Name: 장-뇌 신경 통신의 실시간 분석: 장 포도당 자극에 대한 반응의 피질 전체 칼슘 역학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 배우세요 생쥐 모델에서 장 포도당 자극에 의한 피질 칼슘 역학 변화를 실시간으로 분석하는 방법을. 이 기법은 장-뇌 신경 통신 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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모든 실험 프로토콜은 일본 오차노미즈 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(동물 연구 프로토콜 22017)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험은 학술 연구 기관(일본 문부과학성)에서 동물 실험 및 관련 활동의 올바른 실시를 위한 기본 지침에 준거한 오차노미즈 대학의 동물 실험 지침에 따라 수행되었습니다. 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 노력했습니다. 이 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 형질전환 마우스의 제조
<ol>
	<li>이 실험을 따르기 위해 성인 남성 및 여성 BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 형질전환 마우스 라인, 즉 G7NG817 마우스24,25(8주 이상)를 사용하십시오. G7NG817 마우스(25)의 배경 변형은 C57BL/6J이다.</li>
	<li>12시간/12시간 밝음/어둡기 주기 아래에 쥐를 수용하고 최대 5마리의 쥐 그룹으로 키웁니다.</li>
</ol>
2. 카테터 생성
<ol>
	<li>가위를 사용하여 실리콘 튜브(내경 0.5mm, 외경 1.0mm)를 7cm의 정확한 길이로 조정합니다(그림 1A-a). 알림: 절차에 앞서 가위와 실리콘 튜브를 살균했습니다.</li>
	<li>작은 플라스틱 비드(내경 3mm, 외경 5mm)를 맞춤형 튜브에 부착하여 종단에서 3mm 떨어진 곳에 위치하도록 합니다(그림 1A-b). 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 비드를 단단히 고정합니다(의료용 또는 표준 변형 가능).</li>
	<li>23G 바늘의 정점을 절제한 다음 바늘 끝에서 1.5cm를 자릅니다(그림 1A-c).</li>
	<li>2.3단계에서 절단된 23G 바늘을 비드가 부착된 곳과 반대쪽인 실리콘 튜브의 말단에 삽입합니다(그림 1A-d).</li>
</ol>
3. 인젝터 생성
<ol>
	<li>멸균 플라이어를 사용하여 바늘 끝에서 1cm를 절제합니다(그림 1B-a). 알림: 절단된 끝의 오리피스가 무결성을 유지하고 변형되지 않도록 하십시오., 변형이 주입 용액의 흐름을 방해할 수 있으므로 말입니다.</li>
	<li>3.1.1단계에서 조정된 23G 주입 바늘을 2.5mL 주사기에 연결합니다(그림 1B-b).</li>
	<li>실리콘 튜브를 필요한 길이(이 실험에서는 15cm 실리콘 튜브)로 분할하고 23G 주입 바늘 위에 넣습니다(그림 1B-c). 알림: 분배되는 용액의 양은 튜브의 길이에 따라 변동됩니다. 예를 들어, 15cm 튜브의 경우 약 50μL의 용액이 실험 후에도 남아 있습니다.</li>
	<li>주사 바늘 끝에서 1.5cm 떨어진 23G 주사 바늘을 절단합니다.</li>
	<li>3.4단계에서 절편된 부분을 3.3단계에서 만든 실리콘 카테터와 결합합니다(그림 1B-d). 참고: 3.1 및 3.4단계에서 생성된 오리피스가 절개 후 왜곡되지 않은 상태로 유지되는지 확인하십시오. 정류가 필요한 경우 플라이어를 사용하여 원형 구성을 복원하십시오.</li>
</ol>
4. 위 국소화
<ol>
	<li>지정된 챔버에서 3.0% 이소플루란 흡입을 통해 마우스에 마취를 투여합니다. 안구 건조증을 예방하기 위해 안과 연고를 바르십시오.</li>
	<li>마우스의 마취 상태를 확인한 후 흡입 챔버에서 마취된 마우스를 수술 테이블로 섬세하게 옮깁니다. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공합니다.</li>
	<li>마우스를 supine으로 눕히고 입을 흡입 장치에 가깝게 정렬하고 이소플루란 농도를 3.0%에서 2.0%로 조절합니다. 알림: 이소플루란 마스크의 아래쪽 부분을 위쪽 마스크에서 분리하고 접착 테이프를 사용하여 분리된 마스크(위쪽 부분)를 수술 테이블에 고정합니다.</li>
	<li>접착 테이프를 사용하여 쥐의 구강, 앞다리 및 뒷다리를 수술 테이블에 보충합니다. 참고: 마우스를 테이블에 고정하면 마우스를 마취한 상태에서도 움직임으로 인한 수술 오류를 예방할 수 있습니다.</li>
	<li>제모 크림을 사용하여 왼쪽 상복부(수술 부위 주변 부위의 150%)에서 쥐의 털을 제거합니다. 수술 부위에 국소 진통제를 국소적으로 바르고 5분 동안 기다렸다가 진행합니다.</li>
	<li>국소 마취 젤을 복부 피부에 바르고 5-10분 동안 기다립니다. 그런 다음 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 가며 수술 부위를 3회 소독합니다. 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인하고 멸균 수술 드레이프로 동물을 덮습니다. 대략 1.5cm 길이의 피부를 절개합니다(그림 1C-b), 복부 중앙분리대 오른쪽 1cm, 시푸이드 돌기 아래 5mm(그림 1C-c). 그런 다음 초기 피부 절개와 동일한 위치에서 복벽에 1.5cm의 절개를 만듭니다. 알림: 기저 간에 해를 입히지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 왼쪽 간엽을 측면으로 섬세하게 재배치하여 그 아래의 위를 드러냅니다.</li>
</ol>
5. 카테터 삽입
<ol>
	<li>위를 들어 올리고 절개 부위를 통해 조심스럽게 빼냅니다. 알림: 인접 장기, 특히 간의 무결성을 보존하기 위해 최대한의 주의를 기울이고 위에 과도한 힘을 가하지 마십시오.</li>
	<li>가위를 사용하여 유문 antrum에 작은 천공(직경 약 1.5mm)을 만듭니다.</li>
	<li>카테터의 말단을 천공에 삽입하여 비드가 유문 안반과 직접 접촉하도록 합니다. 참고: 카테터는 삽입하기 전에 0.1-0.5% 클로르헥시딘 글루코네이트 용액으로 소독합니다.</li>
	<li>의료용 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 카테터의 비드를 위에 부착합니다. 알림: 위가 주변 장기에 붙어 있지 않은지 확인하십시오.</li>
	<li>카테터가 위에 단단히 부착되었는지 확인한 다음 위를 왼쪽 간엽 아래의 타고난 위치로 섬세하게 재배치합니다.</li>
	<li>폴리디옥사논(PDS) 봉합사를 사용하여 카테터가 외부로 확장될 수 있도록 복벽을 꿰맬다. 그런 다음 복부 폐쇄와 유사한 방식으로 피부 절개 부위를 봉합합니다.</li>
	<li>소독된 케이지에 마우스를 조심스럽게 재배치합니다. 참고: 수술 후 마우스는 단독으로 수용해야 합니다. 상처 봉합 부위에 국소 진통제를 국소적으로 바르고 현지 기관 지침에 따라 진통제 계획을 따르십시오.</li>
	<li>표준 환경에서 최소 48시간의 복구 기간을 허용합니다. 참고: 쥐의 위에 삽입된 카테터의 한쪽 끝은 이물질의 침입을 방지하고 물지 않도록 끝이 밀봉된 23G 바늘로 닫혀 있습니다. 복부에서 튀어나온 카테터는 짧기 때문에 마우스가 침구 사이로 카테터를 끌고 들어가는 것을 방지하여 카테터가 열리거나 얽힐 수 있습니다.</li>
</ol>
6. in vivo 경두개 Ca2+ 이미징을 위한 준비
<ol>
	<li>이소플루란을 사용하여 마우스에 마취를 투여합니다(2%에서 유도, 0.8%에서 1.0% 사이의 유지).</li>
	<li>맥동과 호흡의 영향을 완화하기 위해 보조 이어 바를 사용하여 마우스를 입체 플랫폼에 고정합니다. 그런 다음 마우스를 형광 실체 현미경 아래에 놓습니다.</li>
	<li>광대역 청색 형광 필터 세트(460-490nm에서 여기, 520nm에서 방출)를 수은 광원과 함께 사용합니다.</li>
	<li>카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 지정된 이미징 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.</li>
	<li>전기 면도기나 제모 크림을 사용하여 두피의 털을 조심스럽게 제거합니다. 알림: 면도기를 사용하는 경우 철저히 소독하고 피부가 찢어지지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>면봉 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 0.1-0.5%로 희석한 클로르헥시딘 글루코네이트 용액을 사용하여 두피 표면을 소독합니다. 그런 다음 알코올로 소독하고 이 라운드를 번갈아 3회 반복합니다.</li>
	<li>국소 마취 젤을 바르고 5-10분 동안 기다립니다.</li>
	<li>치과용 아크릴 시멘트를 바를 준비를 합니다.<ol>
		<li>멸균 메스 칼날을 사용하여 두피를 자릅니다. 두피를 완전히 제거하거나 머리 뒤에서 이마까지 직선으로 자릅니다.</li>
		<li>클립을 사용하여 여분의 피부를 확장하여 두개골을 노출시킵니다.</li>
		<li>면봉을 사용하여 골막의 결합 조직을 제거합니다.</li>
		<li>골막을 제거한 후 즉시 아크릴 시멘트를 도포하십시오. 노출된 뼈의 증발로 인해 두개골 표면이 불투명해지는 것을 방지하기 위해 신속하게 행동하십시오.</li>
		<li>시멘트가 마를 때까지 약 5분 동안 기다립니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 십이지장 내 포도당 투여를 통한 경두개 Ca2+ 이미징
<ol>
	<li>실험 용액과 식염수를 모두 주변 온도와 평형화합니다. 마우스에게 지정된 기간(예: 2시간) 동안 식이 제한을 가합니다.</li>
	<li>주입을 시작하기 전에 ~0.03mL의 식염수를 사용하여 마우스 측 카테터 내의 잔류 내용물을 퍼지합니다.</li>
	<li>실험 용액(예: 300μL의 물에 300μL의 물로 준비된 10% 포도당 용액에 추가로 300μL의 물로 보충)을 주사기에 흡입한 다음 카테터에 연결합니다. 특정 실험 목표에 맞는 용액의 최적 투여량을 확인합니다. 알림: 이 단계에서는 마우스의 내부 해부학적 구조를 위태롭게 할 수 있는 카테터에 과도한 부담을 주지 않도록 주의하십시오. 마우스 측 튜브를 최대한 부드럽게 조작하도록 노력하십시오. 또한 갇힌 공기와 기포가 위장 팽창을 유발할 수 있으므로 주사기에 용액 흡인 후 공기 제거가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>마우스의 생리적 상태를 평가하고 소프트웨어 응용 프로그램의 기록 프로세스 버튼을 클릭하여 이미징 소프트웨어의 기록 기능을 활성화합니다.</li>
	<li>512 x 512 픽셀의 해상도, 16비트 심도 및 10Hz의 프레임 속도로 이미지를 캡처합니다. 참고: 기록 매개변수는 특정 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>자발적인 데이터(예: 50초에 걸쳐)를 획득한 후 실험에 맞는 속도(여기서는 0.035mL/s)로 실험 용액을 점진적으로 주입합니다. 참고: 실험이 끝나면 마우스는 이소플루란 마취 하에 자궁경부 탈구에 의해 즉시 안락사됩니다.</li>
</ol>
8. 이미지 데이터 처리 및 분석
<ol>
	<li>이미지 데이터를 64 x 64 픽셀로 비닝합니다.</li>
	<li>ImageJ를 사용하여 손으로 그린 관심 영역(ROI)을 확인할 수 있습니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조하여 ROI를 전두엽 영역(M2), 배럴을 포함한 체성 감각 영역(Somato), 후두부 영역(시각) 및 후비장 영역(RSC)으로 지정합니다.</li>
	<li>MATLAB 함수 ReadImageJROI 를 사용하여 ROI에 대응하는 좌표를 추출합니다. 제공된 링크를 통해 MATLAB 함수에 액세스합니다 https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi</li>
	<li>MATLAB을 사용하여 ROI 내에서 형광 강도 변화의 평균 속도를 계산할 수 있습니다.<ol>
		<li>방정식 (1)으로 형광 강도 변화율(ΔF/F)을 정의합니다. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65902/65902eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 여기서, Ft는 특정 시간에서의 형광 강도 값을 나타내고, 기록 시작부터 주입 후 50초까지의 평균 강도 값은F0로 표시된다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>주입 용액이 장기에 도달하는 데 걸리는 지연을 고려하십시오. 주입 후 3초에 걸친 평균 강도 값을 기준선으로 사용합니다. 주입 후 3초 이후에 발생하는 경우 분석을 위해 기준선 강도 값 + 1 SD를 초과하는 대상 파형.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐의 경두개 칼슘 이미징을 통한 장-뇌 상호 작용 연구

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<li>Ming, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane-induced+burst+suppression+is+a+thalamus-modulated%2C+focal-Onset+rhythm+with+persistent+local+asynchrony+and+variable+propagation+patterns+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).</li>
<li>Schwalm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+states+shape+the+spatiotemporal+representation+of+local+and+cortex-wide+neural+activity+in+mouse+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).</li>
<li>Ueno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intragastric+infusion+%28iG%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse intragastric infusion (iG) model.</a> Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).</li>
<li>Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-oral+glucose+stimulation+of+intake+and+conditioned+flavor+preference+in+C57BL%2F6J+mice%3A+A+concentration-response+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study.</a> Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2.5 mL 테루모 주사기</td><td>TERUMO</td><td>ss-02Sz</td><td></td></tr><tr><td>23G 주사 바늘</td><td>TERUMO</td><td>4987350390691</td><td></td></tr><tr><td>마취제 (ISOFLURANE 흡입 용액)</td> <td>viatris</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td></td><td></td><td>현지 회사</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 접착제 (AronArufa A)</td><td>TOAGOSEI</td><td>7990700Q1022</td><td></td></tr><tr><td>dental 아크릴 시멘트 C& 비&nbsp;</td><td>썬메디컬&nbsp;</td><td>221AABZX00115000</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Kracie</td><td></td><td>현지 회사</td></tr><tr><td>디지털 CMOS 카메라&nbsp;</td><td>하마마쓰 포토닉스&nbsp;</td><td>ORCA-Spark</td><td></td></tr><tr><td>이어바</td><td>NARISHIGE</td><td>EB-5N</td><td></td></tr><tr><td>필터 세트 (U-MWB2)</td><td>Evident</td><td>U-MWB2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>파인 디시언스 도구</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>G7NG817 마우스</td><td>RIKEN BRC</td><td>RBRC09650</td><td></td></tr><tr><td>이미지 소프트웨어</td><td>하마마츠 포토닉스&nbsp;</td><td>HC 이미지 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 바폴라이저</td><td>시나노세이사쿠시오</td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>광원(U-HGLGPS)</td><td>분명</td>한 <td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>현미경(MVX10)</td><td>분명</td><td></td><td></td></tr>한 <tr><td>플라스틱 구슬(내경 3mm, 외경 5mm)</td><td></td><td></td><td>현지 회사</td></tr><tr><td>펜치</td><td></td><td></td><td>현지 회사</td></tr><tr><td>폴리디옥사논 봉합사, 모노디옥스</td><td>Alfresa Pharma</td><td>HR1305MV45-KF2R</td><td>이 흡수 가능한 모노필라멘트 PDS 봉합사는 수술 절개</td></tr><tr><td>라운드 엔드 펜치</td><td>F.S.T.</td>를 봉합하는 데 사용됩니다.<td>11617-12</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>오츠카 제약 공장</td><td>35061311</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브 (내경 0.5mm, 외경 1.0mm)</td><td>AS ONE&nbsp; CORPORATIO</td><td>33151413</td><td>현지 기업</td></tr><tr><td>작은 수술 바늘</td><td>나츠메 제작소 주식회사</td><td></td><td></td>AC03DNT</tr><tr><td>입체 무대</td><td>NARISHIGE</td><td>MA-6N</td><td></td></tr><tr><td>실로카인 젤리 2%</td><td>산도즈 K.K.</td><td>614429303</td><td>이 젤리는 수술 통증을 완화하기 위해 국소 진통제로 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

장-뇌 신경 통신의 실시간 분석: 장 포도당 자극에 대한 반응의 피질 전체 칼슘 역학

Real-time Analysis of Gut-brain Neural Communication: Cortex wide Calcium Dynamics in Response to Intestinal Glucose Stimulation

이소플루란 마취 G7NG817 마우스를 사용한 경두개 피질 wide Ca2+ 이미징 그림 1에 설명된 절차에 따라 카테터를 만들었습니다. 위의 위치를 주의 깊게 파악한 후 해당 위치에 카테터를 부착했습니다(그림 1). 카테터 삽입 후 충분한 회복 시간(약 48시간)을 허용한 후 가벼운 이소플루란 마취(0.8-1.0%) 하에 자발적인 신경 활동을 측정하여 후속 장 자극 관찰을 위한 기준선 형광 강도 변화를 확립했습니다. 그 결과, 우리는 전체 피질에 걸쳐 있는 무작위 Ca2+ 진동 패턴을 확인했습니다(그림 2A). 그림 2는 카테터를 미리 삽입한 자발적인 뇌 활동의 대표적인 예를 보여줍니다. 주입 후 M2 영역에서 첫 번째 관찰 가능한 Ca2+ 과도 피크의 시간을 0.0초로 정의했습니다. 의사 색상 표현은 이 Ca2+ 과도 현상의 피크를 최대값으로 표시하고 평균값에 1 표준 편차(1 SD)를 최소값으로 표시했습니다. 좌반구와 우반구가 모든 지역에서 동시다발적인 활동을 보인다는 것이 분명했다.
다음으로, 각 기능 영역 내의 파동을 특성화하기 위해 ROI를 설정했습니다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이 각 ROI에 대한 형광 강도 속도의 시간적 변화를 제시했습니다(그림 2B). 이러한 관찰된 표면 Ca2+ 진동은 낮은 활성 기간과 높은 진폭의 형광 변화 기간 사이를 번갈아 가며 버스트 억제 패턴을 따랐습니다. 이 활동 패턴은 대뇌 피질 표면 EEG와 Ca2+ 역학을 동시에 측정한 이전 연구 결과와 일치한다26.
억제 상태와 파열 상태 사이의 글로벌 또는 지역 표면 Ca2+ 변동에도 불구하고, 칼슘 급증을 시작하는 특정 피질 영역은 다를 수 있습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 신호가 국소 대뇌 피질 영역을 자극할 때, 그 영역은 활성화될 것으로 예상되며, 이어서 대뇌 피질 상태(27,28)의 전지구적 변화를 주도할 것으로 예상된다.
위내 포도당 주입 후 피질 Ca2+ 역학의 변화 다음으로, 포도당 또는 수분 투여가 대뇌 피질 활동에 어떻게 영향을 미치는지 설명하기 위해 주사 중 및 주입 후에 피질 전체 Ca2+ 역학을 모니터링했습니다. 그 결과, 위내 포도당 주입 후 대뇌 피질 Ca2+ 역학의 변화를 발견했습니다. 다양한 대뇌 피질 활성화 영역에서 나타나는 자발적인 활동과는 대조적으로, 카테터를 통해 포도당을 직접 장에 주입하면 전전두엽 영역 또는 2차 운동 피질(M2)의 즉각적인 활성화를 관찰했는데, 이는 위장 내 수분 주입에 의해 유도되지 않는 효과입니다(그림 3A-C). 또한, 이러한 일시적이고 두드러진 Ca2+ 이벤트는 위장 내 포도당 주입 후 약 10초 동안 지속적으로 발생하는 경향이 있음을 관찰했습니다. 이러한 지속적인 현상은 물을 투여했을 때 뚜렷하지 않았습니다(그림 3D-F).
각 ROI의 Ca2+ 이벤트는 포도당 투여 완료 후 4-8초 이내에 발생하는 첫 번째 피크에서 청각 피질(참조)을 기준으로 사용하여 형광 강도 변화 비율의 비율을 계산하는 것으로 특성화되었습니다. 그 결과, 포도당을 주입했을 때 청각 피질을 주사 전후의 기준으로 M2 영역의 반응을 비교한 후 유의미한 변화가 관찰되었습니다.
대조적으로, 물을 주입했을 때는 이러한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 3G, 물 N = 7: 주입 전 대비 2.38 ± 2.53 대 2.05 ± 1.84, p &gt; 0.05; 포도당 N = 7: 주입 전 대비 2.48 ± 0.97 대 3.76 ± 2.76, p &lt; 0.01, Wilcoxon 부호 순위 검정). 다음으로, 주입 후와 주입 전의 값의 비율로 각 피질 영역의 활성화 수준을 정의하면 M2 영역에서만 유의한 차이가 관찰되었습니다(그림 3H, M2: 0.92 ± 0.89 대 1.30 ± 0.32, p=0.006; 소마토: 0.95 ± 0.076 대 1.04 ± 0.13, p = 0.27; 시각: 0.92 ± 0.3 대 1.00 ± 0.06, p = 0.89; RSC: 0.97 ± 0.27 vs. 1.10 ± 0.27, p = 0.60, t-검정).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig01.jpg"> 
그림 1: 방법의 개요. (A) 카테터 생성: (a) 실리콘 튜브를 자릅니다. (b) 의료용 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 플라스틱 구슬을 실리콘 튜브에 부착합니다. (c) 23G 바늘을 끝에서 1.5cm 자릅니다. (d) 바늘의 절단된 끝을 실리콘 튜브에 부착합니다. (B) 인젝터 어셈블리: (a) 23G 주사 바늘을 1cm 자릅니다. (b) 트리밍된 주사 바늘을 2.5mL 주사기에 연결합니다. (c) 주사 바늘의 절단 부분을 실리콘 튜브로 피넣습니다. (d) 23G 바늘을 끝에서 1.5cm 자릅니다. (e) 바늘의 절단된 끝을 실리콘 튜브에 부착합니다. (C) 수술 절차: (a) 수술 부위를 제모합니다. (b) 피부와 복벽을 약 1.5cm 길이로 절개합니다. (c) 가위를 사용하여 유문 안틀에 작은 천공 (직경 약 1.5mm)을 만들고 카테터 (실리콘 튜브)를 삽입합니다. 의료용 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 카테터를 유문 안틀에 고정합니다. (d) 5/0 실크 봉합사 재료와 바늘을 사용하여 복벽과 피부를 꿰매십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig02.jpg"> 
그림 2: 카테터가 부착된 G7NG817 마우스의 자발적 피질 넓은 Ca2+ 진동. (A) 0.2초 간격으로 표시된 피질 넓은 Ca2+ 진동의 대표적인 예. 형광 강도의 변화는 pseudo color overlay로 표현됩니다. B 에서 점선으로 둘러싸인 시간 창은 피크가 시간 0으로 설정된 첫 번째 Ca2+ 과도 현상을 보여줍니다. 의사 색상 표현은 해당 Ca2+ 과도의 피크를 최대값으로 사용하고 평균 +1 SD를 최소값으로 사용합니다. (B) 예제의 각 ROI에 대한 형광 강도의 시계열 변화. 선 색상은 다른 피질 영역에 해당합니다 : 빨간색은 M2를 나타냅니다. 자홍색은 체성 감각 영역(Somato)을 나타냅니다. 파란색은 시각적 영역(Visual)을 나타냅니다. 그리고 녹색은 복고풍 비장 지역을 나타냅니다. 연어 색상의 스트립은 주입 시간을 보여줍니다. (C) 점선 윤곽선 내의 단일 피크가 분리되어 확대 보기에 표시됩니다. 약어: SD = 표준 편차; ROI = 관심 영역; RSC = retro splenial region(레트로 비장 영역). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig03.jpg"> 
그림 3: 포도당 또는 물 주입 중/후의 Cortex wide Ca2+ 반응. (A) 0.2초 간격으로 표시된 포도당 투여의 대표적인 예. 형광 강도의 변화는 pseudo color overlay로 표현됩니다. B 의 점선으로 둘러싸인 시간 창은 주입 후 처음으로 나타나는 Ca2+ 과도 상태를 보여주며 피크는 시간 0으로 설정됩니다. 의사 색상 표현은 주입 후 첫 번째 Ca2+ 과도 현상의 피크를 최대값으로, 평균 +1 SD를 최소값으로 기반으로 합니다. (B) 예제의 각 ROI에 대한 형광 강도의 시계열 변화. 선의 색상은 다양한 피질 영역에 해당합니다: 빨간색은 M2, 자홍색은 체성 감각 영역(Somato), 파란색은 시각 영역(Visual), 녹색은 복고풍 비장 영역을 나타냅니다. (C) 점선 윤곽선 내의 단일 피크가 분리되어 확대 보기에 표시됩니다. 분석 대상 칼슘 파동은 주입 후 4-8초 이내에 나타난 가장 빠른 파동입니다. (D) 포도당 조절 데이터로서의 물 주입의 대표적인 예. (E) 예제의 각 ROI에 대한 형광 강도의 시계열 변화. 선 색상은 B와 같습니다. (F) 점선 윤곽선 내의 단일 피크가 분리되어 확대 보기에 표시됩니다. 분석 대상 칼슘 파동은 주입 후 4-8초 이내에 나타난 가장 빠른 파동입니다. (G) M2 자발적 활동(전)과 주입(주입) 후 반응의 비교. 평균 형광 강도는 주입 전 50초 동안 변하고, 주입 후 4초와 8초 사이의 M2 영역의 피크 반응을 청각 피질을 기준으로 계산했습니다. (H) 물 또는 포도당이 투여되었을 때 각 피질 영역의 활성화 수준 비교. G에서 결정된 바와 같이, 주입 후 값과 주입 전의 값의 비율은 각 영역에 대해 계산되었습니다. N.S.는 유의하지 않음을 나타냅니다(p &gt; 0.05). ** &lt;0.01. 오차 막대는 평균의 표준 오차로 정의됩니다. 약어: SD = 표준 편차; ROI = 관심 영역; RSC = retro splenial region(레트로 비장 영역). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Communication between the gastrointestinal tract and the brain after nutrient absorption plays an essential role in food preference, metabolism, and ...

real-time-analysis-gut-brain-neural-communication-cortex-wide-calcium

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

이 프로토콜은 혼합 된 쥐의 소장 세포의 분리 및 문화에 대해 설명합니다. 이러한 기본 장 배양 기법들을 사용하여 장내 펩타이드 분비 하부 신호 전달 경로의 조사를 가능하게한다.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

배우세요 생쥐 모델에서 장 포도당 자극에 의한 피질 칼슘 역학 변화를 실시간으로 분석하는 방법을. 이 기법은 장-뇌 신경 통신 메커니즘 연구에 활용됩니다.

장-뇌 신경 통신의 실시간 분석: 장 포도당 자극에 대한 반응의 피질 전체 칼슘 역학

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