해리를 위해 설계되었습니다. 장치 설계를 제작, 조립 및 작동하기 위한 지침이 제공되었습니다. 해리 프로토콜은 여러 마우스 조직에서 수동 전처리와 유사한 세포 수율 및 샘플 생존율을 가진 단일 세포 현탁액을 안정적으로 생성합니다. 이 프로토콜은 장치당 최대 12개의 조직 샘플을 동시에 처리할 수 있는 기능을 제공하므로 큰 샘플 크기가 필요한 연구를 보다 쉽게 관리할 수 있습니다. 또한 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하면 다양한 조직과 실험 제약 조건을 수용하기 위해 장치 프로토콜을 사용자 정의할 수 있습니다.

이 반자동 기계 프로토콜은 세포를 수동으로 처리한 실험의 결과를 복제할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여 수동 해리를 통해 준비한 세포 현탁액은 쥐의 폐, 신장 및 심장 조직에서 유사한 세포 수율과 샘플 생존율을 보여줍니다(그림 2A,B). T 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 집단은 분리 프로토콜의 차이에 의해 크게 영향을 받지 않았습니다(그림 2C). 마찬가지로, 이러한 면역 세포 집단에 대한 표면 마커 발현 분석은 수동 분리와 장치 분리 간에 분리된 T 세포의 유사한 빈도(그림 3A)와 수지상 세포의 항원 제시 마커 MHC-II(그림 3B)에 대한 유사한 평균 형광 강도를 보여줍니다.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-toget...

유세포 분석과 같은 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직의 결합된 효소 및 반자동 기계적 해리를 위한 일반 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜을 위해 개발된 저비용 기계 장치의 제조, 조립 및 작동에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

우리 연구실은 생물학적 장벽을 연구하고 점막 표면에서 이러한 장벽을 극복하여 약물 전달 및 면역 요법을 개선하기 위한 도구로 나노 입자를 개발합니다. 가장 주목할 만한 발전 중 하나는 화이자(Pfizer), 바이오엔테크(BioNTech), 모더나(Moderna)의 코로나19 백신으로, 지질 나노입자 제형을 사용하여 백신 접종용 mRNA를 전달합니다. 나노 입자를 사용한 백신 및 암 치료와 같은 면역 요법을 개선하기 위한 많은 노력이 진행 중이며, 이러한 제형은 면역 세포에 대한 표적 전달을 개선하고 면역 요법의 전신 부작용을 줄일 수 있습니다.단일 세포 분석은 생물의학 연구에서 면역학의 필수 구성 요소이며, 가장 일반적인 기술 중 하나는 유세포 분석입니다. 관심 조직으로부터 이러한 세포 분리를 수행하려면 신뢰할 수 있는 조직 해리가 필요합니다. 품질과 정확성을 저하시키지 않으면서 실험실 연구에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 것은 어려울 수 있습니다.프로세스를 자동화하면 기술 및 노동 집약적인 단계를 더 쉽게 배울 수 있으며 교육생은 결과의 신뢰성에 영향을 주지 않고 보다 정교한 분석을 수행하는 경험을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜과 함께 제공되는 장치 설계의 주요 장점은 사용자 정의 가능성과 비용 효율성입니다. 최대 12개의 조직을 동시에 처리할 수 있어 처리 시간이 단축됩니다.이 저렴한 대안은 자원이 부족한 연구 환경에서 이 기술에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 마우스 splenocytes의 단일 셀 suspensions를 준비하는 gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 자동 조직 분리에 대한 간단한 시간 절약 기법을 설명합니다.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

이 비디오는 생존 가능한 세포를 얻기 위해 신선한 인간 조직의 비효소적 해리를 설명합니다. 이 기술은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45 양성 세포(림프구/백혈구)의 정성 및 정량 분석에 사용됩니다.

기계적 해리: 조직에서 생존 가능한 세포를 얻는 방법

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

마우스 뇌 해마 조직의 기계적 및 효소적 해리 결합

췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

이 연구는 두 가지 중요한 실험 기법을 제시합니다: 상처 봉합을 평가하기 위한 쥐 상처 모델의 구축과 세포 생존력을 보존하기 위해 쥐 피부에서 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

마우스 상처 모델 및 단일 세포 현탁액 준비

이 프로토콜은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위해 인간 및 마우스 종양 샘플을 빠르게 해리하는 절차를 간략하게 설명합니다.

single-cell RNA sequencing을 위한 인간 및 생쥐 종양 조직 샘플의 해리

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

학습하세요 저비용 전동 장치를 활용한 조직의 기계적 및 효소적 해리 방법으로 단일 세포 현탁액을 제조하는 기술입니다. 이 프로토콜은 면역학 및 생물의학 연구에서 유세포 분석을 위한 신뢰할 수 있는 세포 분리를 제공합니다.

전동 장치를 사용한 단일 세포 분석을 위한 조직의 기계적 해리

더 많은 동영상 탐색