Name: 파킨슨병의 초파리 모델에서 변비 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: 배우세요 파킨슨병 초파리 모델에서 변비 측정법을. 알파-시누클레인을 발현한 Drosophila melanogaster의 장 통과 시간을 파란색 식염료 분석으로 평가하여 비운동 증상과 신경퇴행의 관계를 연구합니다.

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우리는 Brigham and Women's Hospital과 Harvard Medical School의 Mel Feany 박사에게 대조군과 알파 시누클레인 발현 초 파리 계통의 친절한 선물을 주신 것을 인정합니다. NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson's Disease Early Investigator Award와 같은 Olsen 박사에 대한 보조금 지원 출처를 인정합니다.

이 분석에 사용된 파리: 대조군: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; 알파 시누클레인 파리: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+; 1일 및 10일 후 폐쇄; 수컷과 암컷(짝짓기 및 짝짓기 없음) 파리( 재료 표 참조).
1. 염색 된 플라이 푸드 준비
<ol><li>파란색 소프트 젤 페이스트 식용 색소( 재료 표 참조)와 증류수를 1:1 비율(v/v)로 혼합합니다. 참고: 일부 파란색 염료는 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났으므로 비흡수성 염료만 포함된 상업용 식용 색소를 사용하십시오21.</li>
	<li>음식이 액체나 슬러리로 녹을 때까지 10-15초 간격으로 표준 옥수수 가루 한천( 재료 표 참조)으로 구성된 플라이 푸드 바이알을 전자레인지에 돌립니다. 음식이 끓지 않도록 하십시오.</li>
	<li>염료 혼합물을 식품의 각 바이알에 첨가하여 바이알 사이에 균일한 착색을 얻습니다. 식품이 균일한 파란색이 될 때까지 염료 혼합물을 혼합합니다(그림 1). 음식의 색이 포화되고 바이알 사이의 색이 변하지 않도록 파란색 염료 혼합물을 약간 첨가하십시오. 알림: 이 단계는 음식이 빨리 굳기 때문에 전자레인지 직후에 수행해야 합니다. 음식이 굳으면 바이알을 다시 전자레인지에 돌리십시오.</li>
	<li>염색된 음식의 바이알이 굳을 때까지 공기 중에서 말리십시오. 건조하는 동안 바이알 입구에 얇은 종이 타월을 놓아 길 잃은 파리가 바이알에 떨어지지 않도록 합니다.</li>
	<li>음식이 식고 굳어지면 테스트에 사용할 파리를 파란색 음식으로 옮깁니다. 알림: 좁은 바이알(25mm)의 경우 각 바이알에 9-14개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 넓은 바이알(28.5mm)의 경우 각 바이알에 10-20개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 파리는 성별이나 짝짓기 경험에 의해 분리되지 않으며 짝짓기 된 암컷과 짝짓기하지 않은 암컷과 함께 수컷과 암컷의 혼합 개체군을 포함합니다.</li>
	<li>파리가 있는 바이알을 인큐베이터에서 25°C에서 밤새 배양합니다.</li>
</ol>2. 파리 이미징
참고: 이 단계는 선택 사항입니다(그림 2).
<ol><li>다음날 아침 (시간 0), 대표 파리를 60 초 동안 이산화탄소로 마취시킵니다. 복부 쪽이 위쪽을 향하도록 파리를 놓습니다.</li>
	<li>카메라( 재료 표 참조)를 사용하여 매시간 파리의 이미지를 캡처하여 소화 시스템에 남아 있는 파란색 음식의 양을 시각화합니다. 알림: 이 파리는 마취가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 분석의 정량 부분(3단계)에 사용해서는 안 됩니다.</li>
	<li>매 시간마다 새로운 파리를 마취하고 이미지를 촬영하십시오.</li>
</ol>3. 변비 분석 수행
<ol><li>나머지 (마취되지 않은) 파리는 표준 초파리 사료가 담긴 바이알로 옮깁니다. 각 바이알에 번호를 매깁니다.</li>
	<li>파리를 25°C의 인큐베이터에서 60분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>60분 후, 파리를 표준 초파리 사료와 함께 새 유리병으로 옮깁니다. 첫 번째 바이알 세트에서 데이터 기록을 시작합니다.</li>
	<li>바이알 길이 아래에 점선을 그려 카운팅이 시작되는 지점을 표시합니다.</li>
	<li>각 바이알의 벽에 있는 작고 둥근 점의 수를 수동으로 계산합니다. 음식이나 바이알 플러그에 있는 점을 세지 마십시오.</li>
	<li>각 바이알의 벽에 있는 파란색 점의 수를 세는 것으로 시작합니다.</li>
	<li>각 유리병의 벽에 있는 불투명하고 무색의 점의 수를 세십시오. 참고: 각 점은 소변과 배설물의 조합인 파리 배설물입니다22. 때때로 파리가 배설물 위를 걸어 다니며 흔적을 남길 수 있으며, 이 경우 흔적의 각 개별 표시가 아닌 원래 점만 계산합니다.</li>
	<li>각 바이알의 총 점 수에 대한 파란색 점의 비율을 기록합니다. 알림: 총 점 수는 동일한 바이알 벽에 있는 무색 점 수에 바이알 벽에 있는 파란색 점 수를 더한 것입니다. 이것은 시간당 파란색 배설물의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>3.2-3.8단계를 7번 더 반복하여 총 8시간 동안 매시간 데이터를 수집합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>각 조건에 대해 시간당 파란색 배설물 비율을 그래프로 표시합니다.</li>
	<li>조건 간의 데이터를 비교합니다. 참고: 통계적 유의성은 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하는 3가지 방법으로 결정할 수 있습니다.</li>
</ol>

Drosophila Flies의 변비 분석

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

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이 프로토콜에는 분석을 성공적으로 완료하는 데 도움이 되는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 각 바이알에 대한 각 라운드 사이의 시간 간격이 실험 전반에 걸쳐 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 바이알에 번호를 표시하면 긴 유전자형 설명의 필요성을 피하고 시간을 절약하는 데 도움이 됩니다. 또한, 배설물(22 )을 계수하는 방법이 실험 전반에 걸쳐 일관되게 유지되는 것이 중요하다. 파란색 배설물은 음식과 바이알 플러그에서 볼 수 있지만 무색의 배설물은 보이지 않습니다. 따라서 음식이나 바이알 플러그의 파란색 점을 세지 마십시오.
행동 분석에서는 파리 행동의 변동 또는 분석에 영향을 미치는 알 수 없는 변수로 인해 결과가 일치하지 않을 가능성이 항상 있습니다. 모든 실험에 동일한 초파리 배지, 동일한 식용 염료 및 동일한 브랜드의 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 몇몇 실험에서 파리는 이른 오후에 배변을 덜 하는 경향이 있는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 파리의 일주기 리듬23 때문일 것이다. 그러나, 이 행동은 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리 둘 다에서 일관됩니다, 그래서 우려를 일으키면 안됩니다.
분석 초기에 파리가 푸른 배설물을 배설하지 않으면 사용된 염료가 충분히 착색되지 않았을 수 있습니다. 이 경우 그에 따라 염료와 증류수의 비율을 높일 수 있습니다. 또한 파리의 소화관에 소량의 파란색 음식만 남아 있을 때 배설물이 옅은 파란색인지 무색인지 판단하기 어려울 수도 있습니다. 이런 일이 발생하면 바이알 뒤에 흰색 종이를 놓으면 배설물 점의 색상을 결정하는 데 도움이 됩니다. 배설물이 매우 연한 파란색일지라도 무색의 배설물보다는 파란색 배설물로 기록하는 것이 가장 좋습니다.
이 분석의 한 가지 한계는 대변 반점을 수동으로 계산해야 한다는 것입니다. 고처리량 스크리닝의 가능성을 개선하기 위해 이 프로토콜은 향후 다중 웰 플레이트에서 개별 파리에 의해 생성된 청색 분변 반점을 자동으로 정량화할 수 있도록 수정될 수 있습니다. 또 다른 한계는, 알파 synuclein 모형이 PD의 전구 모형으로 발전되는 잠재력이 있더라도, 변비가 neurodegeneration 없이 출석하는 최선 시점이 아직 확인되지 않았다 입니다.
요약하면, 이 방법은 PD의 초파리 모델에서 연구가 부족한 비운동 PD 증상인 변비를 모델링하는 간단하고 직접적인 접근 방식을 제공합니다.

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 진행성 신경퇴행성 질환으로, 서동, 경직, 떨림과 같은 운동 증상이 임상적으로 나타나 상당한 이환율을 초래한다1. 병리학적으로, PD는 흑질에 있는 도파민 신경 세포의 손실 및 알파 synuclein의 misfolding에 의해 정의되, Lewy 몸 및 Lewy neurites의 대형으로 이끌어 내. 파킨슨병의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않은데, 이는 유전적 요인과 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 기인하는 것으로 보인다 2,3. 현재로서는 질병 수정 요법을 사용할 수 없으며, 이는 부분적으로 진단 당시 병리학의 진행된 단계 때문일 수 있습니다. 연구에 따르면 흑질에 있는 도파민 뉴런의 60% 이상이 운동 증상의 시작으로 이미 소실된 것으로 나타났으며, 이는 질병 조기 발견을 위한 잠재적인 바이오마커를 탐색해야 할 필요성을 강조합니다4. 이러한 임상적 바이오마커 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 환자에서 흔히 발생하며5,6 운동 증상 발현보다 수년 또는 수십 년 전에 나타날 수 있다.
운동 증상에 근거한 복막투석의 임상적 정의에도 불구하고, 변비는 증상적으로 치료하기 어렵고 환자의 삶의 질에 심각한 손상을 초래하는 여러 비운동 증상 중 하나이다7. 뇌와 장 신경계 사이의 양방향 통신을 나타내는 장-뇌 축의 변화는 PD 발병과 관련이 있습니다. 알파-시누클레인 응집체는PD 환자8의 위장관에서 채취한 조직 샘플에서 발견되었으며, 동물 모델은 장 신경계의 알파-시누클레인 응집체가 프리온과 같은 방식으로 중추 신경계(9)에 퍼진다는 것을 시사한다. 또한, 복막투석 환자는 장내 마이크로바이옴(microbiome)10에 이상을 보이며 과도한 장내 염증을 경험할 수 있다11. 파킨슨병의 변비는 파리(12,13) 또는 설치류(14,15)에서 파킨슨병과 관련된 변비에 대한 보고된 모델은 거의 없는 등 연구가 부족했다.
이 분석실험은 파리가 범 뉴런 드라이버인 n-synaptobrevin의 통제하에 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하는 PD의 초파리 모델을 사용합니다. 이 파리는 알파-시누클레인 응집, 운동 기능 장애 및 노화 관련 신경 퇴행을 포함한 PD의 모든 특징을 나타내어 도파민 뉴런16,17의 손실을 초래합니다. 이전 연구에서는 소화 시스템의 기능적 차이를 밝히기 위해 파리의 배설물 배출량을 측정하고, 파리의 배설물을 정량화하고, 다양한 유전 계통에 걸쳐 배설량을 비교하는 방법을 도입했습니다 18,19,20. 여기에서, 우리는 인간 알파 시누클레인을 발현하는 파리를 이용한 변비 분석을 시연한다. 이 간단하지만 유용한 도구를 사용하면 PD의 중요한 비운동 증상을 연구할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1400g 자당</td><td>MP Biomedicals</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800g 포도당</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884g 효모</td><td>MP Biomedicals</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428g 한천 Fisher</td><td>Scientific</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600mL 당밀</td> 할머니<td>의 당밀</td><td></td> 7971942 <td></td></tr><tr><td>68L 물</td><td>N/A N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>680mL 테고셉트 믹스(6L 에탄올 중 테고셉트 1200g)</td>6864g <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>옥수수</td><td>가루 진주 밀링</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800mL 산 혼합물(1L 물 중 83mL 인산 + 1L 물 중 836mL 프로피온산)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens 표준 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>와이드 플라스틱 바이알용 러그</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 와이드 초파리 바이알, 폴리스티렌</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>버전 9.5.1</td></tr><tr><td>Olympus DP23 카메라</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 SZX12 실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>인산</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소프트 젤 페이스트 식품 색소, 로열 블루</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td> Lines가 제공하는 모든 라인은 <td>Dr. Feany에서 직접 구할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파 시누클레인</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

파킨슨병의 초파리 모델에서 변비 측정

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

파킨슨병(PD)의 비운동 증상은 흔하고 치료가 어려우며 삶의 질을 크게 떨어뜨립니다. 흔한 비운동 증상 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 진단보다 수년 또는 수십 년 앞설 수 있습니다. 변비는 PD의 동물 모델에서 충분히 연구되지 않았으며 특별한 치료법이 부족합니다. 이 분석실험은 PD의 초파리 모형을 이용합니다 인간 알파 synuclein가 pan 신경 운전사의 밑에 표현되는 곳. 알파 synuclein를 표현하는 파리는 PD의 특징을 개발합니다: 도파민성 신경 세포의 손실, 운동 손상 및 알파 synuclein 포함.
이 프로토콜은 이 파리의 변비를 연구하는 방법을 설명합니다. 파리는 밤새 파란색 첨가물이 첨가된 플라이 사료에 넣은 다음 다음날 표준 사료로 옮깁니다. 그런 다음 8시간 동안 매시간 표준 플라이 푸드가 있는 새 바이알로 옮겨집니다. 각 이식 전에 바이알 벽의 총 분변 반점 대비 파란색 분변 반점의 비율이 계산됩니다. 알파 시누클레인이 결핍된 대조군은 알파 시누클레인을 발현하는 파리가 생기기 전에 모든 청색 염료를 배출합니다. 또한 장에서 파란색 음식물이 통과하는 것을 간단한 사진으로 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법의 단순성으로 인해 전방 유전 또는 화학 스크리닝에서 초파리의 변비 조절 인자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

초파리의 복부는 투명하기 때문에 살아있는 마취된 파리의 장 안에서 푸른 음식을 시각화할 수 있습니다. 장 이동의 질적 차이는 다양한 시점에서 파리의 이미지를 촬영하여 평가할 수 있습니다. 대조군 파리에서는 파란색 음식이 빠르게 배출되는 반면 알파 시누클레인 파리에서는 파란색 음식이 8시간 동안 장에 존재합니다(그림 2).
알파 synuclein 파리는 eclosion10 후에 10 일까지 발달하는 튼튼한 표현형과 더불어 나이 관련 neurodegeneration를, 표시합니다. 이 시점에서 대조군과 비교할 때 장 통과 시간의 차이는 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하여 확인할 수 있습니다(그림 3). 운동 역기능과 neurodegeneration가 또한 아직 출석하지 않을 때 통제와 알파 synuclein 파리 사이 내장 이동에서 다름은 또한 출석하지 않는 더 이른 시점, 1 일 후에 eclosion (숫자 4)에서 관찰되지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> 그림 1: 파란색 식품 바이알과 배설물 반점. (A) 모든 바이알에는 파란색 식품이 들어 있습니다. 이 시점에서 파리는 이제 막 파란 음식에 들어갔고 파란 배설물은 보이지 않습니다. (B) w1118 파리가 날아간 후 바이알을 1시간 동안 신선한 음식으로 옮긴 다음 제거했습니다. 왼쪽 삽입은 (C)에서 확대되고 오른쪽 삽입은 (D)에서 확대됩니다. (C) 파리 먹이의 존재로 인해 분석에서 제외된 영역. (D) 파란색(검은색 화살표)과 파란색이 아닌 반점(노란색 화살표)을 나타내는 배설물 반점의 확대 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> 그림 2: 시간 경과에 따른 염색된 식품의 장 이동의 시각화. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. 전송 후 시간 0과 2, 4, 6, 8시간의 대표 이미지가 표시됩니다. 대조군과 알파 시누클레인 파리는 시간 0에서 장에 있는 파란 음식의 유사한 헝겊 조각을 보여줍니다. 후속 시점에서, 대조군 파리는 알파-시누클레인 파리보다 파란색 음식이 적고, 모든 파란색 음식은 대조군 파리의 8시간 시점에서 사라집니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 암컷 파리는 크기가 더 크기 때문에 복부를 시각화하는 능력이 더 쉽기 때문에 이미징에 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> 그림 3: 폐실 후 10일째 변비 분석 . 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 밤새 파랗 염색한 음식에 남겨두었다가 그 후에 표준 비행거리 음식으로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 매체로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 6개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다( 재료 표 참조). 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> 그림 4: 폐실 후 1일차의 변비 분석. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 최소 5개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다. 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 파킨슨병의 알파 시누클레인 기반 초파리 모델에서 변비를 모델링하기 위한 분석을 제시합니다.

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

파킨슨병은 서운동증, 떨림, 경직 등의 운동 증상으로 정의됩니다. 그러나 파킨슨병을 앓고 있는 많은 환자들은 치료가 더 어렵고 삶의 질에 더 큰 손상을 초래하는 비운동 증상으로 고통받고 있습니다. 이러한 질병의 동물 모델에서는 잘 연구되지 않았으며, 이는 새로운 치료법을 찾는 우리의 능력을 제한합니다.이 프로토콜은 간단하고 저렴하지만 재현 가능한 결과를 생성합니다. 배우기 쉽고 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 간단한 분석으로 신경 퇴행이 있는 파리의 변비를 평가할 수 있습니다.앞으로는 신경퇴행이 시작되기 전에 파리가 변비를 앓는 모델을 개발하고자 합니다. 이를 통해 파킨슨병의 발병 기전을 더 잘 이해할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

, 전위의 기능을 측정하는 학습을위한 행동 assays, 및 메모리...

에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila</emNeurodegeneration의> 모델

파킨슨 병은 운동력 결함을 일으키는 중추 신경계의 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 로테 논 모델 초파리 파킨슨 병. 이 논문은 로테 논으로 인한 자연 및 놀라게 유도 모두 운동 부족의 특성이 분석을 간략하게 설명합니다.

방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다<em&gt; 초파리</em

우리는 신경퇴행성 질환의 모델로 Drosophila melanogaster에서 최적화되고 저렴하며 신뢰할 수 있는 음성 지오택시 분석을 제시합니다. 경미한 운동 결함에 더 민감하기 때문에 이 분석은 잠재적인 유전적 상호 작용 및 약물 표적을 스크리닝하는 데 도움이 됩니다.

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이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.

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