Name: 초파리에서 설탕 유도 국소 검색 행동 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster를 이용한 설탕 유도 국소 검색 행동 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 포식 행동의 신경 회로를 식별하고 여러 종에서 보존된 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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경기장 설치에 도움을 주신 Ravikumar Boyapati에게 감사드립니다. 이 연구는 웰컴 트러스트 DBT Intermediate India Alliance 보조금(보조금 번호 IA/I/15/2/502074)의 지원을 받아 P.K. M.S.가 인도 의학 연구 위원회(ICMR)의 펠로우십을 통해 자금을 지원받았습니다. AB는 NCBS-TIFR 기관 기금(No. 12P4167)과 인도 정부 원자력부(No. 12-R& D-TFR-5.04-0800 및 12-R& D-TFR-5.04-0900)을 참조하십시오.

본 연구에는 Drosophila melanogaster Canton-S (CS) 야생형 균주의 성체 수컷 파리가 사용되었습니다.
1. 실험 준비
<ol><li>플라이 사육<ol><li>12시간 이내에 출현하는 성체 수컷 파리를 수집하고 12시간 밝음/어두움 주기에서 75% 상대 습도로 25°C에서 48시간 동안 표준 파리 매체(사내에서 준비)에 유지합니다. 참고: 사용된 초파리 배지 조성물은 (배지 1L에 대해) 옥수수 가루(80g), D-글루코스(20g), 설탕(40g), 한천(8g), 효모 분말(15g), 프로피온산(4mL), 메틸 4-히드록시벤조에이트(에탄올 3mL에 1.25g), 및 오르토인산(600μL)이었다( 재료 표 참조). 초기 먹이 기간은 파리가 굶주림 단계 전에 충분한 음식과 영양분을 섭취할 수 있도록 합니다. 수컷과 암컷 파리 모두 탐색 행동을 유도하지만 굶주림 시간은 수컷 파리 사이에서 더 일관적입니다. 또한, 암컷 파리는 짝짓기 후 먹이 선호도를 바꾼다.11.</li>
	</ol></li>
	<li>굶주림 절차<ol><li>먹이를 주는 기간이 지나면 파리에게 음식을 굶겨 주되 물을 마실 수 있습니다. 참고: 시험 및 균주에 걸쳐 배고픔 상태를 표준화하려면 식량 부족 조건에서 인구의 90% 생존 기간을 결정하는 것이 좋습니다. 이 결과에 기초하여, CS 파리는 28시간 동안 굶주렸는데(그림 1A), 일주기 리듬 및 기타 요인이 탐색 행동에 영향을 미칠 수 있기 때문이다12. 하루 중 다른 시간에 파리 탐색 활동의 일주기 변화도 측정되었습니다(그림 1B). 우리는 파리의 빛 위상에 비해 밤에 상대적 검색 활동이 감소하는 것을 발견했습니다.</li>
		<li>이틀 된 파리의 먹이를 박탈하여 식량 부족 내성을 계산하십시오. 15-20마리의 파리를 바닥에 적신 티슈 페이퍼가 있는 바이알에 넣습니다. 이것은 기질 역할을 하며 파리가 굶주림 기간 동안 물에 접근할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>식량 부족 기간 동안 1시간 간격으로 파리의 수를 세십시오. 굶주린 파리의 90%가 생존한 기간을 굶주림 기간으로 사용했습니다(그림 1A). 여러 번의 반복실험(각 균주에 대해 3-4회)을 사용하여 개별 변이의 영향을 최소화하고 기아 내성에 대한 보다 신뢰할 수 있는 평가를 제공합니다. 참고: 각 균주의 음식 기아 내성은 서로 다른 균주와 실험 간에 표준화된 배고픔 상태를 설정하기 위해 결정되었습니다. 이 간격으로 살아남은 파리의 수를 세면 시간 경과에 따른 생존율을 모니터링하고 각 균주가 굶주림에 빠지기 전에 식량 부족을 얼마나 오래 견딜 수 있는지 결정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>행동을 기록하는 절차<ol><li>굶주린 파리 한 마리를 작은 튜브에 담아 옮깁니다(그림 2A). 격리 시간을 최소화하기 위해 5-6마리의 파리를 배치하여 이 작업을 수행합니다. 단일 파리를 테스트하고 각 파리를 분리함으로써 관찰된 모든 변화나 행동은 다른 파리와의 상호 작용에 의해 영향을 받는 것이 아니라 관찰되는 특정 파리에 기인할 수 있습니다.</li>
		<li>90mm 페트리 접시를 행동 분석을 위한 장으로 사용하십시오(더 큰 페트리 접시를 사용할 수 있음). 직경이 더 큰 페트리 접시에서는 거동에 차이가 없었습니다. 표면 실장형 차가운 백색 LED 패널로 바닥에서 경기장을 비춥니다(그림 2B,C). 균일한 시각 환경을 유지하고 외부 방해를 최소화하기 위해 흰색 폴리염화비닐 파이프(높이 51.5mm, 내경 114mm)로 실험장을 둘러쌉니다. 알림: 이 파이프는 장벽 역할을 하여 경기장 외부의 시각적 자극이 파리의 행동에 영향을 미치는 것을 방지합니다. 외부 방해 요소를 줄임으로써 파리와 먹이 공급원의 상호 작용에만 집중할 수 있으며 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지할 수 있습니다.</li>
		<li>경기장 중앙에 320lux의 광도를 사용하십시오.</li>
		<li>경기장 중앙에 0.2μL 설탕 용액을 놓습니다. 보고된 실험에서 500mM 슈크로스 용액을 사용하였으나, 이는 다양할 수 있다. 2mL 마이크로 원심 분리 튜브 (내경 8.7mm, 바닥에 면을채워 길이를 5mm로 줄임)를 사용하여 경기장에 파리를 도입합니다. 그림 2A) 설탕 방울 위로 거꾸로 된 파리 한 마리를 수용합니다.</li>
		<li>파리가 비말을 삼키기 시작하면 파리 컨테이너를 제거하여 파리가 먹이 공급원에 제한 없이 접근할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>오버헤드 카메라로 경기장의 2D 위치를 촬영합니다. 참고: 본 연구에서는 Flea3(Point Grey, 1214mm 렌즈, 재료 표 참조)를 사용하여 초당 40프레임(fps)으로 기록했습니다. 그러나 배경과 좋은 대비를 제공하는 모든 카메라를 사용할 수 있습니다. 실험의 성격에 따라 30-60fps로 녹화할 수 있습니다. 추적 소프트웨어와 호환되므로 .avi 형식으로 기록하십시오.</li>
		<li>파리가 경기장에서 탈출할 때까지 재판을 기록하십시오. 파리는 자유롭게 걸어 다녔고 경기장에는 뚜껑이 없었습니다.</li>
		<li>파리가 수색을 중단하거나, 날아가거나, 경기장 주변으로 걸어갈 때를 결정하도록 함으로써 파리의 자연스러운 행동과 먹이 찾기 전략을 관찰하십시오. 시험 사이에 70% 에탄올로 페트리 접시를 닦고 완전히 말리거나 새 페트리 접시를 사용하십시오. 알림: 파리가 지속적으로 높은 활동 수준을 보일 때 조명이 켜진 후 2시간에서 6시간 사이에 모든 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 이 시간 프레임은 파리가 활성 상태에 있도록 하여 자연스러운 먹이 검색 행동을 관찰할 기회를 극대화하고 일주기 리듬과 같이 파리의 행동에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인의 영향을 줄입니다. 행동 설정은 온도와 습도가 조절되는 방 안에 보관되었습니다. 경기장은 진동이 없는 탁자 위에 놓였다. 이 실험 설정에는 설탕에 대한 반응에 대해 개별 파리를 분리하고 테스트하는 것이 포함되었습니다. 굶주린 파리에게 설탕 방울을 제공하고 그들의 행동을 비디오로 기록했습니다(그림 2B,C, 비디오 1). 실험은 파리가 일관되게 높은 활동 수준을 보이는 특정 기간 동안 수행되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2단계 이후의 궤적을 분석하여 검색 동작을 결정합니다.</li>
</ol>2. 지역 검색을 위한 궤적 분석
<ol><li>Ctrax 소프트웨어11 을 사용하여 녹화된 비디오를 분석합니다( 자료표 참조). 알림: 이 소프트웨어는 비디오에서 파리의 위치를 추적하고 x, y 좌표로 변환하여 파리의 움직임을 정확하게 추적하고 분석할 수 있습니다. Ctrax 사용 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>궤적을 초기 공급 단계와 탐색 단계의 두 단계로 나눕니다. 먹이 섭취 종료 및 보행 시작을 파리가 세 개의 연속 프레임에서 >4mm s-1 의 속도로 이동하는 것으로 정의합니다. 알림: 먹이 주기가 끝난 후 나머지 궤적은 파리의 검색 응답으로 사용되었습니다. 이 연구는 VirtualDub( 자료 표 참조)를 사용하여 추적하기 전에 비디오에서 공급 단계를 제거했습니다.</li>
	<li>다음 매개 변수로 검색을 수량화합니다.<ol><li>경로 길이: 이 매개변수는 먹이를 찾는 동안 파리가 시작점에서 걸어간 거리(mm)를 나타냅니다.</li>
		<li>체류 시간: 수색 중 파리가 걷는 데 소요된 시간(초)입니다. 그것은 수색 기간과 먹이를 찾는 파리의 끈기를 나타냅니다.</li>
		<li>구불구불: 경로의 직선(경로의 첫 번째 지점과 마지막 지점 사이의 거리)을 전체 경로 길이로 나누고 1에서 빼서 비율로 계산합니다. 구불구불한 값이 높으면 궤적의 비틀림이 더 크다는 것을 나타냅니다.</li>
		<li>반품 횟수: 개발된 알고리즘을 사용하여 두 개의 동심원을 사용하여 반품 횟수를 식별하고 계산합니다. 알림: 검색 원점을 나타내는 안쪽 원, Rin(2.5mm)과 파리가 원점에서 멀어져야 하는 최소 거리 Rout(4mm)을 나타내는 외부 원. 귀환은 바깥쪽 원(Rout)에서 벗어난 다음 안쪽 원(Rin)으로 돌아오는 것으로 정의되었습니다.</li>
		<li>활동률: 백분율로 표시tage, 파리의 보행 속도가 2mm/s를 초과할 때 먹이를 찾는 시간을 결정하여 활동률을 계산합니다. 이 매개변수는 먹이 검색에 대한 파리의 활동 및 참여 수준을 반영합니다. 그것은 활동적인 수렵 채집자와 덜 활동적인 개인을 구별합니다. 참고: 본 연구에서는 궤적에 대한 추가 분석을 위해 MATLAB 및 Python을 사용했습니다. 스크립트는 여기에서 액세스할 수 있습니다: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. 분석 절차에는 Ctrax 소프트웨어를 사용하여 파리의 움직임을 추적하고 먹이 검색 기간, 총 경로 길이, 검색 시간, 사행, 반환 횟수 및 활동률과 같은 매개 변수를 결정하는 것이 포함됩니다. 이러한 매개변수는 기록된 먹이 탐색 실험 동안 파리의 행동과 먹이 찾기 효율성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

초파리의 설탕 유발 먹이 찾기 행동 분석

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</ol>

저자(들)는 이 논문의 연구, 저자 및/또는 출판과 관련하여 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

현재 연구는 Dethier2에 의해 처음 기술된 초파리의 설탕 유도 검색 행동을 조사하기 위한 간단한 패러다임을 소개합니다. 이 타고난 행동은 파리가 먹이 보상을 만난 후 추가 먹이 자원을 찾기 위해 지역 검색에 참여할 수 있도록합니다. 실험 프로토콜의 가장 중요한 측면은 파리에게 적절한 동기를 부여하는 것입니다. 첫째, 파리는 설탕 섭취를 보장하기 위해 물을 마실 수 있는 동안 음식을 먹지 못한 굶주린 상태여야 합니다. 실험 전반에 걸쳐 균일한 배고픔 상태를 유지하기 위해 인구의 90%가 생존하는 기간을 기아 기간으로 사용했습니다. 결정적으로, 먹이를 먹은 후 탐색 반응을 유도하려면 충분한 품질의 음식 자극을 제공해야 하지만 파리를 완전히 만족시키기에는 충분하지 않습니다. 따라서 설탕의 농도와 양, 굶주림 기간을 표준화하는 것은 시간이 많이 걸릴 수 있지만 강력하고 신뢰할 수 있는 행동을 위해 필수적입니다.
이 연구에서는 굶주린 파리에 대한 자극으로 500mM, 0.2μL 자당 용액을 사용했습니다. 설탕 섭취는 회전 행동이 증가하고 설탕이 떨어진 위치로 자주 돌아가는 특징적인 국소 탐색 행동을 유발합니다(비디오 1). 반대로, 설탕이 제공되지 않은 배고픈 파리는 검색 반응을 나타내지 않습니다. 특히, 경로 길이, 체류 시간, 사행, 귀환 횟수를 포함한 모든 행동 관련 매개변수는 먹이를 먹지 않은 파리에서 유의하게 낮았습니다. 우리는 이전에 물을 섭취하는 것만으로는 검색 응답(search response)9을 유도하지 못한다는 것을 증명한 바 있다.
이 설정은 이 타고난 행동을 연구하기 위한 비용 효율적이고 유지 보수가 적은 접근 방식을 제공합니다. 이 연구에서는 백라이트 경기장을 사용하지만 파리와 배경 사이에 충분한 대비가 있는 한 상단 조명도 사용할 수 있습니다. 사용된 추적 소프트웨어는 정적 배경(13)에 대한 파리 이동의 감지에 의존한다. 카메라 및 해상도 설정은 조사 중인 동작의 특정 규모에 따라 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 이 방법론을 통해 먹이를 찾는 동안의 감각적 단서 주의, 먹이 섭취 및 먹이 주기, 탐색의 운동 제어, 착취 및 탐험과 관련된 의사 결정 과정 등 먹이 찾기 행동의 다양한 구성 요소를 연구할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 이 패러다임은 다양한 생태학적 맥락에서 다양한 분류군에서 공통적으로 관찰되는 행동인 지역 탐색의 조사를 용이하게 한다6. 초파리에서 이러한 행동을 연구하면 먹이 찾기와 관련된 신경 경로를 이해하기 위한 과학적 탐구의 길이 열립니다. 우리는 꿀벌의 지역 검색을 연구했으며 그 행동이 파리와 유사하다는 것을 보여주었습니다 7,8.
최근의 연구들은 국소 탐색 행동이 파리의 다양한 당 감각 뉴런의 광유전학적 활성화에 의해 촉발될 수 있다는 것을 보여주었다 14,15,16. 그러나 이 연구에서 관찰된 지역 검색이 실제 설탕 섭취에 대한 파리의 자연스러운 행동을 어느 정도 정확하게 나타내는지는 불분명합니다. 먹이 행동은 파리에서 엄격하게 조절되며, 이러한 발견은 인두 당 수용체의 활성화가 탐색 행동을 시작한다는 것을 나타냅니다. 족근 미각 감각은 당을 감지하고 확장 반사를 유도하는 역할을 하는 반면, 인두 미각 뉴런은 수유를 진행해야 하는지 여부를 결정합니다17,18. 일단 섭취되면, 설탕 용액은 식도를 통해 전방(proventriculus)으로 이동하여 작물로 들어가며, 그 팽창은 재발성 신경(recurrent nerve)에 의해 모니터링된다19. 또한 앞서 언급한 연구 중 일부는 파리를 이용하거나 감금하는 것과 관련이 있는 반면, 이 방법을 사용하면 동물이 실험 내내 자유롭게 걸을 수 있다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 우리 실험에 참여한 파리들은 뚜껑을 열지 않고 경기장 안에 머물며 수색할 수 있는 충분한 동기를 가지고 있었다.
파리의 탐색 행동을 지배하는 신경 경로, 유전 요인 및 환경 단서 간의 복잡한 상호 작용을 이해하면 정보 처리, 학습 및 기억 형성의 기본 원리를 밝힐 수 있습니다. 또한, 먹이 찾기 행동의 조절 장애는 섭식 장애 및 비만을 포함한 다양한 인간 장애와 관련이 있습니다. 초파리에서 사용할 수 있는 광범위한 신경유전학적 도구는 설탕 유도 탐색 행동을 조사하고 먹이 찾기의 기저에 있는 신경 및 유전 메커니즘을 밝히는 데 귀중한 리소스를 제공합니다. 광유전학적 조작 및 기능적 이미징과 함께 이 패러다임은 강력하고 유망한 접근 방식을 제시합니다20,21,22. 그러나 광유전학을 사용하여 신경 활동을 실시간으로 조작하기 위한 설정을 수정하는 것은 어려울 수 있습니다. 파리가 탐색 행동을 수행하는 동안 뇌의 신경 활동을 모니터링하려면 트레드 볼에 묶인 파리와 같은 다른 설정이 필요합니다. 먹이 조절 및 의사 결정 과정과 같은 먹이 찾기 행동의 많은 측면은 종에 따라 매우 잘 보존됩니다. 따라서 파리의 먹이 찾기의 신경 메커니즘을 연구하여 얻은 통찰력은 인간을 포함한 다른 유기체의 유사한 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

먹이를 찾고 먹이를 찾는 행동은 분류군 전반에 걸쳐 유기체가 보여주는 기본적인 생존 전략입니다. 곤충에서 먹이를 찾는 행동의 두 가지 유형이 확인되었는데, 배고픔으로 인한 먹이 찾기와 식사 후 지역 찾기가 그것이다1. 배가 고플 때 곤충은 먹이를 찾기 위해 감각 신호에 의존합니다. 작은 먹이 밭을 발견하고 먹으면 뒤얽힌 경로와 먹이 위치 주위를 맴도는 것이 특징인 지역 탐색 행동을 시작합니다.
지역 검색의 특정 형태인 설탕 유도 검색 행동은 60여 년 전 미국 생물학자 빈센트 데티어(Vincent Dethier)가 'blowflies2'에서 처음 연구했다. 굶주리면 파리에게 소량의 설탕을 주어 포만감을 주지 않고 지역 검색을 시작합니다. 일반적인 탐색 행동은 낮은 운동성과 높은 회전 속도로 매우 구불구불한 걸음을 걷고 설탕이 떨어진 위치로 돌아가는 것이 특징입니다. 후속 연구에서는 집파리와 초파리에서 이러한 행동을 조사했습니다 3,4. 탐색의 시작, 강도 및 기간은 동물의 내부 상태(예: 박탈 및 동기)뿐만 아니라 자원 가용성 및 품질과 같은 외부 요인에 의해 조절된다 1,5,6.
추적 기술의 발전은 연구자들에게 통제된 영역 내에서 행동을 포착하고 분석할 수 있는 귀중한 도구를 제공했습니다. 여기에서는 설탕 섭취 후 자유롭게 걷는 파리를 추적하기 위한 행동 패러다임을 제시합니다. 이 간단한 설정을 통해 경기장에서 제공되는 농축된 설탕 용액에 대한 반응으로 파리의 움직임을 포착하고 분석하여 초파리 에서 설탕으로 유도된 검색 행동을 연구할 수 있습니다. 고급 추적 기술 및 데이터 분석 기술을 사용하여 운동 패턴, 공간 탐색 및 당 자극에 대한 반응 역학을 성공적으로 정량화했습니다.
이 분석을 사용하여, 당-유도 검색은 경로 통합의 사용을 포함하며, 당 섭취량으로부터 공간적-시간적으로 분리될 수 있다는 것이 실험적으로 입증되었다 7,8. 또한, 이러한 행동은 인두 미각 뉴런(pharyngeal taste neuron)의 활성화에 의해 유발될 수 있음이 밝혀졌다9. 최근의 연구 결과에 의하면 설탕 자극은 선천적인 방출 기전이 아니라 조절적이기도 하며, 행동의 시작을 시간적으로 조절한다8. 이 패러다임을 사용하여 꿀벌(Apis mellifera)7,8에서도 이러한 행동을 연구했습니다.
이 연구의 궁극적인 목표는 표적 유전자 조작 및 신경 영상 기술을 통해 탐색 행동을 조절하는 데 관여하는 신경 회로와 새로운 유전 구성 요소를 밝히는 것입니다. 먹이 탐색 행동은 곤충의 탐색과 공간 기억을 연구하는 데 매우 효과적인 실험 패러다임임이 입증되었습니다. 이러한 행동은 파리의 먹이 공급원을 찾는 것과 관련된 감각 지각, 의사 결정 과정 및 운동 협응을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한 이러한 연구의 결과는 많은 근본적인 유전 및 신경 메커니즘이 진화적으로 보존됨에 따라 인간을 포함한 다른 유기체의 섭식 행동을 이해하는 데 더 광범위한 영향을 미칩니다. 섭식 행동의 조절 장애는 다양한 신경 및 대사 장애와 관련이 있다10. 따라서 파리의 탐색 행동의 기저에 있는 신경 및 유전적 메커니즘은 이러한 복잡한 인간 건강 문제를 이해하고 잠재적으로 해결할 수 있는 새로운 길을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546</td><td>설탕 방울</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SRL</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Azure 렌즈</td><td>https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Camera</td><td>Logicool, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현지 옥수수</td><td></td><td></td> <td>가루</td></tr><tr><td>Ctrax 소프트웨어</td><td>https://ctrax.sourceforge.net/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>D-glucose</td><td>SRL</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Flea3</td><td>Sony</td><td></td><td>https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis</td></tr><tr><td>유리 튜브</td><td>Borosil</td><td></td><td>파리를 개별적으로 수용하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>음식이 부족할 때 파리가 물에 접근할 수 있도록 사용하는</td></tr><tr><td>LED 라이트 패널</td><td></td><td></td><td>작업장에서 맞춤 제작</td></tr><tr><td>Light Meter</td><td>TENMARS&nbsp;</td><td>&nbsp; TM-203</td><td></td></tr><tr><td>메틸 4-하이드록시벤조에이</td><td>트 피셔 사이언티픽</td><td>99-76-3</td><td></td></tr><tr><td>오르토인산</td><td>, SRL</td><td>7664-38-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬 (90 mm)</td><td>Tarsons</td><td>460090</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>SRL</td><td>79-09-4</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Qualigens</td><td>Q28105</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>현지 사용 가능</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VirtualDub&nbsp;</td><td>https://www.virtualdub.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>백색 폴리염화비닐 파이프(내경 67mm, 높이 100mm)</td><td></td><td></td> <td>작업장에서 맞춤 제작</td></tr><tr><td>효모 분말</td><td>SRL</td><td>REF-34266</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리에서 설탕 유도 국소 검색 행동 추적

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

먹이 찾기 행동은 유기체가 필수 식량 자원을 찾고 획득할 수 있도록 하기 때문에 유기체의 생존에 필수적입니다. 초파리(Drosophila)에서 배고픔은 소량의 설탕 용액을 섭취한 후 뚜렷한 검색 행동을 유발합니다. 이 보고서는 근본적인 메커니즘을 밝히기 위해 설탕 유도 검색 행동을 연구하기 위한 간단한 실험 설정을 제시합니다. 극소량의 농축된 설탕 용액은 파리의 지속적인 탐색 행동을 유도합니다. 이 행동에서 경로 통합의 관여는 파리가 자신의 궤적을 활용하여 설탕 위치로 돌아가기 때문에 확립되었습니다. 가장 최근의 발견은 설탕 섭취 후 탐색 행동의 시작과 강도에 대한 시간적 조절의 증거를 제공합니다. 우리는 또한 인두에서 특정 미각 수용체 뉴런의 인위적인 활성화를 위해 이 설정을 사용하여 검색 행동을 유도했습니다. 초파리 신경유전학 툴킷은 채집의 기초가 되는 신경 및 유전적 메커니즘을 연구하기 위해 설탕 유도 검색 행동 패러다임과 결합할 수 있는 다양한 도구와 기술을 제공합니다. 파리의 배고픔에 의한 탐색 행동의 신경 기초를 이해하는 것은 신경 생물학 분야 전체에 기여하여 다른 유기체뿐만 아니라 인간의 섭식 행동을 지배하는 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.

파리는 음식 부족 내성에 의해 추정된 기간 동안 굶주려야 했으며 설탕에 대한 반응은 개별적으로 테스트되었습니다(그림 1A 및 그림 2A). 이 행동은 온도와 습도가 조절되는 방 안에서 기록되었습니다. 보고된 실험에 0.2μL의 500mM 슈크로스 용액을 사용하였다. 설탕 방울은 경기장 중앙에 배치되고 파리는 설탕에 도입되었습니다 (그림 2B). 파리가 경기장에서 탈출할 때까지 행동이 기록되었습니다. 영상을 분석해 파리의 x,y 좌표와 궤적을 추출했다. 행동 반응을 정량화하기 위해 경로 길이, 체류 시간, 사행, 반환 횟수 및 활동률과 같은 몇 가지 매개변수가 사용되었습니다.
굶주린 파리의 설탕 섭취는 구불구불한 경로와 루프가 있는 지역 탐색으로 이어집니다(그림 3A,C). 음성 대조군으로, 설탕8이 제공되지 않은 굶주린 파리가 기록되었습니다. 이 파리들은 경기장에 들어왔을 때 수색을 시작하지 않고 경기장을 탈출했다(그림 3B,D). 이 그룹을 먹이를 먹지 않은 파리라고 합니다. 탐색의 매개변수: 경로 길이, 체류 시간, 구불구불한 구불구불한 및 귀환 횟수는 설탕 방울을 투여한 파리에 비해 먹이를 먹지 않은 파리에서 유의하게 낮았습니다(그림 4A-D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65955/65955fig01.jpg"> 그림 1: 야생형 균주 CS의 기아 곡선. (A) 야생형 CS 수컷과 암컷 파리의 생존율을 보여주는 굶주림 곡선. (B) 하루 중 다른 시간에 파리 탐색 활동의 일주기 변화. 오차 막대는 S.E.M.(n = 10)을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/65955fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65955/65955fig02.jpg"> 그림 2: 기아 내성 계산, 행동 기록 절차 및 궤적 분석을 포함한 실험 설정. (A) 음식-기아 내성은 표준화된 배고픔 상태를 확립하기 위해 결정되었다. 행동 기록을 위해 실험 전에 개별 파리를 작은 튜브에서 분리했습니다. 90mm 페트리 접시인 행동 영역은 바닥에서 균일하게 조명되었습니다. 설탕 용액 한 방울을 중앙에 놓고 파리가 먹이 공급원에 제한 없이 접근할 수 있도록 했습니다. (B) 파리가 경기장에서 탈출할 때까지 행동이 기록되었습니다. 비디오 분석은 추적을 위해 Ctrax 소프트웨어를 사용하고 궤적 분석을 위해 MATLAB/Python을 사용했습니다. (C) 실험 설정 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/65955fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65955/65955fig03.jpg"> 그림 3: 지역 검색을 시작하기 위한 설탕 섭취의 필요성. (A) 500mM, 0.2μL 설탕 용액을 먹인 파리의 개별 궤적. (B) 설탕을 투여하지 않은 파리의 개별 궤적. (C) 대조군에서 날아온 탐색 궤적의 오버레이(n=11). (D) 설탕을 투여하지 않은 파리(n=11)의 경로 오버레이. 모든 궤적은 걷기의 시작점으로 정규화됩니다. 이 그림은 Shakeel 및 Brockmann8에서 채택되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/65955fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65955/65955fig04.jpg"> 그림 4: 먹이를 먹지 않은 파리의 행동 매개변수 감소. (A-D) 경로 길이, 체류 시간, 구불구불한 구불구불한 이동 횟수는 설탕으로 자극을 받은 대조군 파리에 비해 설탕 보상을 받지 않은 배고픈 파리의 경우 더 작았습니다. **p &lt; 0.001, ***p &lt; 0.0001, ****p &lt; 0.00001, Wilcoxon 순위 합계 검정. 이 그림은 Shakeel 및 Brockmann8에서 채택되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/65955fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동영상 1: 경로의 실시간 궤적을 이용한 파리의 검색 동작. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/Video%201.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: CTRAX를 사용하여 비디오 파일을 추적하기 위한 단계별 지침입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65955/Manal%20et%20al%20supplementary%201%20ctrax_instructions.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster를 사용하여 설탕 유도 검색 행동을 기록하기 위한 행동 분석을 설명합니다. 이 분석은 먹이 및 먹이 찾기 관련 행동뿐만 아니라 기본 신경 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

우리의 연구는 특정 행동에서 주요 자극 입력 경로를 식별하기 위해 초파리를 유전 모델로 사용합니다. 이 접근 방식은 지역 검색 행동을 유발하는 신경망을 밝히고 꿀벌과 개미에서 알려진 것 이상으로 이해를 높이고 잠재적으로 인간에게 적용하는 것을 목표로 합니다. 초파리(Drosophila)는 파리의 먹이 찾기 행동을 이해하는 강력한 유전 모델 시스템으로, 다른 모델 시스템에서는 이전에 알려지지 않았던 새로운 회로를 식별하게 되었습니다.뉴런뿐만 아니라 이러한 회로에 대한 내부 상태 작용이 생리와 행동을 조절하는 최근 연구가 진행되고 있습니다. 우리의 연구는 Vincent Dethier가 가설을 세운 것처럼 파리 지역 탐색과 꿀벌 춤 의사 소통 사이의 잠재적 진화 적 연관성을 탐구합니다. 우리는 두 행동 사이의 유사성을 발견했으며, 이는 신경 및 분자 메커니즘을 공유한다는 것을 나타냅니다.이것은 초파리가 꿀벌 춤을 연구하기 위한 모델 시스템으로 사용될 수 있음을 시사한다. 분자 조작 및 이미징과 함께 이 패러다임은 강력하고 유망한 접근 방식을 제시합니다. 당사의 프로토콜은 고가의 재료를 사용하지 않으며 실험실에서 맞춤 제작할 수 있습니다.재현 가능하고 강력한 테이크를 생성하는 사용자 친화적인 소프트웨어를 사용하여 많은 파라미터를 쉽고 효율적으로 비교할 수 있습니다. 우리의 연구는 먹이 주기, 수면 조절 및 의사 결정을 포함하여 먹이 찾기에서 다양한 행동 경로와 교차하는 뇌 회로를 식별하는 데 중점을 둡니다. 이들은 여러 종에 걸쳐 보존되어 있으며, 우리는 이러한 뇌 구조가 어떻게 상호 작용하고 여러 행동을 동시에 조절하는지 조사하고 있습니다.

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연구

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Behavior

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초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.

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이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

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