Name: 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa의 siderophore 생산 정량 분석 방법을. 분광광도법으로 pyoverdine과 pyochelin을 측정하여 병원균의 철 흡수 메커니즘과 독성 인자를 연구할 수 있습니다.

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저자는 DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program 및 FIST의 자금 지원을 인정합니다. SHODH에서 받은 MR 감사 펠로우십. HP는 CSIR로부터 받은 펠로우십에 감사를 표합니다.

녹농균의 모든 박테리아 분리물은 인도 바도다라(Vadodara)와 자이푸르(Jaipur)의 의학 미생물학 실험실에서 얻었다. 선택된 모든 임상 분리물은 생물 안전 캐비닛(BSL2)에서 처리되었으며 실험 중 박테리아 분리물을 취급하는 동안 최대한의 주의를 기울였습니다. 모든 시약/용액의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
1. Chrome Azurol Sulfonate (CAS) 염료 및 한천 배지의 제조
<ol><li>다음 조성으로 CAS 염료 (100mL)를 준비하십시오.<ol><li>CAS 60mg을 증류수 50mL에 녹입니다(용액 1).</li>
		<li>2.7mg의 FeCl3·6H2O를 10mM HCl 10mL에 녹입니다(용액 2).</li>
		<li>세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide, HDTMA) 73mg을 증류수 40mL(용액 3)에 녹입니다.</li>
		<li>솔루션 1, 솔루션 2 및 솔루션 3을 조심스럽게 혼합합니다. 유리병에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 단계에 따라 CAS 한천을 준비합니다.<ol><li>100mL의 MM9 염 용액을 750mL의 증류수에 추가합니다.</li>
		<li>피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 유리산 32.24g을 녹입니다.</li>
		<li>우뭇가사리 15g을 넣는다. 오토클레이브하고 식히십시오.</li>
		<li>멸균 카사미노산 용액 30mL와 멸균 20% 포도당 용액 10mL를 혼합물에 추가합니다.</li>
		<li>CAS 염료 100mL를 넣고 섞은 후 무균 상태로 붓는다. 참고: MM9 배지, 카사미노산 용액 및 8-하이드록시퀴놀린의 제조는 보충 파일 1에 나와 있습니다. PIPES 버퍼는 pH에 민감합니다. pH 5.6에 도달할 때까지 녹지 않습니다. PIPES가 물에 용해되기 시작하면 pH가 더욱 낮아지기 때문에 pH를 지속적으로 모니터링해야 합니다. 클로로포름에 용해된 3% 8-하이드록시퀴놀린과 동일한 부피의 카사미노산을 추출합니다. 혼합되지 않는 용액을 4°C에서 약 20분 동안 그대로 두고 하상을 방해하지 않고 용액의 상부를 조심스럽게 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. siderophores 생산의 정성적 분석
<ol><li>녹농균의 24시간 배양에 대해 OD600nm를 0.2로 설정합니다.</li>
	<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 CAS 한천 플레이트에 박테리아 배양액을 줄무늬로 만듭니다.</li>
	<li>30 °C에서 24 시간 동안 배양합니다. 참고: 펩톤수 배지 또는 0.8% 생리식염수를 사용하여 박테리아 배양을 희석할 수 있습니다. 24 시간 동안 박테리아 성장이 관찰되지 않으면 CAS 플레이트를 48-72 시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>3. 전체 siderophore의 정량적 추정
<ol><li>OD600 nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>48시간 후 실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 100μL의 cell-free 상층액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가하고 여기에 100μL의 CAS 염료를 추가합니다.</li>
	<li>알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 630nm에서 분광 광도계 판독값을 취합니다.</li>
	<li>전체 사이드로포어의 정량화를 위해 얻은 결과를 PSU(Percent Siderophore Unit)로 계산합니다. 참고: PSU는 [(Ar - As)/Ar] x 100으로 계산할 수 있습니다. 여기서, Ar = 630nm에서 기준의 흡광도,S = 샘플의 cell-free 상층액의 흡광도. 참고로 CAS 염료는 접종되지 않은 펩톤 물 매체에 첨가해야 합니다. 시험관, 플라스크 등과 같은 모든 유리 용기에 6M HCl을 2시간 동안 채우고 증류수로 두 번 헹구어 철분을 제거합니다.</li>
</ol>4. 피오버딘의 정량적 추정
<ol><li>OD600nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>48시간 후 더 진행하기 전에 박테리아 성장의 OD600nm 를 측정합니다.</li>
	<li>실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심 분리 후 100 μL의 무 세포 상청액을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 추가하고 100 μL의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가합니다.</li>
	<li>OD405 nm에서 분광광도계를 측정합니다.</li>
</ol>5. Pyochelin 적출과 분광광도법
<ol><li>OD600nm를 0.25로 조정한 후 King's B 배지(보충 파일 1)에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 재접종하고 30°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>24시간 후 배양액 100mL를 취하고 실온에서 10분 동안 4650 x g 으로 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 상층액에 1M 구연산 5mL를 첨가합니다. 에틸 아세테이트 50mL로 두 번 추출합니다.</li>
	<li>주사기 필터를 통해 황산 마그네슘으로 유기상을 여과합니다. 여과된 유기상을 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>320nm에서 분광광도계를 측정합니다. 알림: 파이오쉐린은 실온에서 매우 불안정한 화합물이므로 얼음에서 추출 과정을 수행하십시오. 필터 분리를 위해 50mL 멸균 주사기를 사용합니다. 주사기 끝에 솜을 놓고 황산마그네슘 1g을 넣습니다. 주사기 끝에 멸균 주사기 필터를 고정하고 멸균 튜브에 여과액을 수집합니다.</li>
</ol>

녹농균 분리체(Pseudomonas aeruginosa Isolates)의 Siderophore 생산 평가

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</ol>

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이 프로토콜을 통해 연구자들은 박테리아 cell-free 상층액에서 총 siderophore와 P. aeruginosa의 두 가지 다른 siderophore, 즉 pyoverdine 및 pyochelin을 정량할 수 있습니다. CAS 한천 플레이트 분석에서 CAS 염료와 Fe3+ 이온은 복합체를 형성합니다. 박테리아가 siderophore를 생성할 때 CAS-Fe3+ 복합체에서 Fe3+ 이온을 소멸시켜 박테리아 성장 주변의 색상 변화를 유도합니다. 이 변화는 박테리아 성장14,15 주위에 명확한 주황색 후광을 초래한다. 박테리아가 CAS 한천 플레이트에 직접 줄무늬가 생길 수 있지만 전체 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 수의 박테리아 세포를 줄무늬로 만들면 박테리아 성장 주위에 넓은 주황색 후광이 생성될 수 있는 반면, 더 적은 수의 박테리아 세포를 사용하면 투명 영역이 좁아질 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 OD600을 조정하여 균일한 수의 박테리아 세포를 줄무늬로 만들었습니다. 까다로운 박테리아는 24시간 내에 결과를 보일 수 있는 반면, 느리게 자라는 박테리아는 사이드로포어 생성을 입증하는 데 72시간 이상이 걸릴 수 있습니다.
전체 siderophore의 정량적 측정을 위해 처음에는 고전적인 분광법이 사용되었는데, 이는 siderophore 검출을 위해 상당한 양의 상층액이 필요하므로 비실용적입니다. 전체 siderophore의 정량화는 이제 수정된 CAS 분석과 함께 96웰 플레이트를 사용하여 수행됩니다. 이러한 접근법은 기존의 분광법에 비해 시약, 박테리아 상층액, 시간 및 정확도 증가의 사용을 감소시켰다16. 다른 연구에서도 시간을 절약하고 보다 효율적인 방법으로 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 것으로 보고되었습니다17. 마이크로타이터 플레이트를 사용한 총 사이드로포어의 정량화는 효율적인 접근 방식임이 입증되었습니다. 이 연구에서는 무철분 배지에서 자란 48시간 된 박테리아 배양액을 검사 대상으로 선택했습니다. Luria Broth, Luria Broth(3% 8-하이드록시퀴놀린으로 추출), King's B 배지(3% 8-하이드록시퀴놀린으로 추출) 및 펩톤수 배지(3% 8-하이드록시퀴놀린으로 추출)와 같은 다양한 성장 배지에서 사이드로포어 생성을 평가하기 위한 비교 연구도 수행되었습니다. 펩톤 물 매체가 가장 많은 양의 사이드로포어 생성을 나타내는 것이 관찰되었으며, 따라서 추가 실험을 위해 선택되었습니다. 다양한 성장 배지에서 siderophore 생산을 묘사하는 그래프가 보충 그림 1에 포함되어 있습니다.
Pyoverdine은 분광 형광 판독 값을 사용하여 검출하고 정량화 할 수 있지만 pyoverdine 만 형광을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. Fe3+ 이온과 복합체의 피오베르딘은 형광18,19를 나타내지 않습니다. 피오버다인 검출 및 정량화를 위해 48시간 된 박테리아 배양액을 연구 대상으로 선택했습니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 초기에 철분이 부족한 상태에서 피오헬린을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 심각한 철분 스트레스 조건에 노출된 후에는 피오베르딘 생산으로 전환합니다. 피오베르딘은 알루미늄, 갈륨, 망간 및 크롬과 같은 다른 금속 양이온을 킬레이트화할 수 있지만, 철만이 세포막으로 성공적으로 운반된다는 것이 입증되었다(19).
전체 시데로포어 및 피오베르딘과 마찬가지로 피오쉐린은 무세포 상층액에서 직접 정량화할 수 없으며 디클로로메탄20을 사용하여 추출해야 합니다. 디클로로메탄은 무세포 상층액과 혼합되지 않으며 바닥에 별도의 층을 형성합니다. 본 연구에서는 루리아 육수, 펩톤수, 카사미노산 배지 등 다양한 영양 배지를 테스트하였으나 King's B 배지에서 상당한 양의 파이오슐린을 얻었다. Hoegy et al.은 프로토콜에 CAA 배지를 사용했지만, CAA 배지는 박테리아 성장을 지원하지 않기 때문에 King's B 배지로 수정했습니다21. 이 방법은 8-하이드록시퀴놀린으로 영양 배지를 추출하여 배지에서 철 잔류물을 제거하여 철 결핍 배지를 생성함으로써 추가로 수정되었습니다. 또한 배양 시간은 피오쉐린 생산에 상당한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. Dumas et al.은 녹농균(P. aeruginosa) 이 심각한 철분 제한 조건 하에서 피오쉐린(pyochelin)에서 피오베르딘(pyoverdine) 생산으로 전환한다는 것을 입증했다12. 이 연구에서 48시간 배양에서는 피오쉐린이 검출되지 않았기 때문에 24시간 된 박테리아 배양에서 피오쉐린 추출 및 검출을 수행했습니다. 상층액의 부피는 또한 피오쉐린 검출에 영향을 미치므로, 100mL의 cell-free 상층액을 추출에 사용하였다. 더욱이, 피오쉐린 생산은 MR1, TL7 및 J3 분리물에서 현저히 높았는데, 이는 아마도 강력한 철분 킬레이트제를 가지고 있음에도 불구하고 피오베르딘을 생산할 수 없는 박테리아 균주 때문일 수 있다22.
Ji et al.은 피오쉐린 정량화를 위한 새롭고 민감한 접근법을 도입하여 LC/MS/MS를 사용하여 검증했습니다. 그러나 이 방법은 낭포성 섬유증 환자의 객담에서 분리한 녹농균에만 적용되었습니다. LC/MS/MS는 비용이 많이 드는 설정이기 때문에 대부분의 실험실에서 저렴하지 않을 수 있다23. Visaggio et al.은 빠르고 민감한 단일 단계 파이오쉐린 정량을 가능하게 하는 생물 발광 전체 세포 기반 바이오센서를 개발했습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 총 siderophores 및 pyoverdine24에 대한 정량화를 제공할 수 없다.
Siderophore 철분 흡수 시스템은 박테리아 생존 및 독성에 중요한 역할을 하기 때문에 다제내성 박테리아의 약물 전달에 항균제를 적용할 수 있습니다. 이 접근법은 다제내성 박테리아를 퇴치하는 새로운 방법을 제공할 수 있다25. 박테리아 세포막을 관통할 수 없는 약물은 사이드로포어에 연결될 수 있고, 생성된 Fe-사이드로포어 복합체는 박테리아 막(26) 내부로 운반될 수 있다.

유기체는 전자 수송 및 DNA 복제와 같은 다양한 필수 기능을 수행하기 위해 철분을 필요로 합니다1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 기회 병원체로, 숙주에 감염을 일으키는 다양한 독성 인자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 한 가지 기전이 사이드로포어 형성(siderophore formation)이다2. 녹농균(P. aeruginosa )은 철분이 고갈되는 동안 시데로포어(siderophores)라고 하는 특수 분자를 방출하여 주변 환경으로부터 철분을 흡수합니다. 시데로포어는 철을 세포 외에서 킬레이트화하고, 생성된 철-시데로포어 복합체는 세포로 활발하게 다시 운반된다3.
녹농균(P. aeruginosa )은 피오베르딘(pyoverdine)과 피오슐린(pyochelin)이라는 두 개의 사이드로포어(siderophores)를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 피오베르딘은 철분 킬레이트 친화도가 더 높은 것으로 알려져 있는 반면(1:1), 파이오쉐린은 철분 킬레이트 친화도가 더 낮은 것으로 알려져 있습니다(2:1)4. Pyochelin은 철분 킬레이트 친화도가 낮기 때문에 2차 사이드로포어(siderophore)라고도 불린다5. siderophore의 생산 및 조절은 녹농균6의 QS(Quorum Sensing) 시스템에 의해 능동적으로 제어됩니다.
철 담금질 외에도 siderophore는 독성 인자를 조절하는 데 관여하며 생물막 형성에 적극적인 역할을 합니다7. Siderophores는 세포 신호 전달에 관여하고, 산화 스트레스에 대한 방어, 미생물 군집 간의 상호 작용 촉진 등 추가로 중요한 역할을 합니다8. Siderophores는 일반적으로 철을 킬레이트화하는 특정 작용기에 따라 분류됩니다. 이 분류에서 세 가지 주요 bidentate 리간드는 catecholate, hydroxamate 및 α-hydroxycarboxylate3입니다. Pyoverdines는 녹농균(P. aeruginosa) 및 P. 형광(P. fluorescens)과 같은 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 특징이다 5. 이들은 6-12개의 아미노산을 함유하는 올리고펩타이드에 결합된 혼합된 녹색 형광 발색단으로 구성됩니다. 여러 가지 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRP)가 합성에 관여한다9. 피오버다인 생산 및 조절에 관여하는 4가지 유전자는 pvdL, pvdI, pvdJ 및 pvdD10입니다. 피오베르딘은 또한 포유류의 감염과 독성을 담당한다11. 녹농균(P. aeruginosa)은 적당한 철분 제한 조건에서 피오슐린을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 피오베르딘은 철분 제한 환경이 심한 환경에서 생성된다12. 피오쉐린 생산에 관여하는 두 개의 오페론은 pchDCBA와 pchEFGHI13입니다. 피오시아닌이 존재할 때, 피오첼린(카테콜레이트)은 산화적 손상과 염증을 유발하고 숙주 조직에 해로운 하이드록실 라디칼을 생성한다는 것이 주목된다11.
Chrome Azurol Sulfonate(CAS) 분석은 민감하지만 지나치게 특이적일 수 있는 미생물 분석에 비해 포괄성, 고감도 및 더 큰 편의성으로 인해 널리 채택되고 있습니다14. CAS 분석은 한천 표면 또는 용액에서 수행할 수 있습니다. 그것은 철 이온이 강렬한 파란색 복합체에서 주황색으로 전이될 때 발생하는 색상 변화에 의존합니다. CAS 비색 분석은 Fe-CAS-계면활성제 삼원 복합체에서 철의 고갈을 정량화합니다. 금속, 유기 염료 및 계면활성제로 구성된 이 특정 복합체는 파란색을 띠며 630nm에서 흡수 피크를 나타냅니다.
이 보고서는 한천 플레이트에서 시데로포어 생산을 감지할 수 있는 시데로포어 생산의 정성적 검출 방법을 제시합니다. 마이크로타이터 플레이트에서 총 사이드로포어 생산의 정량적 추정 방법과 녹농균(P. aeruginosa)의 두 가지 사이드로포어(pyoverdine)와 피오쉐린(pyochelin)의 검출 및 정량 분석도 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>한천, 유형 I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-하이드록시퀴놀린</td><td>로바 케미</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>카사미노 산</td><td>SRL 화학 물질</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>머크</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>크롬 아제롤 설포네이트</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>포도당 일수화물</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>염화철 육수화물</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>유리 플라스크</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>유리 시험관</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King's 매체 B 베이스</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 최소 매체</td>염 <td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO UV 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>펩톤 유형 I, 세균학</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>파이프 유리 산</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>인산 이수소</td><td>칼륨 Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteose 펩톤</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu UV-Vis 분광 광도계</td><td>Shimadzu</td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

녹농균(pseudomonas aeruginosa)의 siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

녹농균(Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa)은 숙주에 감염을 일으키기 위해 다양한 독성 인자를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 siderophore 생산을 통한 철의 청소입니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 철분 킬레이트 친화도가 낮은 피오쉐린(pyochelin)과 철 킬레이트 친화도가 높은 피오베르딘(pyoverdine)의 두 가지 다른 siderophores를 생성합니다. 이 보고서는 피오베르딘은 박테리아 상층액에서 직접 정량화할 수 있는 반면, 피오쉐린은 정량화 전에 상층액에서 추출해야 함을 보여줍니다.
사이드로포어 생산을 정성적으로 분석하기 위한 기본 방법은 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) 한천 플레이트 분석입니다. 이 분석에서 Fe3+-Dye 복합체에서 CAS 염료가 방출되면 파란색에서 주황색으로 색상이 변경되어 siderophore 생성을 나타냅니다. 총 siderophore의 정량화를 위해 박테리아 상층액을 마이크로타이터 플레이트에서 CAS 염료와 동일한 비율로 혼합한 후 630nm에서 분광광도계 분석을 수행했습니다. Pyoverdine은 50mM Tris-HCl과 동일한 비율로 혼합하여 박테리아 상청액에서 직접 정량화 한 후 분광 광도 분석을 수행했습니다. 380nm에서의 피크는 pyoverdine의 존재를 확인했습니다. Pyochelin의 경우 박테리아 상청액에서 직접 정량화할 수 없었기 때문에 먼저 추출해야 했습니다. 후속 분광 광도계 분석은 313nm에서 피크를 가진 pyochelin의 존재를 밝혀 냈습니다.

임상 분리물에서 시데로포어를 정량화하기 전에, 시데로포어 생산을 보장하기 위해 시데로포어 생산에 대한 정성적 스크리닝을 수행했습니다. 임상 분리물에서 siderophore의 정성적 검출은 CAS 한천 플레이트의 줄무늬 박테리아에 의해 관찰되었습니다. 연구를 위해 MR1, TL7, J3, PAO1(참조 균주)과 함께 3개의 임상 분리물이 선택되었습니다. 세 가지 임상 분리물과 PAO1 모두 사이드로포어 생산에 대해 긍정적인 결과를 보였는데, 파란색 한천 표면의 박테리아 성장 주위에 있는 선명한 주황색 후광이 긍정적인 사이드로포어 생성을 나타냈습니다(그림 1). CAS 한천의 헤일로 형성(그림 1)은 임상 분리물에 의한 시데로포어 생산을 대략적으로 추정했습니다. 따라서, CAS 시약 및 액체 배지를 이용한 사이드로포어 생산의 정량적 추정을 수행하였다.
전체 siderophore 정량화는 cell-free 상층액에서 직접 수행되었습니다. 배양 후, 노란색이 Fe 복합체에서 CAS 염료가 제거되었음을 나타내는 색상 변화가 관찰되었습니다. 여기서, 접종되지 않은 성장 배지를 가진 CAS 염료를 대조군으로 사용하였고, 이를 siderophores 계산에 사용하였다. 분리물 MR1 및 TL7에서는 총 사이드로포어 생산에는 유의한 차이가 없었지만, PAO1에 비해 J3에서 유의한 총 사이드로포어 생산이 있었습니다(그림 2).
다음으로, pyoverdine 정량화는 cell-free 상층액으로부터 직접 수행하였다. 피오버다인은 세포 환경에서 방출되므로 무세포 상층액을 피오베르다인 정량화에 사용했습니다. 분광광도계에 의한 UV 범위 스캔도 수행되었으며, 380nm의 피크에서 피오버딘의 존재가 확인되었습니다(그림 3A). 분광 광도계 판독 값은 405nm에서 측정되었으며 결과는 OD405 / OD600nm 로 해석되었습니다. 모든 분리물은 피오버다인 생성을 보였는데, 분리물 MR1과 J3는 PAO1에 비해 현저히 낮은 피오버다인을 보인 반면, TL7에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 3B).
Pyochelin은 cell-free 상층액에서 직접 정량화할 수 없습니다. 1mL의 cell-free 상층액에서 pyochelin을 추출할 수 없었기 때문에 100mL의 cell-free 상층액에서 추출하였다. 1M 구연산으로 산성화시켰다. 피오쉐린은 매우 불안정한 화합물이기 때문에 추출 과정은 얼음 위에서 수행되었습니다. Pyochelin 검출은 300nm에서 600nm 범위의 UV 범위 스캔을 실행하여 수행되었으며, OD320nm 의 피크는 pyochelin의 존재를 확인했습니다(그림 4A). Pyochelin 정량화는 OD320nm 에서 분광광도계 판독값을 취하여 수행되었습니다. 계산은 OD320/OD600으로 나누어 이루어졌습니다. 분리물 MR1, TL7 및 J3는 참조 분리 PAO1에 비해 훨씬 더 높은 피오쉐린 생성을 보여주었습니다(그림 4B).
다양한 세균 성장 배지에서 시데로포어 생산을 비교하여 다양한 성장 배지에서 생산된 총 시데로포어의 양을 확인하였다. 루리아 육수, 킹스 B 배지 및 펩톤 워터를 3% 8-하이드록시퀴놀린으로 추출하고 추출하지 않은 루리아 육수를 연구를 위해 선택한 4가지 배지를 선택했습니다. 추출된 루리아 육수, King's B 배지 및 펩톤수 배지에서 사이드로포어 생산 간에는 유의한 차이가 없었던 반면, 추출되지 않은 루리아 배지에서의 사이드로포어 생산에 대해서는 유의한 차이가 관찰되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> 그림 1: CAS 한천의 Siderophore 생산. 24시간 성장한 배양물의 CAS 한천 플레이트에서 녹농균의 성장을 CAS 한천 플레이트에서 관찰하고 30°C에서 24시간 동안 배양하였다. Siderophore의 존재는 박테리아 콜로니(PAO1, MR1, TL7 및 J3) 주위에 주황색 후광으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> 그림 2: 총 siderophores 생산. PAO1 및 3개의 임상 분리물(MR1, TL7 및 J3)에 대해 총 siderophore 생산을 평가했습니다. 100 μL의 cell-free 상층액(펩톤수 브로스에서 24시간 동안 성장한 PAO1, MR1, TL7 및 J3)을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가한 후, 100μL의 CAS 염료를 첨가하였다. 통계적 유의성을 위해 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 검정을 수행하였다. 오차 막대± 세 가지 생물학적 반복 사이의 표준 편차(SD)를 나타냅니다. * p &lt; 0.05에 해당; ns는 p &gt; 0.05에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> 그림 3: Pyoverdine 생산. 녹농균 균주 PAO1 및 임상 분리물(MR1, TL7 및 J3)의 Pyoverdine 생산은 펩톤수 배지에서 24시간 동안 성장한 후 평가되었습니다. 박테리아 배양물을 원심분리하고, 100μL의 무세포 상층액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 100 μL의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가하였다. Pyoverdine 검출은 350nm에서 600nm 범위의 UV 분광 광도법에 의해 수행되었습니다. 380nm의 피오베르다인 생산(A)에서 분광 분석. 피오베르다인 생산량 정량화(B). 오차 막대는 세 가지 실험의 평균에 대한 표준 오차를 나타냅니다. 오차 막대는 세 가지 생물학적 복제 사이의 ± SD를 나타냅니다. 일원분산분석검정을 기준으로 p &lt; 0.0001에 해당하고, ** p &lt; 0.01에 해당하며, ns는 p &gt; 0.05에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> 그림 4: 피오쉐린 생산. 에틸 아세테이트 및 황산 마그네슘으로 추출한 PAO1(참조로 사용) 및 임상 분리물(MR1, TL7 및 J3)의 파이오쉐린 생산. 230 nm에서 400 nm (A) 범위의 분광 광도계 분석. 피오쉐린의 정량화(B). 각 분리체에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행했습니다. 오차 막대는 세 가지 생물학적 복제 사이의 ± SD를 나타냅니다. 일원분산분석검정을 기반으로 p &lt; 0.001에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 다양한 박테리아 성장 배지에서 시데로포어 생산 비교. King's B 배지, 펩톤 워터 배지 및 Luria 배지를 3% 8-하이드록시퀴놀린으로 추출하여 미량의 철을 제거하고 Luria 육수(추출되지 않음)를 선택한 4가지 다른 성장 배지에서 총 siderophore를 생산했습니다. 3% 8-히드록시퀴놀린에 의한 추출은 3% 8-히드록시퀴놀린을 배지에 균등한 부피로 첨가하여 수행하였다. 오차 막대는 세 가지 생물학적 복제 사이의 ± SD를 나타냅니다. **일원 분산 분석 검정을 기준으로 p &lt; 0.001에 해당하고, ns는 p &gt; 0.5에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 본 연구에 사용된 미디어 레시피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">파일을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Siderophores는 철과 복합체를 형성하고 철 제한 조건 동안 세포로 운반합니다. Siderophores는 숙주에서 심각한 감염을 확립하는 데 도움이 되는 강력한 독성 인자이며 녹농균의 정족수 감지를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 연구는 슈도모나스(Pseudomonas)의 사이드로포어 생산을 정량적으로 추정하는 것을 목표로 합니다.Siderophore는 세포 외 분자이므로 pyoverdine 및 pyochelin과 함께 총 siderophore는 cell-free 상층액을 사용하여 정량화됩니다. 피오쉐린은 소량으로 검출되지 않기 때문에 많은 양의 cell-free 상층액에서 추출합니다. 최근에는 피오쉐린의 정량화를 위해 LCMS와 바이오센서가 개발되고 있습니다.LCMS는 소규모 실험실을 위한 비용이 많이 드는 설정인 반면, 바이오센서는 파이오쉐린만 정량화할 수 있습니다. 이 간단한 예시 프로토콜은 최소한의 실험실 시약과 기기를 사용하며 더 적은 시간을 사용하여 cell-free 상층액에서 siderophore를 추정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

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박테리아는 산소와 철의 생체이용률이 다양한 숙주 조직에 서식하지만, 박테리아를 연구하는 대부분의 접근 방식은 공기가 풍부한 공기 매체를 사용합니다. 이 프로토콜은 다양한 철 농도와 산소 장력 하에서 인간 병원균 Yersinia pseudotuberculosis 를 배양하고 중요한 독성 인자인 Yersinia type III 분비 시스템의 활성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 Yersinia pseudotuberculosis Type III 분비 시스템 활동의 정량화

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녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

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