지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징
2023년 8월 18일
예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.
우리의 연구는 pericyte 사멸의 현저한 증가를 보여주었다. 따라서 SAH 후 아픈 말에서 시작하여 저생명 기생충의 수와 SAH 후 경과 시간 사이에 양의 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. SAH와 기생충 분리 기술에 따라 뇌 절편에서 중요한 뇌 기생충과 비생명 뇌 기생충을 이미징하는 것은 제 분야의 연구를 발전시켰습니다.
현재 죽은 기생충과 죽은 내피 세포를 완전히 구별하는 것은 매우 어렵습니다. 우리의 연구는 SAH 후 기생충에서 수축 의존성 세포 사멸을 발견했습니다. 우리는 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 기생충 모두를 동시에 형광 라벨링을 가능하게 하는 매우 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다.
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개요
본 연구는 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 혈관주위세포(pericytes)에 미치는 영향을 조사하여, 혈관주위세포의 사멸 및 수축력 기전을 강조합니다. 생존 가능한 혈관주위세포와 생존 불가능한 혈관주위세포를 구분하기 위해 쥐의 뇌 절편을 이용한 모델이 개발되었습니다. 이러한 접근 방식은 SAH 이후 혈관주위세포의 생존력을 평가하기 위한 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 면역형광 현미경 검사
배경
- 지주막하 출혈(SAH)은 뇌 혈관주위세포(pericyte)의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있습니다.
- SAH 이후 혈관주위세포의 생존력을 이해하는 것은 신경혈관 손상을 밝혀내는 데 매우 중요합니다.
- 현재의 방법들은 생존한 혈관주위세포와 사멸한 혈관주위세포를 적절히 구별하는 데 어려움이 있습니다.
- SAH에서의 혈관주위세포 변화를 관찰하기 위해 새로운 영상 기술이 필요합니다.
연구 목적
- SAH 이후 혈관주위세포의 수축력과 세포 생존율을 평가하기 위함입니다.
- 생존 및 비생존 혈관주위세포를 동시에 표지할 수 있는 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발하기 위함입니다.
- 뇌 절편 내 혈관주위세포의 행동을 더 잘 관찰할 수 있도록 이미징 기술을 개선하기 위함입니다.
사용된 방법
- 주세포(pericyte) 연구를 위한 ex vivo 모델로 쥐의 뇌 절편을 사용하였습니다.
- 마취된 쥐의 안상조(suprasellar cistern)에 자가 혈액을 주입하여 지주막하 출혈(SAH)을 유도하였습니다.
- 면역형광법을 이용하여 주세포를 표지하고 생존력을 평가하였습니다.
- 주요 단계로는 형광 염료를 이용한 배양과 공초점 현미경을 이용한 영상 분석이 포함되었습니다.
- SAH 유도 후 다양한 시간대별로 주세포의 생존력 평가 타임라인을 관찰하였습니다.
주요 결과
- 연구 결과, SAH 발생 6시간 후부터 혈관주위세포(pericyte)의 사멸이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다.
- 비생존 혈관주위세포의 수와 SAH 후 경과 시간 사이에 양의 상관관계가 있었습니다.
- 기전적으로, SAH 후 혈관주위세포에서 수축 의존적 세포사멸(apoptosis)이 관찰되었습니다.
- 형광 표지 기술을 사용하여 생존 혈관주위세포와 비생존 변이체를 함께 식별하였습니다.
결론
- 본 연구는 SAH 이후 생존 가능한 주세포와 생존 불가능한 주세포를 구분하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다.
- 이러한 발견은 손상에 대한 신경혈관 반응에서 주세포의 역동성에 대한 이해를 높여줍니다.
- 이는 다양한 뇌 병리 현상에서 신경혈관 손상을 이해하는 데까지 그 영향이 미칩니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
지주막하 출혈(SAH) 이후 급성 뇌 절편에서 생존 및 비생존 뇌 혈관pericyte를 신뢰성 있게 구분하는 것은 신경혈관 표적 검증의 중대한 공백을 메우는 일입니다. 본 프로토콜은 pericyte의 수축력과 생존력에 대한 고해상도 정량적 평가를 가능하게 하여, 발견 단계에서의 기전적 리스크 제거(de-risking)를 지원합니다. 이러한 접근 방식은 CNS 약물 발견 과정에서 초기 단계의 신경혈관 표적 선택 및 포트폴리오 분류에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 손상 후 pericyte의 생존력을 직접적으로 시각화하고 정량화하여 강력한 타겟 검증을 가능하게 합니다.
- SAH 이후 pericyte의 수축성과 미세혈관 변화 사이의 상관관계를 분석함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 예측 가능한 중개 가치를 지닌 신경혈관 타겟의 식별을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- pericyte의 기능과 생존력을 재현성 있게 평가할 수 있도록 검증된 ex vivo 시스템을 제공합니다.
- 어세이 표준화 및 후속 스크리닝 워크플로우에 적합한 정량적 이미징 결과물을 제공합니다.
- 질병 관련 조직 환경에서 pericyte의 수축력과 생존에 미치는 화합물의 영향을 신뢰성 있게 평가할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 혈관주위세포(pericyte)의 생존력 및 수축성 측정값을 신경혈관 손상의 중개 바이오마커와 일치시킵니다.
- CNS 혈관 모델에서 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 신경혈관 치료 프로그램의 리스크 조정된 추진 결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
본 프로토콜은 신경혈관 표적의 초기 발견부터 전임상 단계에 이르는 연속 과정에 통합되어, 기전 연구와 중개 모델 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 발견 생물학: SAH 후 pericyte 매개 미세혈류 장애에 대한 가설 검증을 가능하게 합니다.
- 스크리닝: 어세이 개발 및 화합물 선별을 위한 재현 가능하고 정량적인 영상 결과물을 제공합니다.
- 분석: 실험 조건에 따른 pericyte 생존율 및 수축력의 통계적 비교를 지원합니다.
- 중개 연구: ex vivo 발견 사항을 in vivo 신경혈관 손상 모델과 연결하여 바이오마커 일치성을 확인합니다.
- 기업적 재사용: CNS 혈관 연구 포트폴리오를 위한 재사용 가능한 영상 및 라벨링 워크플로우를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경혈관 표적 검증의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 재현성과 확장성을 위해 혈관주위세포(pericyte)의 생존능 평가 및 이미징을 표준화합니다.
- 전략적 가치: 조기 생물학적 위험 제거(de-risking)를 가능하게 하여 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 강력한 생존능 데이터를 바탕으로 신경혈관 프로그램의 위험 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 공초점 이미징 및 신경혈관 조직 처리 분야의 전문 지식이 필요합니다.
- 첨단 형광 현미경 및 분석 소프트웨어 사용 권한이 필요합니다.
- 라벨링 및 이미징 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 중추신경계(CNS) 질환 모델이나 종에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 염료의 특이성 및 내피세포 라벨링과의 중첩으로 인해 해석에 제한이 있을 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:06
Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging
2:05
Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging
3:40
Confocal Imaging of Vital and Non‐Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices
