Name: Smart Leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 극저온 전자 현미경 다중 그리드 스크리닝을 Smart Leginon으로 자동화하는 방법을. 이 프로토콜은 Ptolemy 이미지 처리와 머신러닝을 활용하여 수동 선별 시간을 크게 단축하고 연구자들이 샘플 조건을 병렬로 최적화할 수 있게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업 중 일부는 Simons Foundation(SF349247), NIH(U24 GM129539) 및 NY State Assembly의 지원을 받아 New York Structural Biology Center의 Simons Electron Microscopy Center에서 수행되었습니다.

Smart Leginon Autoscreen을 사용한 고분자 구조 분석 가속화

<ol><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+optimization+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid optimization for membrane proteins.</a> iScience. 24 (3), 102139(2021).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+collection+of+high-resolution+cryo-EM+datasets+using+200+KV+transmission+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 181, 63519(2022).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+multi-grid+cryoEM+screening+using+Smart+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon.</a> IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).</li>
<li>Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+automate+cryo-electron+microscopy+data+collection+with+Ptolemy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy.</a> IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+data+collection+for+CryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Smart data collection for CryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).</li>
<li>Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+systematic+evaluation+of+cryo-EM+specimens+with+SmartScope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope.</a> eLife. 11, e80047(2022).</li>
<li>Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+Getting+Intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA Getting Intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).</li>
<li>Fan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoRL%3A+Reinforcement+learning+enables+efficient+cryo-EM+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection.</a> arXiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+path+planning+surpasses+human+efficiency+in+cryo-EM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging.</a> bioRxiv. Biophysics. , (2022).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li>
<li>Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+seeing+molecules+in+cells%2C+CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%22%5BJournal%5D)">The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop.</a> CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopic+grid+preparation+for+time-resolved+studies+using+a+novel+robotic+system%2C+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.</a> Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).</li>
<li>Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+a+paradigm+shift+in+CryoEM+sample+preparation+with+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜에서는 Smart Leginon Autoscreen의 파이프라인과 수집 소프트웨어를 처음 접하는 사용자를 위한 기본 Leginon 사용법에 대해 설명합니다. 단일 입자 CryoEM은 2024년 말까지 가장 생산적인 3차원(3D) 단백질 구조 분해 기술이 될 것으로 예상됩니다17. 단일 입자 CryoEM 파이프라인은 데이터 품질과 처리량을 높이기 위해 지속적으로 최적화되는 여러 단계로 구성됩니다. 그림 2 는 가장 일반적인 단계(시료 전처리, 그리드 준비, 스크리닝 시간 및 노력, 고분해능 수집 시간, 라이브 프로세싱 및 전체 후처리)와 함께 개선할 수 있는 파이프라인의 다른 구성 요소(스크리닝 현미경 액세스, 스테이지 속도 및 정확도, 카메라 속도 및 고해상도 현미경 액세스)를 보여줍니다. 대부분의 단계에서 얻은 결과는 이전 단계( 그림 2의 파란색 화살표)에 대한 피드백 루프가 되어 전체 파이프라인이 상호 의존성이 높아집니다. 그림 2 의 각 단계는 다른 단계에 비해 병목 현상이 얼마나 발생하는지 대략적으로 나타내기 위해 색상이 지정되어 있습니다. Smart Leginon Autoscreen은 12개의 그리드를 스크리닝하는 데 드는 작업자의 시간과 노력을 6시간에서 10분 미만으로 크게 줄여 병목 현상을 완화하고 샘플/그리드 준비에 대한 보다 신속한 피드백을 제공합니다(그림 3).
그림 1에 나와 있는 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 템플릿 세션을 만드는 데 사용되는 그리드는 스크리닝할 나머지 그리드를 대표하는 것이 중요합니다. 중요한 것은 Legnon이 템플릿 세션을 생성하기 위한 전체 설정 프로세스의 모든 설정(그림 1의 파란색 단계)을 기억하여 매번 반복되는 템플릿 세션을 더 빠르게 설정할 수 있다는 것입니다. 템플릿 세션을 만들 때 가장 중요한 단계는 매개변수와 임계값이 스크리닝할 그리드에서 예상되는 변형을 반영하도록 모든 배율에서 타겟팅을 설정하는 것입니다. 다양한 '테스트' 버튼을 사용하면 이 설정 프로세스의 효율성을 높일 수 있습니다. Autoscreen 세션 중에 Appion의 처음 몇 개의 그리드를 모니터링하여 문제를 신속하게 감지하고 가능한 한 빨리 Leginon 내부에서 수정하는 것이 중요합니다.
SEMC의 일반적인 워크플로우는 Autoscreen 데이터를 CryoSPARC Live18 에 공급하고 이 추가 정보를 사용하여 피드백 루프를 샘플/그리드 준비에 알리는 것입니다. 집중적인 연구자-운영자 CryoEM 최적화 기간 동안 Autoscreen이 그리드를 스크리닝하는 동안 샘플 및 그리드 조건에 대한 정보가 샘플 및 그리드 준비에 피드백됩니다. 이를 통해 일주일에 수십 개의 그리드를 동결하고 스크리닝할 수 있습니다8.
Smart Leginon Autoscreen은 SEMC에서 관찰된 구멍이 뚫린 그리드 및 조건의 대부분(80%-90%)에서 작동합니다. 나머지 10%-20%의 그리드에는 때때로 잘 작동하지 않는 그리드(구멍과 기판 사이의 대비 차이가 최소화된 그리드)가 포함됩니다. 더 작은 구멍과 간격(예: 0.6/0.8)이 있는 그리드 및 여러 그리드에 걸쳐 타겟팅하는 것이 종종 비실용적인 그리드 - 그리드를 가로지르는 샘플 줄무늬로 구성된 Spotiton/Chameleon19,20 그리드; 레이시 그리드. Autoscreen을 사용하는 기울어진 그리드 컬렉션은 개발 중이지만 아직 사용할 수 없습니다. 먼저 스트라이프의 영역을 수동으로 이미징하여 좁은 매개변수 임계값을 결정한 다음 2.1.7.4단계에서 각각 더 큰 사각형과 더 작은 사각형을 함께 그룹화한 다음 얼음이 있는 그룹에서 대상을 선택하여 Spotiton/Chameleon 그리드와 함께 작동하도록 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이 수정의 목표는 Smart Leginon이 빈 사각형과 비어 있지 않은 사각형을 두 그룹으로 분리하도록 하는 것입니다. 매개변수가 발견되면 스크리닝할 나머지 그리드로 잘 확장되지 않을 수 있습니다. 2.1.9.1단계에서 hl_finding.sh 스크립트를 제거하고 원하는 대로 밝은/어두운 영역을 대상으로 하는 매개변수를 구성하여 레이스 그리드와 함께 작동하도록 프로토콜을 수정할 수도 있습니다. 이 수정의 성공률은 얼음 두께와 그리드 재료에 따라 그리드마다 다를 수 있습니다.
Autoscreen 세션 중 문제 해결이 가능하며 경우에 따라 적절합니다. 사전 설정(예: 디포커스) 및 타겟팅 매개변수(예: 구멍 타겟팅 임계값)에 대한 변경은 자동 수집 중에 수행할 수 있습니다. Autoscreen 세션이 수집되는 동안에는 그리드 세션이 종료되므로 취소할 수 autoscreen.py. 그러나 타깃팅 노드의 중단 버튼을 사용하여 그리드의 일부 또는 전체 그리드를 건너뛸 수 있습니다. 경우에 따라 autoscreen.py 메모리를 너무 많이 사용하고 정지되어 '강제 종료' 또는 '대기'의 두 가지 옵션을 제공할 수 있습니다. '강제 종료'를 선택하면 전체 스크립트가 종료되고 사용자가 스크리닝을 위해 나머지 그리드에 적용할 스크립트를 다시 실행해야 합니다. 'wait'를 선택하면 스크립트가 계속되며, 노출 노드에서 이미지 표시를 끄거나, 아틀라스에서 픽셀 크기를 줄이거나, 메모리 지우기 스크립트를 실행하는 등 향후 정지를 방지하기 위해 설정을 변경할 수 있습니다. 두 가지 옵션을 제공하지 않고 프로그램이 멈추면 메모리 오류가 저절로 해결되지 않아 수집이 일시 중지될 수 있습니다. 이 경우 '강제 종료' 옵션이 유용할 수 있습니다.
Smart Leginon Autoscreen은 SEMC에서 정기적으로 사용됩니다. 단일 입자 CryoEM 파이프라인의 병목 현상이 계속 감소함에 따라 생물학적 질문에 답하기 위해 CryoEM 채택이 계속 증가할 것입니다. 이 프로토콜은 피드백 루프를 크게 줄일 수 있는 명확한 경로를 제공하여 전체 파이프라인을 최적화하는 방향으로 나아가는 단계입니다.

단일 입자 초저온 전자 현미경(cryoEM)을 사용하면 정제된 고분자 복합체의 거의 원자 분해능 구조를 측정할 수 있습니다. 단일 입자 cryoEM 실험에는 다양한 시료 및 그리드 조건을 가진 훨씬 더 큰 그리드 세트에서 잘 선택된 하나 또는 두 개의 그리드만 있으면 됩니다. 이러한 그리드를 검사하기 위한 현미경 스크리닝은 얼음 두께, 전체 데이터 수집을 위한 충분한 면적, 단백질 순도, 단백질 농도, 단백질 안정성 및 최소 선호 방향 문제 등 고해상도 데이터 수집을 위한 대부분의 주요 요구 사항을 충족하는 그리드를 결정하기 위해 각 그리드를 여러 배율로 이미징하는 것을 수반합니다1. 이러한 주요 요구 사항에 대한 최적화에는 현미경 스크리닝과 단백질 생산, 완충액 선택, 잠재적 세제 및 그리드 유형 2,3,4와 같은 준비 조건 간의 피드백이 수반되는 경우가 많습니다(그림 1). 기존의 그리드 스크리닝은 Leginon5, SerialEM6 및 EPU7과 같은 소프트웨어를 사용하여 수동 또는 반수동으로 수행됩니다. 기존의 스크리닝은 현미경 작업자가 여러 그리드를 스크리닝하기 위해 현미경 앞에서 몇 시간을 소비해야 하며, 이는 샘플/그리드 최적화가 아닌 기계적인 작업으로 작업자를 점유하여 고분해능 단일 입자 워크플로우에서 상당한 병목 현상을 일으킵니다.
이전에는 Smart Leginon Autoscreen과 기본 기계 학습 소프트웨어인 Ptolemy가 소개되었으며 기본 방법 및 알고리즘이 예제와 함께설명되었습니다 8,9. SmartScope11, Smart EPU12 및 CryoRL13,14를 포함한 여러 다른 소프트웨어 패키지가 완전 자동화된 다중 그리드 스크리닝(10)을 수행할 수 있거나 이를 위해 작동하고 있습니다. 스크리닝 병목 현상을 해결하기 위해 Smart Leginon을 사용하면 사용자가 먼저 템플릿 현미경 세션에서 스크리닝 파라미터를 설정한 다음 해당 템플릿 세션의 파라미터를 템플릿으로 사용하여 현미경 오토로더에서 그리드의 전체 카세트를 스크리닝할 수 있습니다. 카세트 스크리닝 중 모든 수동 작업이 제거되어 최적화 피드백 루프가 훨씬 더 효율적으로 진행될 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 리더가 완전히 자동화된 다중 그리드 CryoEM 스크리닝을 독립적으로 수행할 수 있도록 전체 Smart Leginon Autoscreen 워크플로우를 설명합니다. 레지논을 처음 접하는 분들을 위해 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 기존의 레지논 사용법을 설명합니다. 이 지식은 여러 오토로더 현미경에 대한 수년간의 경험으로 구성되며, 프로토콜의 후속 Smart Leginon 섹션에서 구축됩니다. 추가 튜토리얼 비디오는 https://memc.nysbc.org 에서 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Glacios cryoTEM&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>GLACIOSTEM</td><td>FEG, 200keV, Falcon 3EC 카메라&nbsp;</td></tr><tr><td>Krios cryoTEM&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>KRIOSG4TEM</td><td>XFEG, 300keV,&nbsp; Gatan BioQuantum 에너지 필터, Gatan K3 카메라&nbsp;</td></tr><tr><td>레기논&nbsp;</td><td>시몬스 전자 현미경 센터&nbsp;</td><td></td><td>http://leginon.org&nbsp; (영문)</td></tr><tr><td>프톨레마이오스&nbsp;</td><td>Simons 머신 러닝 센터&nbsp;</td><td></td><td>https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

smart leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

지난 10년 동안 초저온 전자 현미경(cryoEM) 기술의 발전으로 구조 생물학자들은 일상적으로 고분자 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 분해할 수 있게 되었습니다. 전체 CryoEM 파이프라인의 일반적인 워크플로우에는 고분해능 데이터 수집으로 이동하기 전에 시료 전처리, CryoEM 그리드 전처리 및 시료/그리드 스크리닝 간의 반복이 포함됩니다. 모든 반복 실험은 시료 농도, 완충액 조건, 격자 물질, 격자 구멍 크기, 얼음 두께 및 얼음 내 단백질 입자 거동 등을 최적화해야 하기 때문에 시료/그리드 준비와 스크리닝 사이의 반복은 일반적으로 연구자에게 주요 병목 현상입니다. 또한, 이러한 변수가 만족스럽게 결정되면 동일한 조건에서 준비된 그리드는 데이터 수집 준비 여부에 따라 크게 다르므로 고해상도 데이터 수집을 위한 최적의 그리드를 선택하기 전에 추가 스크리닝 세션을 권장합니다. 이 샘플/그리드 준비 및 스크리닝 프로세스에는 종종 수십 개의 그리드와 현미경 작업 시간이 며칠씩 소요됩니다. 또한 스크리닝 프로세스는 작업자/현미경 가용성 및 현미경 접근성으로 제한됩니다. 여기에서는 Leginon 및 Smart Leginon Autoscreen을 사용하여 대부분의 CryoEM 그리드 스크리닝을 자동화하는 방법을 보여줍니다. Autoscreen은 머신 러닝, 컴퓨터 비전 알고리즘 및 현미경 처리 알고리즘을 결합하여 지속적인 수동 작업자 입력이 필요하지 않습니다. Autoscreen은 자동 표본 교환 카세트 시스템을 사용하여 다중 스케일 이미징으로 그리드를 자율적으로 로드하고 이미지 할 수 있으므로 전체 카세트에 대한 무인 그리드 스크리닝이 가능합니다. 결과적으로, 12개의 그리드를 스크리닝하는 작업자 시간은 그리드 간의 높은 변동성을 설명할 수 없기 때문에 방해를 받는 이전 방법을 사용하는 ~10시간에 비해 Autoscreen을 사용하면 ~6분으로 단축될 수 있습니다. 이 프로토콜은 먼저 기본 Leginon 설정 및 기능을 소개한 다음 템플릿 세션 생성부터 12그리드 자동 스크리닝 세션 종료까지 Autoscreen 기능을 단계별로 시연합니다.

프로토콜에 따라 CryoEM 스크리닝 세션은 구멍이 있는 그리드 및 조건의 대부분(80%-90%)에 대해 자동으로 성공적으로 실행될 수 있습니다. 성공적인 Smart Leginon Autoscreen 세션의 예상 결과를 보여주기 위해 이전에몇 가지 예와 실험이 8,9 제시되었습니다. 성공적인 자동 스크린 세션은 ~10분의 설정으로 시작되며 일반적으로 약 6시간(그리드당 30분) 후에 12개의 그리드로 구성된 전체 카세트가 자동으로 스크리닝되며, 여기서 다양한 크기의 3-5개의 정사각형과 정사각형당 3-5개의 구멍이 고배율로 이미지화되어 사용자가 각 그리드에서 샘플의 특성을 빠르게 결정하고 샘플/그리드 조건을 빠르게 반복할 수 있습니다(그림 3). 간혹 세션이 실패하는 경우가 있는데, 이는 일반적으로 깨진 사각형을 대상으로 하는 자동 스크린, 그리드 또는 사각형 전체의 큰 얼음 두께 기울기를 제대로 해석하지 못하거나 탄소 그리드의 구멍을 제대로 식별하지 못하기 때문입니다. 또한 잠재적인 메모리 누수로 인해 과도한 메모리 사용으로 인해 Legnon이 충돌할 수 있으며, 이는 RAM을 확보하거나 컴퓨터를 재부팅하여 해결하거나 컴퓨터에 더 많은 RAM을 추가하여 개선할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig01.jpg"> 그림 1: Smart Leginon Autoscreen 워크플로우. Smart Leginon Autoscreen 워크플로우에 대한 개략적인 개요입니다. 먼저, 스크리닝할 그리드의 배치에서 대표 그리드에 대한 매개변수를 선택하여 템플릿 세션을 생성합니다. Leginon을 설정하고 템플릿 세션을 만드는 데 45분도 채 걸리지 않습니다. 둘째, Autoscreen은 템플릿 세션 매개변수를 사용하여 카세트의 모든 그리드를 스크리닝하도록 설정됩니다. 자동 화면 설정은 10분도 채 걸리지 않습니다. 마지막으로 자동 스크린은 스크리닝 세션을 종료합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig02.jpg"> 그림 2: 자동 스크리닝 전의 기존 단일 입자 CryoEM 파이프라인. 자동 스크리닝 전 기존 단일 입자 CryoEM 파이프라인에서 가장 일반적인 단계와 개선할 수 있는 구성 요소. 각 단계는 다른 단계에 비해 병목 현상이 얼마나 발생하는지 대략적으로 나타내기 위해 색상이 지정됩니다. 파란색 원형 화살표는 대부분의 단계 사이에 있는 여러 피드백 루프를 나타냅니다. 여러 단계에서의 처리량은 샘플, 자금 조달 및 연구자의 위치에 따라 크게 달라집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig03.jpg"> 그림 3: 대표적인 Smart Leginon Autoscreen 결과. BioQuantum 에너지 필터와 K3 카메라를 사용하여 TFS Krios cryoTEM에서 수집된 Smart Leginon Autoscreen 프로토콜을 따르는 대표적인 멀티 스케일 이미지. (A) CryoEM 그리드의 개요를 보여주는 복합 '아틀라스' 이미지. (비에프) 그리드 아틀라스에 표시된 위치의 다중 축척 이미지. 첫 번째 줄의 저배율 이미지, 두 번째 줄의 중간 배율 이미지 및 세 번째 줄의 고배율 이미지를 각각 자동으로 선택하여 얇은 얼음 사각형에서 두꺼운 얼음 사각형까지 샘플에 대한 정보를 얻었습니다. Leginon이 추정한 얼음 두께는 바닥에 나와 있습니다. 스케일 바는 첫 번째 행의 경우 500 μm, 첫 번째 행의 경우 10 μm, 두 번째 행의 경우 5 μm, 세 번째 행의 경우 (B-F)의 경우 100 nm입니다. 이 그림은 Cheng et al.8의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: 그리드</td>
			<td>sq: 정사각형</td>
			<td>hln: 구멍</td>
			<td>팬: 자동 초점</td>
			<td>fcn: 중앙 초점</td>
			<td>enn: 노출 </td>
		</tr><tr><td>확대</td>
			<td>210</td>
			<td>2600</td>
			<td>6700</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
		</tr><tr><td>디포커스</td>
			<td>-0.0002</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
			<td>ᆞ 7 배 10-07 </td>
			<td>ᆞ 2.5 배 10-06 </td>
		</tr><tr><td>스폿 크기</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>강렬</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.83</td>
			<td>0.65</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.45</td>
		</tr><tr><td>차원 </td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>4096 엑스 4096</td>
		</tr><tr><td>오프셋</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>512, 512</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>비닝(Binning)</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>2 엑스 2</td>
			<td>1 엑스 1</td>
		</tr><tr><td>노출 시간(ms)</td>
			<td>200</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>사전 노출 (들)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>복용량(e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>36.5</td>
			<td>36.5</td>
			<td>64.7</td>
		</tr><tr><td>원시 프레임 저장</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Falcon 3EC 카메라와 함께 Glacios cryoTEM을 사용한 Simons Electron Microscopy Center(SEMC)의 cryoEM 그리드 스크리닝을 위한 사전 설정 매개변수. SEMC에서 Falcon 3EC 카메라가 있는 Glacios cryoTEM에서 일반적으로 사용되는 각 사전 설정에 대한 매개변수가 표시됩니다. 현미경마다 사용 가능한 배율이 다르며 실험마다 초점 흐림 및 노출 시간과 같은 다양한 매개변수를 사용합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: 그리드</td>
			<td>sq: 정사각형</td>
			<td>hln: 구멍</td>
			<td>팬: 자동 초점</td>
			<td>fcn: 중앙 초점</td>
			<td>enn: 노출 </td>
		</tr><tr><td>확대</td>
			<td>64</td>
			<td>1700</td>
			<td>2850</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
		</tr><tr><td>디포커스</td>
			<td>0</td>
			<td>ᆞ 5 배 10-05 </td>
			<td>ᆞ 5 배 10-05 </td>
			<td>-1 × 10-06 </td>
			<td>ᆞ 7 배 10-07 </td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
		</tr><tr><td>스폿 크기</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>강렬</td>
			<td>0.001</td>
			<td>1.65 엑스 10-05 </td>
			<td>1.5 엑스 10-05 </td>
			<td>4.3 엑스 10-07 </td>
			<td>4.3 엑스 10-07 </td>
			<td>5.5 엑스 10-07 </td>
		</tr><tr><td>에너지 필터 폭</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>차원</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>2048년 x 2048년</td>
			<td>4096 엑스 4096</td>
		</tr><tr><td>오프셋</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>비닝(Binning) </td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>2 엑스 2</td>
			<td>1 엑스 1</td>
		</tr><tr><td>노출 시간(ms)</td>
			<td>500</td>
			<td>2000</td>
			<td>1000</td>
			<td>500</td>
			<td>300</td>
			<td>8700</td>
		</tr><tr><td>사전 노출 (들)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>복용량(e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>47.4</td>
		</tr><tr><td>원시 프레임 저장</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr></tbody></table>표 2: Selectris X 및 Falcon 4i 카메라와 함께 Krios cryoTEM을 사용하여 SEMC에서 cryoEM 그리드 스크리닝을 위한 사전 설정 매개변수. SEMC에서 Selectris X 에너지 필터 및 Falcon 4i 카메라가 있는 Krios에서 일반적으로 사용되는 각 사전 설정에 대한 매개변수가 표시됩니다. 현미경마다 사용 가능한 배율이 다르며 실험마다 초점 흐림 및 노출 시간과 같은 다양한 매개변수를 사용합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr: 그리드</td>
			<td>sq: 정사각형</td>
			<td>hln: 구멍</td>
			<td>팬: 자동 초점</td>
			<td>fcn: 중앙 초점</td>
			<td>enn: 노출 </td>
		</tr><tr><td>확대</td>
			<td>1550</td>
			<td>940</td>
			<td>2250</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
		</tr><tr><td>디포커스</td>
			<td>0</td>
			<td>ᆞ 5 배 10-05 </td>
			<td>ᆞ 5 배 10-05 </td>
			<td>-1 × 10-06 </td>
			<td>ᆞ 7 배 10-07 </td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
		</tr><tr><td>스폿 크기</td>
			<td>4</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>강렬</td>
			<td>0.0015</td>
			<td>0.00017</td>
			<td>7.3 엑스 10-05 </td>
			<td>1.3 엑스 10-06 </td>
			<td>1.3 엑스 10-06 </td>
			<td>9.2 엑스 10-07 </td>
		</tr><tr><td>에너지 필터 폭</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>차원</td>
			<td>1024년 x 1024년</td>
			<td>1440년 x 1024년</td>
			<td>1440년 x 1024년</td>
			<td>1440년 x 1024년</td>
			<td>1008년 x 1008년</td>
			<td>5760 엑스 4092</td>
		</tr><tr><td>오프셋 </td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>936, 519</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>비닝(Binning)</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>8 엑스 8</td>
			<td>8 엑스 8</td>
			<td>8 엑스 8</td>
			<td>4 엑스 4</td>
			<td>2 엑스 2</td>
		</tr><tr><td>노출 시간(ms)</td>
			<td>250</td>
			<td>600</td>
			<td>600</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>2100</td>
		</tr><tr><td>사전 노출 (들)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>복용량(e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>51</td>
		</tr><tr><td>원시 프레임 저장</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr></tbody></table>표 3: BioQuantum 및 K3 카메라와 함께 Krios cryoTEM을 사용하여 SEMC에서 CryoEM 그리드 스크리닝을 위한 사전 설정 매개변수. SEMC의 BioQuantum 에너지 필터 및 K3 카메라가 있는 Krios에서 일반적으로 사용되는 각 사전 설정에 대한 매개변수가 표시됩니다. 현미경마다 사용 가능한 배율이 다르며 실험마다 초점 흐림 및 노출 시간과 같은 다양한 매개변수를 사용합니다.
보충 그림 1: Smart Leginon에 대한 Square 타겟팅 설정 및 Square 설정. (A) 정사각형 타겟팅 설정. (B) 정사각형 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(1).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: Smart Leginon의 구멍 타겟팅 설정 및 구멍 설정. (A) 구멍 대상 설정. (B) 홀 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(2).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: Smart Leginon의 노출 타겟팅 설정 및 노출 설정. (A) 노출 타겟팅 설정. (B) 노출 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(3).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: Smart Leginon의 초점 설정 및 초점 시퀀스 설정. (A) 초점 설정. (B) 초점 시퀀스 설정(Defocus1). (C) 초점 시퀀스 설정(Defocus2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(4).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: Smart Leginon에 대한 Z_Focus 설정 및 Z_Focus 시퀀스 설정. (A) Z_Focus 설정. (B) Z_Focus 시퀀스 설정(Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus 시퀀스 설정(Stage_Tilt_Fine). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(5).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 6: Smart Leginon Square_Targeting 파라미터를 설정한 후의 예제 아틀라스. 파란색 원은 얼룩, 녹색 더하기 기호는 획득 위치, 갈색 'x'는 현재 스테이지 위치입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(6).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 7: Smart Leginon Hole_Targeting 매개변수를 설정한 후의 예제 아틀라스. 보라색 더하기 기호는 격자 위치, 상자가 있는 녹색 더하기 기호는 획득 위치, 파란색 더하기 기호는 초점 위치입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(7).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 8: Smart Leginon Exposure_Targeting 파라미터를 설정한 후의 예제 아틀라스. 파란색 원은 얼룩, 녹색 더하기 기호는 획득 위치, 파란색 더하기 기호는 포커스 위치입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(8).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 9: Smart Leginon Autoscreen 터미널 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(9).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 10: Smart Leginon Autoscreen gui 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(10).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

초저온 전자 현미경(CryoEM) 다중 그리드 스크리닝은 종종 몇 시간의 주의가 필요한 지루한 프로세스입니다. 이 프로토콜은 이 프로세스를 자동화하기 위해 표준 Leginon 컬렉션 및 Smart Leginon Autoscreen을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 대부분의 CryoEM 홀리 포일 그리드에 적용할 수 있습니다.

Smart Leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Simons Electron Microscopy Center는 지역 및 국가 연구자들에게 우수한 전자 현미경 서비스, 전문 지식 및 교육을 제공하고 워크플로우를 최적화하기 위한 혁신적인 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 당사의 범위는 서비스, 개발, 기계 학습 및 생물 의학 연구를 포함합니다. 우리는 어떻게 하면 서비스를 더 잘 최적화할 수 있는지에 대한 답을 찾으려고 노력하고 있습니다.기계 학습은 전자 현미경 분야를 변화시키고 있습니다. 데이터 수집이 자동화되고 있습니다. 데이터 분석 도구는 빠르게 효율성이 높아지고 있습니다.여기에는 이미지 노이즈 제거, 입자 피킹, 3G 유연성 분석 및 모델 구축이 포함됩니다. 우리는 프로덕션 환경에서 다양한 그리드 구멍, 기울어진 컬렉션 또는 베타 테스트 소프트웨어를 통해 식별된 버그와 같은 다양한 상황을 설명하기 위해 정기적으로 소프트웨어를 업데이트합니다. 또한 사용자의 피드백을 통합하여 사용자에게 유용한 기능을 지속적으로 제공하고 있습니다.Smart Leginon은 cryoTEM에서 하나 이상의 그리드를 스크리닝하는 노동 집약적이고 시간 소모적인 작업을 해결합니다. 이를 통해 작업자와 연구원은 그리드를 보다 신속하게 스크리닝하고 분석할 수 있으며, 그리드와 시료 조건을 동시에 최적화할 수 있는 시간을 확보할 수 있습니다. 또한 현미경 시간과 비용도 절감됩니다.Smart Leginon 자동 스크린은 12개의 그리드에 대한 스크리닝을 설정하는 데 약 10분이 소요되는 완전 무인 멀티그리드 스크리닝을 제공합니다. 수동 스크리닝과 비교했을 때, 당사의 프로토콜은 하루에 몇 시간을 절약합니다. Smart Leginon이 도입된 이후 유사한 자동화를 위해 다른 무료 및 상용 소프트웨어가 개발되었습니다.

cryo-electron-microscopy-screening-automation-across-multiple-grids

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

여기에 제시된 프로토콜은 새로운 로봇 시스템인 Spotiton의 사용을 설명하며, 액체 저온기에서 진동하기 전에 최소 90ms를 혼합하는 나노 와이어 그리드에 관심 있는 두 샘플을 전달합니다.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

이 프로토콜은 극저온 구조조명 현미경을 사용하여 생물학적 냉동 보존 샘플을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 U2OS 세포의 세포 골격을 화상 진찰하여 방법론을 보여줍니다.

극저온 보존 된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

이 프로토콜은 TEM 그리드 동결을 위한 두 가지 샘플 준비 방법을 사용하여 뉴클레오솜 복합체의 준비를 자세히 설명합니다.

초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비

배우세요 극저온 전자 현미경 다중 그리드 스크리닝을 Smart Leginon으로 자동화하는 방법을. 이 프로토콜은 Ptolemy 이미지 처리와 머신러닝을 활용하여 수동 선별 시간을 크게 단축하고 연구자들이 샘플 조건을 병렬로 최적화할 수 있게 합니다.

Smart Leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화

더 많은 동영상 탐색