Name: 시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 배우세요 정립 현미경용 유동 챔버와 퓨전 챔버를 파라필름과 커버슬립으로 제작하는 방법을. 열 블록으로 밀봉하여 안정적인 이미징 환경을 구축하고 신경과학 및 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li> 로 비디오에 나타난 흐름 챔버를 구성. parafilm 밀봉이 꽉 있는지 확인하고 세탁 coverslips을 사용합니다. </li><li> 50-10 &#39;에 대한 챔버에 품어 굴지 바인딩 요원. </li><li> 차단 단백질과 유리 coverslip에 비 특정 바인딩 사이트를 차단합니다. </li><li> 버퍼 polymerizing에서 G - 굴지 흐르는하여 챔버 내부의 중합 굴지. </li><li> 초과 버퍼 흐르는으로 희미 unpolymerized의 굴지. </li></ol>

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

오늘은 정립 현미경(upright microscope)에서 이미징을 하기 위한 유동 챔버인 퓨전 챔버(fusion chamber)를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선 필름을 사용하여 두 개의 공간을 만듭니다. 이를 위해 파라필름(para film)을 작은 조각으로 자릅니다.다음으로 저는 이 작업을 수행할 것인데, 이는 기본적으로 벽면을 위한 채널을 형성하게 되며, 경사진 공기로 이를 건조합니다. 파라핀 위에 커버 슬립을 덮고, 여기 완성된 모습이 있습니다. 그런 다음 히팅 블록에서 가열하여 파라핀을 녹이고 기본적으로 밀봉 상태를 만듭니다.여기 보이는 것이 커버 글라스이며, 그 커버 글라스 위에 보시는 바와 같이 두 층의 phim이 놓여 있습니다. 그리고 그 위에 다시 22 by 22 mm 크기의 커버 슬립이 있습니다. 바로 이 부분을 phim에 밀착시켜 씰을 형성했습니다.좋습니다. 액체는 이 방향으로 들어가고, 여기서는 여과지를 사용하여 이 방향으로 빨아낼 수 있습니다. 잠시 후에 그 방법을 보여드리겠습니다. 제가 선호하는 방식은 매우 간단한 가습 챔버에 넣는 것입니다.두 종류의 높게 돋은 스트립을 준비하고 그 아래에 여과지를 둡니다. 그리고 내부를 밀폐하기 위해 플로우 챔버 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이제 챔버에 용액을 주입하는 방법은 피펫 팁을 챔버 입구에 대고 그대로 분주하는 것입니다.이제 뚜껑을 닫은 채로 챔버를 10분 동안 배양합니다. 반대편에서 액체를 흡입하기 위해 제가 주로 사용하는 방법은 필터 페이퍼를 가져와 이렇게 얇은 띠 모양으로 자르는 것입니다. 이 얇은 띠 하나를 사용하여, 입구로 용액을 주입하는 동시에 출구에 필터 페이퍼를 대어 용액이 교체되며 흡수되도록 합니다.용액을 통해 액체가 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 중간 폐쇄를 위해 5분 동안 기다립니다. 이제 실제로 액틴을 넣을 준비가 되었는데, 액틴은 유체 챔버 내부에서 중합시켜야 하며, 이는 이전과 동일한 절차로 진행합니다.따라서 이런 식으로 액틴이 중합되었으므로, 이제 다량의 버퍼만을 사용하여 중합되지 않은 과잉 액틴을 모두 씻어냅니다. 여기에는 약 100 µL의 버퍼가 있으며, 이는 반응 챔버 부피의 몇 배에 해당하는 양입니다. 필터 페이퍼가 포화되면 흐름 방향을 바꿔주어야 합니다. 아시겠습니까?이제 이를 이용해 이미징을 수행할 준비가 되었습니다. 액틴이 부착된 관류 챔버입니다. 이제 슬라이드를 가져와 현미경 아래에 장착하고, 오일 대물렌즈로 이미징할 예정이므로 커버글라스 상단 표면에 침전유를 도포하겠습니다. 이렇게 하면 내부에 액틴과 함께 용액이나 단백질 또는 기타 물질이 포함된 상태로 평가할 수 있습니다.따라서 저는 타임랩스 이미징을 수행하는 동안 실제로 용액 측을 교체할 수 있습니다.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

배우세요 정립 현미경용 유동 챔버와 퓨전 챔버를 파라필름과 커버슬립으로 제작하는 방법을. 열 블록으로 밀봉하여 안정적인 이미징 환경을 구축하고 신경과학 및 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

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