시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링
2006년 11월 8일
오늘은 정립 현미경(upright microscope)에서 이미징을 하기 위한 유동 챔버인 퓨전 챔버(fusion chamber)를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선 필름을 사용하여 두 개의 공간을 만듭니다. 이를 위해 파라필름(para film)을 작은 조각으로 자릅니다.
다음으로 저는 이 작업을 수행할 것인데, 이는 기본적으로 벽면을 위한 채널을 형성하게 되며, 경사진 공기로 이를 건조합니다. 파라핀 위에 커버 슬립을 덮고, 여기 완성된 모습이 있습니다. 그런 다음 히팅 블록에서 가열하여 파라핀을 녹이고 기본적으로 밀봉 상태를 만듭니다.
여기 보이는 것이 커버 글라스이며, 그 커버 글라스 위에 보시는 바와 같이 두 층의 phim이 놓여 있습니다. 그리고 그 위에 다시 22 by 22 mm 크기의 커버 슬립이 있습니다. 바로 이 부분을 phim에 밀착시켜 씰을 형성했습니다.
좋습니다. 액체는 이 방향으로 들어가고, 여기서는 여과지를 사용하여 이 방향으로 빨아낼 수 있습니다. 잠시 후에 그 방법을 보여드리겠습니다. 제가 선호하는 방식은 매우 간단한 가습 챔버에 넣는 것입니다.
두 종류의 높게 돋은 스트립을 준비하고 그 아래에 여과지를 둡니다. 그리고 내부를 밀폐하기 위해 플로우 챔버 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이제 챔버에 용액을 주입하는 방법은 피펫 팁을 챔버 입구에 대고 그대로 분주하는 것입니다.
이제 뚜껑을 닫은 채로 챔버를 10분 동안 배양합니다. 반대편에서 액체를 흡입하기 위해 제가 주로 사용하는 방법은 필터 페이퍼를 가져와 이렇게 얇은 띠 모양으로 자르는 것입니다. 이 얇은 띠 하나를 사용하여, 입구로 용액을 주입하는 동시에 출구에 필터 페이퍼를 대어 용액이 교체되며 흡수되도록 합니다.
용액을 통해 액체가 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 중간 폐쇄를 위해 5분 동안 기다립니다. 이제 실제로 액틴을 넣을 준비가 되었는데, 액틴은 유체 챔버 내부에서 중합시켜야 하며, 이는 이전과 동일한 절차로 진행합니다.
따라서 이런 식으로 액틴이 중합되었으므로, 이제 다량의 버퍼만을 사용하여 중합되지 않은 과잉 액틴을 모두 씻어냅니다. 여기에는 약 100 µL의 버퍼가 있으며, 이는 반응 챔버 부피의 몇 배에 해당하는 양입니다. 필터 페이퍼가 포화되면 흐름 방향을 바꿔주어야 합니다. 아시겠습니까?
이제 이를 이용해 이미징을 수행할 준비가 되었습니다. 액틴이 부착된 관류 챔버입니다. 이제 슬라이드를 가져와 현미경 아래에 장착하고, 오일 대물렌즈로 이미징할 예정이므로 커버글라스 상단 표면에 침전유를 도포하겠습니다. 이렇게 하면 내부에 액틴과 함께 용액이나 단백질 또는 기타 물질이 포함된 상태로 평가할 수 있습니다.
따라서 저는 타임랩스 이미징을 수행하는 동안 실제로 용액 측을 교체할 수 있습니다.
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개요
이 논문은 정립 현미경(upright microscope)에서 이미징을 하기 위한 유동 챔버(flow chamber) 및 융합 챔버(fusion chamber)의 제작 방법을 보여줍니다. 이 과정은 파라필름을 사용하여 채널을 만들고 열로 밀봉하는 과정을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
배경
- 유동 챔버(Flow chamber)는 다양한 이미징 기법에 필수적입니다.
- 융합 챔버를 제작하면 이미징 능력을 향상시킬 수 있습니다.
- 실험실 환경에서는 밀봉을 위해 파라필름(Parafilm)이 흔히 사용됩니다.
- 제작 과정을 이해하는 것은 해당 분야의 연구자들에게 매우 중요합니다.
연구 목적
- 유동 챔버(flow chamber) 제작을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.
- 이미징 챔버 제작 시 파라필름(parafilm)의 활용법을 설명합니다.
- 연구자들이 이미징 기법에 더 쉽게 접근할 수 있도록 지원합니다.
사용된 방법
- 채널 형성을 위해 파라필름을 조각으로 자릅니다.
- 기울인 공기 흐름으로 조각들을 건조시킵니다.
- 파라필름 위에 커버슬립을 배치합니다.
- 밀봉을 만들기 위해 히트 블록 위에서 조립체를 가열합니다.
주요 결과
- 기능적인 유동 챔버가 성공적으로 제작되었습니다.
- 밀봉 과정은 이미징을 위한 안정적인 환경을 조성하는 데 효과적이었습니다.
- 시연된 방법은 실험실 사용을 위해 재현 가능합니다.
- 연구자들은 이 기술을 다양한 이미징 응용 분야에 활용할 수 있습니다.
결론
- 유동 및 융합 챔버의 제작은 간단합니다.
- 이 방법은 고급 이미징 연구를 촉진할 수 있습니다.
- 이러한 기술에 대한 접근성은 연구 결과를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 살아있는 세포 이미징을 위한 제어된 미세환경을 재현성 있게 준비할 수 있게 하여, 세포골격 역학의 기전 연구를 지원합니다. 유동 챔버 조립을 표준화함으로써 관류 기반 분석의 변동성을 줄여, 연구 팀 간의 데이터 일관성을 향상시킵니다. 이 방법은 종양학 및 면역학의 타겟 검증과 관련된 세포 이동 및 신호 전달의 핵심 과정인 액틴 분해 역학의 정량적 분석을 용이하게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 액틴 탈중합 역학을 직접 관찰함으로써 세포골격 재구성 조절 인자를 조사할 수 있게 합니다.
- 운용적 가치: 살아있는 세포 내 액틴 턴오버에 미치는 화합물의 효과를 테스트하기 위한 표준화된 플랫폼을 제공합니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 과학적 가치: 기능적 분석 종점으로서 액틴 분해 속도를 측정하기 위한 형광 기반 판독법 개발을 지원합니다.
- 운용적 가치: 타임랩스 이미징 중에 용액 교체가 가능하여 관류 조건에서의 용량-반응 관계를 평가할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 액틴 동역학을 전이, 침습 및 면역 시냅스 형성과 관련된 세포 표현형과 연결합니다.
- 운용적 가치: 정량화 가능한 이미징 바이오마커를 사용하여 경로 억제제에 대한 전임상 평가를 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 결합 스크리닝부터 질환 관련 세포 시스템에서의 기능적 검증에 이르는 발견 연속체에 부합합니다.
- 발견 생물학: 액틴 flux의 실시간 시각화를 통해 세포골격 조절 인자의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 제어된 관류 조건 하에서 액틴 분해에 대한 정량적이고 재현 가능한 측정값을 제공합니다.
- 분석: 액틴 턴오버의 역학 모델링을 가능하게 하는 시간 분해 형광 강도 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: 세포 이동의 전임상 모델에서 분자 기전과 세포 표현형을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 세포골격 표적 및 세포 유형에 적용 가능한 재사용 가능한 관류 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 직접적인 기능적 판독을 통해 액틴 조절에 관여하는 타겟의 기전적 리스크를 감소시킵니다.
- 운영적 가치: 표준화된 챔버 준비 과정을 통해 여러 사이트와 작업자 간의 분석 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 타겟 조절을 기능적 세포골격 결과와 연결함으로써 더 빠른 go/no-go 결정을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 세포 이동성 및 침습 표현형에 미치는 영향을 기반으로 화합물의 리스크 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 생세포 이미징 및 미세유체 흐름 제어에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 환경 제어 및 관류 기능이 갖춰진 정립 현미경의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 챔버 간 일관성을 위해 파라필름 두께와 밀봉 파라미터의 표준화가 필요합니다.
- 다른 세포 유형에 적용할 경우 표면 코팅 및 액틴 중합 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 프로토콜에 명시된 바와 같이, 장시간 관류 동안 세포에 미칠 수 있는 전단 응력의 영향이 포함됩니다.
