시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링
November 8th, 2006
자, 오늘 제가 해드리고자 하는 것은 정립 현미경에서 이미징하기 위한 융합 챔버인 플로우 챔버(flow chamber)를 구성하는 방법을 보여드리는 것입니다. 그런 다음 필름을 사용하여 두 개의 공간을 만듭니다. 그래서 제가 하는 일은 파라 필름을 작은 스트립으로 자르
는 것입니다.다음으로 저는 기본적으로 벽의 채널을 형성하고 기울어진 공기로 건조시킬 것입니다. 나는 파라 위에 커버 슬립을 씌웠고, 여기에 완성품이 있습니다. 그런 다음 열 블록에서 가열하여 param을 녹이고 기본적으로 seal을 만듭니다.
이것이 무엇인지는 여기 커버 유리이고, 커버 유리 위에는 바로 여기 보시는 것처럼 두 겹의 핌이 있습니다. 그리고 이것 위에, 다시, 22 x 2 2 mil 미터 커버 슬립이 있습니다. 바로 여기 이것, 내가 인장을 떨어뜨리기 위해 param을 눌렀습니다.
자, 액체가 여기 한 방향으로 들어가고 여기 여과지로 이 방향으로 빨아들일 수 있습니다. 그리고 그 방법을 조금 후에 보여드리겠습니다. 그래서 제가 좋아하는 것은 가습실에 넣는 것을 좋아하는데, 이는 매우 간단합니다.
두 종류의 높은 스트립을 가져 와서 아래에 종이 필터를 넣으십시오. 그리고 시끄러운 소리를 유지하기 위해 나는 덮개를 씌우고 흐름 챔버의 덮개 슬립을 씌웠습니다. 이제 챔버에 솔루션을 도입하는 방법은 챔버 입구에 피펫 팁을 놓고 분리하는 것입니다.
이제 내가 하는 일은 뚜껑을 닫고 10분 동안 챔버를 배양하는 것입니다. 반대편에서 액체를 빨아들이기 위해 내가 평소에 하는 일은 그것을 사용하고 여과지를 가져와 이렇게 얇은 스트립으로 자르는 것입니다. 그리고 저는 이 얇은 스트립 중 하나를 가져와서 입구에 용액을 바르는 동시에 여과지를 출구에 놓아 교환물, 용액을 빨아들입니다.
따라서 액체가 용액을 통해 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 중간 마감을 위해 5분 동안 기다립니다. 이제 제가 할 수 있는 일은 액틴과 액틴을 실제로 중합해야 하고, 유동 챔버 내부에서 중합을 하는 것인데, 이는 이전과 동일한 절차입니다.
그래서 이렇게 하고 나서 이제 작용이 중합되었기 때문에 많은 양의 버퍼를 사용하여 모든 un excess un polymerized action을 씻어냅니다. 여기 약 100마이크로리터가 있고 몇 개의 반응 챔버 부피에 해당하는 완충액입니다. 그냥, 아시다시피, 여과지가 포화 상태가 되면 방향을 바꿔야 합니다. 그래?
그래서 저는 이것으로 이미징을 할 준비가 되었습니다. 그래서 액틴이 부착 된 관류 챔버. 이제 슬라이드를 가져와서 현미경 아래에 장착하고 오일 대물렌즈로 이미징하고 있기 때문에 덮개의 상단 표면에 침지 오일을 바르고 잔디 접촉을 하여 용액이나 단백질 또는 내부에서 작용하는 모든 것을 평가할 것입니다.
그래서 제가 하는 일은 타임랩스 이미징을 하는 동안 실제로 솔루션 측면을 교환할 수 있다는 것입니다. 이와 같이.
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개요
이 기사는 수직 현미경으로 이미징을 위한 플로우 챔버 및 퓨전 챔버의 구성을 시연합니다. 이 과정은 파라필름을 사용하여 채널을 만들고 열로 밀봉하는 과정을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
배경
- 플로우 챔버는 다양한 이미징 기법에 필수적입니다.
- 퓨전 챔버를 구성하면 이미징 기능을 향상시킬 수 있습니다.
- 파라필름은 실험실 환경에서 밀봉을 만드는 데 일반적으로 사용됩니다.
- 구성 과정을 이해하는 것은 해당 분야의 연구자에게 매우 중요합니다.
연구 목적
- 플로우 챔버를 구성하는 단계별 가이드를 제공합니다.
- 이미징 챔버를 만드는 데 파라필름을 사용하는 방법을 설명합니다.
- 연구자들이 이미징 기법을 더 쉽게 이용할 수 있도록 합니다.
사용된 방법
- 파라필름을 잘라서 채널을 형성합니다.
- 기울인 공기로 스트립을 건조합니다.
- 파라필름 위에 커버 슬립을 놓습니다.
- 히트 블록에서 어셈블리를 가열하여 밀봉합니다.
주요 결과
- 기능적인 플로우 챔버가 성공적으로 구성되었습니다.
- 밀봉 과정은 이미징을 위한 안정적인 환경을 만드는 데 효과적이었습니다.
- 소개된 방법은 실험실 사용을 위해 재현 가능합니다.
- 연구자들은 이 기법을 다양한 이미징 응용 분야에 활용할 수 있습니다.
결론
- 플로우 및 퓨전 챔버의 구성은 간단합니다.
- 이 방법은 고급 이미징 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
- 이러한 기법에 대한 접근성은 연구 결과를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
