Name: 지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 학습하세요 지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 살아있는 뇌 페리사이트와 비활성 페리사이트를 형광 라벨링으로 동시에 식별하는 방법을. 이 기법은 신경혈관 손상 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81960226,81760223)의 보조금으로 지원되었습니다. 윈난성 자연과학재단 (202001AS070045,202301AY070001-011)

실험 프로토콜은 쿤밍 의과대학 동물 윤리 및 사용 위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 남녀 모두의 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (300-350 g)가 사용되었습니다.
1. SAH 모델 유도
<ol><li>2% 이소플루란과 100% 산소를 사용하여 쥐를 마취합니다. 연속 흡입 마취에 이소플루란(1%-3%)을 공급하여 마취를 유지합니다. 입체 장치를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>아래 단계에 따라 SAH 모델을 만듭니다.<ol><li>미세 주사 바늘을 suprasellar 수조에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 쥐의 꼬리 동맥(항응고제 없음)에서 자가 혈액을 suprasellar 수조에 주입합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>언급된 좌표를 사용하여 오른쪽 외측 뇌실에 미세 주입 바늘을 이식합니다: 브레그마, -0.8mm; 측면, 1.4mm; 깊이, 4mm9. SAH 그룹의 경우 쥐 꼬리 동맥혈 0.2mL를 주사합니다. 가짜 그룹의 경우 동일한 양의 등장성 식염수를 투여합니다(그림 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 뇌 절편 준비 및 안정화
<ol><li>2% 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다. 참수 후 뇌 전체를 적출하여 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(ACSF)에 담그십시오. 참고: 134mM NaCl, 2.8mM KCl, 29mM NaHCO3, 1.1mM NaH2PO4, 1.5mMMgSO4, 2.5mM CaCl2 및 10.11mM D-Glucose(재료 표 참조). pH를 7.3에서 7.4 사이로 유지하십시오.</li>
	<li>비브라톰(재료 표 참조)을 사용하여 5% CO2 및 95%O2로 폭기된 얼음처럼 차가운 ACSF에서 SD 쥐로부터 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 준비합니다(그림 2).</li>
	<li>200μm 두께의 급성 뇌 절편을 ACSF에 잠긴 나일론 메쉬의 보관실에 넣습니다. 35-37 °C의 온도 범위를 유지하면서 ACSF 용액을 95 % O 2 및 5 % CO2 와 평형을 이룹니다. 뇌 절편이 2시간 동안 안정화되도록 하여 적응할 시간을 줍니다(그림 3).</li>
</ol>3. TO-PRO-3를 이용한 급성 뇌절편의 주위 세포 표지
참고: 급성 뇌 절편의 주위 세포는 추적자 TO-PRO-310을 사용하여 형광 표지되었습니다.
<ol><li>형광 염료 TO-PRO-3을 ACSF에 첨가하여 최종 농도 1μM를 달성합니다. TO-PRO-3 함유 ACSF를 사용하여 어두운 환경의 실온에서 20분 동안 급성 뇌 절편을 배양합니다. 알림: 보호를 위해 TO-PRO-3을 취급하는 동안 라텍스 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오.</li>
	<li>브레인 슬라이스를 운반하는 나일론 메쉬 스트레이너를 로딩 챔버에서 6웰 플레이트 헹굼 챔버로 옮깁니다( 재료 표 참조). 뇌 절편을 헹굼실에 10분 동안 그대로 둡니다(그림 4D). 알림: 이 헹굼 단계는 염색 과정을 종료하고 배경 라벨링을 줄이며 비특이적 염색을 방지합니다.</li>
	<li>15 % CO 2 및 5 % O2의 혼합물로 평형을 이루는 ACSF 용액을 사용하여 총 95 분 동안 제제를 헹굽니다. 이 헹굼 단계는 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다(그림 4C).</li>
</ol>4. 급성 뇌 절편에서 대뇌 미세 순환의 비생명 주위 세포 염색
<ol><li>어두운 환경에서 30분 동안 Alexa Fluor 488(FITC-ISOB4, 5μg/mL, 재료 표 참조)에 접합된 이솔렉틴 B4를 사용하여 37°C에서 TO-PRO-3이 사전 로드된 뇌 절편을 배양합니다. 배양 후 뇌 절편을 ACSF에서 15분 동안 헹굽니다(그림 4E).</li>
	<li>평소와 같이 5 % CO 2 및 95 % O2 로 가스 처리 된 ACSF에서 뇌 절편을 배양합니다. 37μM 농도의 프로피듐 요오드화물(PI)을 37°C의 두 용액에 모두 첨가합니다. 이것은 중요하지 않은 뇌 주위 세포에 라벨을 붙일 것입니다. 이 ACSF 용액에서 어두운 곳에서 60분 동안 제제를 배양합니다(그림 4F).</li>
	<li>그런 다음 ACSF 용액으로 15분 동안 준비물을 헹구어 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다.</li>
</ol>5. 급성 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비생명 뇌 주위의 이미징
<ol><li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 절편을 유리 바닥 공초점 접시(재료 표 참조)로 부드럽게 옮깁니다. 이전에 5 % CO 2 및 95 % O2 로 평형을 이룬 ACSF 용액으로 접시를 채웁니다. 철망을 사용하여 쥐의 뇌 조각을 제자리에 고정합니다.</li>
	<li>유리 바닥 컨포칼 접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 급성 뇌 절편을 접시 바닥에 놓고 컨포칼 현미경 이미징 중에 95% O2 및 5%CO2의 혼합물로 평형화된 ACSF 용액으로9를 관류합니다(그림 5A 및 그림 5Ab').</li>
	<li>40x 대물렌즈를 사용하여 대뇌 피질 미세혈관의 벽 세포를 시각화합니다. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다( 재료 표 참조). IB4(여기/방출 460nm/520nm), PI(여기/방출 545nm/595nm) 및 TO-PRO-3(여기/방출 606nm/666nm)에 적합한 필터를 사용합니다(그림 5D). 참고: 40× DIC N1 대물 렌즈, 3 × 12비트: 512 × 512픽셀(0.22 × 0.22mm), 보정: 0.42μm/px.</li>
	<li>대뇌 미세혈관과 주위세포를 네트워크와 형태에 따라 식별합니다. 각 뇌 절편에서 대뇌 미세혈관 네트워크를 포함하는 특정 영역을 찾아 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>후속 캡처에서 일관성을 보장하기 위해 이미징 위치를 주의 깊게 기록해 둡니다(그림 5B,C). 추가 처리 및 분석을 위해 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ) 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표 참조).</li>
</ol>

Visualization of Brain pericyte Contractility Post-Subarachnoid Hemorrhage(뇌주막막막 출혈 후 뇌주막구 수축률의 시각화)

<ol><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+properties+of+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li>
<li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li>
<li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li>
<li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+%CE%B12+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li>
<li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li>
<li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining%3A+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+An+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

중요한 뇌 주위 세포, 비필수 뇌 주위 세포 및 뇌 절편의 미세혈관을 시각화하기 위한 고해상도 공초점 이미징 기술이 개발되었습니다. 급성 쥐 뇌 절편에서, 이 과정은 TO-PRO-311을 사용한 주위 세포의 초기 표지를 수반한 후 IB412를 사용한 미세혈관 내피 세포를 수반합니다. 그 후, PI를 사용하여 죽은 pericyte의 식별이 수행됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 기능 연구에 매우 적합합니다.
신경계 내의 뇌 주피세포를 특이적으로 추적하기 위해 원적색 형광단 TO-PRO-3가 사용됩니다. TO-PRO-3는 주로 고정 조직13의 핵을 염색하지만, 생리식염수14에 적용하면 생체 외 살아있는 주위 세포에 선택적으로 통합됩니다. 이전 연구에서는 TO-PRO-315...

가느다란 돌기와 돌출된 세포체로 구별되는 뇌 주피세포는 미세순환 1,2를 둘러싸고 있습니다. 대뇌 혈류 확대는 주로 모세혈관 확장에 의해 이루어지지만, 동맥이 작을수록 확장 속도가 느려진다3. 주위 수축력은 모세혈관 직경과 주위 세포 형태에 영향을 미쳐 혈관 역학에 영향을 미친다4. 뇌 주위세포의 수축은 모세혈관 수축을 유발하며, 병리학적 시나리오에서 과도한 수축은 적혈구 흐름을 방해할 수 있다5. 유전자좌(locus coeruleus)에서 분비되는 노르에피네프린(norepinephrine)을 포함한 다양한 요인이 모세혈관 내에서 뇌주위 세포 수축을 유도할 수 있다6. 대뇌 혈류를 조절하는 역할을 하는 pericyte는 20-HETE 합성을 나타내며 과산소증7 동안 산소 센서 역할을 한다. 산화-질화 스트레스로 유발된 뇌 주위 세포의 수축은 모세혈관에 해로운 영향을 미친다5. 뇌 주위 세포 수축에 대한 생체 내 및 생체 외 연구에도불구하고8, 뇌 절편 내에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포의 이미징에 관한 제한된 지식은 여전히 남아 있다.
결정적으로, 뇌 주위의 조직 고정 후 영상은 활력과 후속 수축성 평가를 손상시킵니다. 또한, 신경학적 장애(예: 지주막하 출혈 - SAH)와 같은 시나리오에서 뇌 주피세포의 형질전환 표지는 예비 SAH 유도 뇌주위 세포 사멸 연구에서 확인된 바와 같이 생존 가능한 주위세포와 생존 불가능한 주위를 구별하지 못합니다9. 
이러한 문제를 극복하기 위해 TO-PRO-3를 사용하여 살아있는 pericyte를 라벨링하고 죽은 pericyte는 propidium iodide (PI)로 염색했습니다. 고해상도 컨포칼 이미징 기술을 사용하여 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 시각화하는 동시에 이미징 중 절편 활성을 보존했습니다. 이 논문은 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 이미징하기 위한 재현 가능한 방법을 제시하는 것을 목표로 하며, SAH 후 뇌 미세 순환에 대한 뇌 주위 세포의 영향을 조사하는 귀중한 도구 역할을 합니다.

<table><tbody><tr><td>6웰 플레이트</td><td>ABC 생화학</td><td>ABC703006</td><td>RT</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td><td>RT</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>MIAOJIE</td><td>225 mm x 273 mm</td><td>RT</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>RT</td></tr><tr><td>컨포칼 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements 4.10.00</td><td>RT</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Nikon</td><td>N-SIM/C2si</td><td>RT</td></tr><tr><td>가스 탱크(5% CO2, 95% O2)</td><td>PENGYIDA</td><td>40L</td><td>RT</td></tr><tr><td>유리 바닥 컨포칼 접시</td><td>Beyotime</td><td>FCFC020-10pcs</td><td>RT</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G5767</td><td>RT</td></tr><tr><td>접착제</td><td>EVOBOND</td><td>KH-502</td><td>RT</td></tr><tr><td>제빙기</td><td>XUEKE</td><td>IMS-20</td><td>RT</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>미국 국립보건원(National Institutes of Health</td>) <td>이미지 J</td><td>RT</td></tr><tr><td>흡입 마취 시스템</td><td>SCIENCE</td><td>QAF700</td><td>RT</td></tr><tr><td>Isolectin B 4- FITC</td><td>SIGMA</td><td>L2895&ndash; 2MG</td><td>&ndash에 부분 표본을 저장하십시오. 20 > C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>7447&ndash; 40&ndash; 7</td><td>RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>RT</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647&ndash; 14&ndash; 5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>10049&ndash; 21&ndash; 5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>RT</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>NEST 생명공학</td><td>318314</td><td>RT</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Scientific Industries Inc</td><td>모델 203</td><td>RT</td></tr><tr><td>프로피듐(요오드화물)</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-D0815/CS-7538</td><td>&ndash에 부분 표본 저장; 20 > C</td></tr><tr><td>입체 운동 장치</td><td>SCIENCE</td><td>QA</td><td>RT</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard PUMP</td><td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td><td>RT</td></tr><tr><td>온도 조절 수조</td><td>OLABO</td><td>HH-2</td><td>RT</td></tr><tr><td>진동 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 vital and non-vital brain pericytes 이미징

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

주위 세포는 대뇌 미세 순환 내에 위치한 중요한 벽화 세포로, 수축성 조절을 통해 대뇌 혈류를 능동적으로 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 일반적으로 수축성은 특정 상황에서 형태학적 변화와 인근 모세관 직경 변화를 관찰하여 측정됩니다. 그러나 조직 후 고정, 활력 평가 및 이미징된 뇌 주위 세포의 주위 세포 수축성이 손상됩니다. 마찬가지로, 뇌 주위 세포를 유전적으로 표지하는 것은 생존 가능한 주위 세포와 생존 불가능한 주위 세포를 구별하는 데 부족하며, 특히 지주막하 출혈(SAH)과 같은 신경학적 상태에서는 예비 조사에서 뇌 주위 세포의 사멸을 입증합니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 고안되어 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 주위 세포의 동시 형광 태깅을 가능하게 합니다. 이 표지 방법을 사용하면 고해상도 컨포칼 현미경을 시각화하여 뇌 절편 미세혈관을 동시에 표시할 수 있습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 뇌 주위 세포 수축성, 모세혈관 직경에 미치는 영향 및 주위 세포 구조를 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. SAH 맥락에서 뇌 주위 세포 수축성을 조사하면 대뇌 미세 순환에 미치는 영향을 통찰력 있게 이해할 수 있습니다.

정상적인 생리학적 조건에서 뇌 주위세포는 일반적으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 그림 6 은 이 현상을 보여주며, 노란색은 중요한 뇌 주위 세포의 존재를 나타냅니다. 뇌 주위 세포는 PI로 염색되지 않아 생존 가능성을 나타냅니다. 세포 사멸 후 pericyte가 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 SAH 쥐 모델에 방법을 사용하고 후속 이미징을 수행했습니다.
SAH 후 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 이미징하는 방법이 개발되었습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 중요한 뇌 주위 세포(파란색 화살표)는 미세혈관 내에 위치하는 반면, 비필수 뇌 주위 세포는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이 동시 시각화를 통해 뇌 절편 내에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 식별할 수 있습니다. 또한, PI 표지된 ...

예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.

지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

우리의 연구는 pericyte 사멸의 현저한 증가를 보여주었다. 따라서 SAH 후 아픈 말에서 시작하여 저생명 기생충의 수와 SAH 후 경과 시간 사이에 양의 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. SAH와 기생충 분리 기술에 따라 뇌 절편에서 중요한 뇌 기생충과 비생명 뇌 기생충을 이미징하는 것은 제 분야의 연구를 발전시켰습니다.현재 죽은 기생충과 죽은 내피 세포를 완전히 구별하는 것은 매우 어렵습니다. 우리의 연구는 SAH 후 기생충에서 수축 의존성 세포 사멸을 발견했습니다. 우리는 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 기생충 모두를 동시에 형광 라벨링을 가능하게 하는 매우 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

쥐 뇌 혈관 해부학 분석 실험 뇌졸중 연구에 중요한 역할을한다. 이러한 맥락에서, 색 라텍스와 혈관 재관류는 몇 년을위한 표준 도구로 간주되었습니다. 그러나,이 기술은 재현성을 저해 별개의 기술적 한계를 의미합니다. 여기, 우리는 재현 방식으로 뇌성 혈관을 시각화 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 고 대비 시각화와 뇌성 혈관의 충분한 충전의 왼쪽 심실 심근 결과를 통해이 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 혼합물의 주입. 우리는 성공적으로 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 대뇌 혈관 지역 사이 anastomotic 포인트를 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 쥐 경색 볼륨을 관찰하고 분석 할 수있는 널리 사용되는 도구 - 우리는 마침내 우리 선박 착색이 소설과 간단한 방법은 triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 염색과 결합 할 수 있다는 증거를 제공합니다.

카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

혈관 주위 공간(PVS)은 체액 배출에 관여하는 뇌 혈관 주위에 액체로 채워진 공간입니다. 소혈관 뇌졸중 중 PVS의 변화를 검사하기 위해 환자의 뇌에 있는 기저핵 영역의 자기공명영상(MRI)을 수행합니다. 이미징 프로토콜에는 T2 가중치 고속 스핀 에코 및 유체 감쇠 반전 복구(FLAIR) 시퀀스가 포함됩니다. T2 가중 이미징은 뇌척수액(CSF)으로 채워진 PVS와 주변 조직 간의 대비를 향상시킵니다. FLAIR는 CSF 신호를 억제하여 PVS와 오래된 열공 경색을 구별할 수 있습니다. 고해상도 이미징을 위한 적절한 이미징 매개변수를 보장합니다. PVS를 T2 가중 영상에서 CSF와 유사한 신호 강도를 가진 원형, 타원형 또는 선형 구조로 식별합니다. FLAIR에서 PVS는 오래된 열공 경색에서 볼 수 있는 초강렬한 테두리가 없는 저강도로 보입니다. 한쪽 반구에서 PVS의 농도가 가장 높은 MRI 슬라이스의 PVS를 시각적으로 평가하여 심각도를 평가합니다.

Magnetic Resonance Imaging of the Perivascular spaces in the human brain during a small vessel stroke(소혈관 뇌졸중 중 인간 뇌의 혈관 주위 공간의 자기 공명 영상)

뇌 관류 모니터링은 허혈성 뇌졸중 모델의 정확성을 향상시키기 위해 입증되었습니다. 기술적 인 문제는 종종 뇌 혈관 연구에 대해이 필수적 도구의 사용을 제한 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 최적화 된 시스템은 쥐의 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 단일 또는 다중 사이트 hemodynamic 모니터링을 얻기 위해 표시됩니다.

Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

토끼를 대상으로 한 실험적 두개내 압력 조절 혈액 션트 지주막하 출혈(SAH) 모델은 쇄골하 동맥 삽관 및 경피적 수조 마그나 천자라는 표준 절차를 결합하여 SAH 후 인간의 병태생리학적 상태를 밀접하게 모방할 수 있습니다. 단계별 지침을 제시하고 성공적인 실험적 SAH 생성을 위한 주요 수술 포인트에 대해 논의합니다.

지주막 하 출혈의 급성과 늦은 후유증의 연구에 대한 토끼 피 션트 모델 : 기술적 측면

이 기사의 목적은 마이크로 계산 된 단층 촬영 및 전체 선박 세그먼트에 대뇌 vasospasm을 계량 하는 데 사용할 수 있는 볼륨의 결정 후 마우스에서 뇌혈관 나무의 3 차원 재구성을 허용 하는 방법을 제시 하는 것입니다. 거미 막 밑 출혈의 murine 모델입니다.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

이 프로토콜은 설치류 뇌 샘플의 동일한 세트에서 허혈성 뇌 손상의 세 가지 가장 중요한 매개 변수를 측정하는 새로운 기술을 설명합니다. 하나의 뇌 샘플만 사용하는 것은 윤리적 및 경제적 비용 면에서 매우 유리합니다.

설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정

여기서 우리는 정확한 출혈 부위를 보장하고 다른 관련 두개내 병리를 배제하기 위해 수술 후 24 시간 동안 자기 공명 영상 (MRI)과 결합 된 혈관 내 필라멘트 천공에 의해 유도 된 표준화 된 SAH 마우스 모델을 제시합니다.

자기 공명 영상(MRI)과 결합된 Subarachnoid 출혈에 대한 혈관 내 천공 모델

이 작업은 허혈성 뇌졸중의 비침습적 이미징을 위한 다중 모드 초음파 기반 이미징 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 이 시스템은 광음향 영상을 통한 혈액 산소화의 정량화와 음향 혈관 조영술을 통한 뇌의 관류 장애를 허용합니다.

허혈성 뇌졸중의 비침습적 전뇌 영상을 위한 통합 광음향, 초음파 및 혈관조영 단층촬영(PAUSAT)

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

학습하세요 지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 살아있는 뇌 페리사이트와 비활성 페리사이트를 형광 라벨링으로 동시에 식별하는 방법을. 이 기법은 신경혈관 손상 메커니즘 연구에 활용됩니다.

지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

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