Name: 분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 배우세요 비대칭 유장-유동 분획법을 활용한 미세유체 장치로 대용량 생체액에서 세포외 소포를 분리하는 방법을. 연속 흐름과 자동화가 가능하여 임상 응용의 실용성을 높입니다.

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이 연구에 참여한 모든 기증자, 샘플을 제공해주신 라트비아 게놈 데이터베이스 직원에게 감사드립니다. 라트비아 대학의 고체 물리학 연구소(Institute of Solid-State Physics, the Center of Excellence)는 보조금 계약 번호 739508, 프로젝트 CAMART2에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 프레임워크 프로그램 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2로부터 자금을 지원받았습니다. 이 연구는 라트비아 과학 위원회 프로젝트 번호의 지원을 받았습니다. lzp-2019/1-0142 및 프로젝트 번호: lzp-2022/1-0373.

인간 소변에서 지속적인 세포외 소포 분리를 위한 미세유체 장치

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. 및 R.R.은 Cellbox Labs, LLC의 설립자, 이사회 구성원 및 지분 보유자입니다

제시된 미세유체 장치는 생물학적 유체에서 EV를 분리하고 추출하기 위한 유망한 방법을 제공하여 UC 및 SEC12와 같은 기존 골드 스탠다드 방법의 중요한 한계 중 일부를 해결합니다. UC 및 SEC는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리며 수율이 낮은 것으로 알려져 있어 많은 양의 EV가 필요한 고처리량 애플리케이션에는 적합하지 않습니다21,22. 대조적으로, 설명된 미세유체 장치는 최소한의 사용자 입력으로 최대 20mL의 생물학적 유체를 지속적으로 처리할 수 있어 산업 또는 임상 환경에서 잠재적인 게임 체인저가 될 수 있습니다. 이 미세유체 장치의 주요 장점 중 하나는 수동 단계를 포함하는 기존 방법에 비해 EV 절연을 표준화하고 재현성을 개선할 수 있다는 것입니다. 대량 제조를 통해 EV 절연 장치 제조의 변동성을 줄임으로써 장치의 성능을 더 잘 제어하고 일관성을 유지할 수 있으며, 이는 EV 기반 치료 및 진단과 같은 응용 분야에 매우 중요합니다. 또한 적절한 기판의 반응 사출 성형을 통한 대량 제조와의 호환성은 확장성과 광범위한 채택 가능성을 더욱 향상시킵니다.
재현성과 일관된 성능을 보장하려면 칩을 생산하고 실험에 사용하기 위해 광범위하고 잘 정의된 프로토콜이 필요합니다. 이 칩은 산업화를 염두에 두고 설계되었습니다. 그러나 실험실 환경에서 장치를 제조하는 동안 기포 형성을 방지하고, 정밀하고 견고한 결합을 보장하고, 실제 실험에서 예상되는 것보다 더 높은 유속에서 철저한 테스트를 수행하는 데 주의를 기울여야 합니다. 이 예방 조치는 COC-OSTE 장치에 특히 중요한데, 특히 높은 유속에서 접합 실패로 인해 누출이 발생하기 쉽기 때문입니다. 또한 OSTE는 감광성 소재이기 때문에 UV에 불필요하게 노출되지 않도록 황색광에서 장치 제작을 수행해야 합니다. 이 기술은 아직 초기 단계에 있기 때문에 이 새로운 방법에 대한 표준화된 프로토콜이 아직 확립되지 않았고 액체 점도가 결과에 따라 EV 격리 효율에 분명히 영향을 미칠 수 있기 때문에 연구원들은 특정 응용 분야에 대한 최적의 설정을 식별하기 위해 다양한 유속을 실험해야 합니다. 이러한 지침을 따르고 표준화 문제를 해결함으로써 EV 절연을 위한 이 미세유체 장치의 잠재력은 다양한 연구 분야 및 응용 분야에서 완전히 실현될 수 있습니다.
미세유체 장치를 사용하는 EV 분리 방법은 성능을 최적화하기 위해 광범위한 수정 및 문제 해결을 허용합니다. 입자 분리를 개선하기 위해 연구원들은 더 긴 채널, 다양한 막 다공성 및 공극 밀도, 변경된 치수를 탐색할 수 있습니다. 작은 입자 배출구에 큰 입자가 많은 경우 더 높은 버퍼 입구 속도를 테스트하는 것이 도움이 될 수 있으며, 큰 입자 배출구에 작은 입자가 많은 경우 더 긴 채널 또는 더 큰 기공이 있는 멤브레인으로 실험하는 것이 좋습니다. 입자 흡수 문제를 해결하려면 유속, 표면 수정 및 OSTE 구성을 조정하거나 UV 노출 시간을 변경해야 할 수 있습니다. 불안정 및 누출이 발생하는 장치의 경우 유속을 줄이고 적절한 접착을 보장하는 것이 중요한 단계입니다. EV 손상을 최소화하기 위해 연구원들은 유속을 줄이고, 장치 멸균 후 PBS로 더 철저히 세척하고, 더 작은 멤브레인 공극 또는 대체 금형 설계 기술 및 재료 사용을 고려할 수 있습니다. 이러한 조정을 통해 미세 유체 장치를 미세 조정할 수 있어 EV 연구 및 관련 분야의 다양한 응용 분야에 대한 잠재력을 발휘할 수 있습니다. 또한 장치의 성능을 최적화하기 위해 밀도 및 점도 측정을 포함한 업스트림 시료 특성화를 통합하여 유량 매개변수를 조정할 수 있습니다. 더욱이, 시료의 성질에 특히 강조되어야 하는데, 이는 생체유체의 확립된 비멸균성을 감안할 때23. 결과적으로, 임상 적용에서 투여하기 전에 샘플의 멸균을 적절하게 고려해야 합니다.
이러한 어려움에도 불구하고 미세유체 장치는 다양한 연구 분야에서 엄청난 잠재력을 보유하고 있습니다. 대량의 매우 이질적인 샘플에서 EV를 지속적으로 분리할 수 있는 기능은 자동화의 문을 열어 고처리량 애플리케이션을 촉진하고 다양한 소스의 EV에 대한 보다 심층적인 분석을 가능하게 합니다. 이 미세유체 모듈을 중공사 세포 바이오리액터 카트리지 또는 고분해능 유세포 분석기와 같은 다양한 장치에 통합하면 EV 애플리케이션을 보다 산업 친화적으로 만들고 약물 전달, 진단 및 화장품과 같은 분야에서 혁신을 주도할 수 있습니다4. 전반적으로, 이 미세유체 장치는 EV 연구 분야에서 중요한 진전을 나타내며 광범위한 연구 및 산업 환경에서 유망한 응용 분야로 EV 격리를 위한 효율적이고 표준화된 방법을 제공합니다.

세포외 소포체(EV)는 엑소좀(30-200nm)과 미세소포(200-1000nm)의 두 가지 주요 유형으로 구성된 세포 유래 막 결합 입자입니다1. 엑소좀은 다낭체(MVB) 내에서 엔도솜 막의 안쪽 발아를 통해 형성되며, 원형질막과 융합할 때 내강 내 소포(ILV)를 세포외 공간으로 방출합니다1. 대조적으로, 미세소포는 세포막의 바깥쪽 발아와 핵분열에 의해 생성된다2. EV는 단백질, 핵산, 지질 및 대사 산물을 운반하여 세포의 생리적 상태를 반영하여 성장, 혈관 신생, 전이, 증식 및 치료 저항성을 포함하여 세포 간 통신에 중요한 역할을 합니다3. 그 결과, 암을 포함한 질병에 대한 유망한 바이오마커 및 치료 표적으로 부상하여 진단 및 약물 전달 시스템에서의 잠재력을 강조하고 있습니다4.
질병 진단 및 치료에서 EV를 완전히 활용하려면 다양한 생체 유체로부터 효율적으로 분리하는 것이 중요합니다5. 일반적인 방법으로는 초원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 여과 및 면역분리가 있습니다6. UC는 널리 사용되는 기술이지만 EV가 아닌 유사한 밀도의 입자를 생성할 수 있으며 EV 응집체를 생성할 수 있습니다7. SEC는 밀도가 아닌 크기에 따라 입자를 제외하여 더 높은 순도의 시료를 제공할 수 있는 능력으로 인해 인기를 얻고있다 8. 그러나 SEC 컬럼에 적합한 공극 크기를 신중하게 선택하고 크로마토그래피 조건을 최적화하는 것은 킬로미크론 및 저밀도 지단백질과 같은 원치 않는 입자의 동시 분리를 최소화하는 데 필수적입니다8. 이러한 효과에도 불구하고, 두 방법 모두 시간이 많이 걸리고 자동화가 까다로우며, 특히 세포 배지나 소변과 같은 대용량 샘플의 경우 산업 응용 분야를 위한 확장성이 제한된다9.
최근 몇 년 동안 비대칭 전계 유동장 분획(A4F)은 크기 및 부력 기반 마이크로미터 및 나노미터 크기의 입자 분리를 위한 강력한 분리 기술로 발전했습니다10. A4F의 작동 원리는 베이스에 다공성 멤브레인이 부여된 미세유체 채널에 의존하여 크로스 플로우(10)라고 하는 멤브레인을 향해 가해지는 힘을 생성합니다. 브라운 운동(Brownian motion) 및 시스템에 내재된 푸아유유(Poiseuille) 흐름과 결합될 때, 교차 흐름은 유동 역학11 내의 다양한 입자 위치로 인해 효율적인 입자 분리를 용이하게 한다. 이점에도 불구하고, 이 방법은 마이크로리터 범위(12 ) 내의 샘플 부피로 제한되며, 추가적인 포커싱 단계를 필요로 하며, 이는 공정(10)의 지속 시간을 연장시킨다.
지난 10년 동안 미세유체공학은 빠르고 효율적이며 임상적으로 신뢰할 수 있는 EV 분리를 위한 도구로 두각을 나타냈습니다13. 그러나 EV 분리를 위해 설계된 대부분의 미세유체 분석법은 소량, 고농도 EV 샘플에 최적화되어 있거나 복잡한 분리 절차에 의존한다14. 또한, 미세유체역학 분야에서 폴리디메틸실록산(PDMS)은 광학적 투명성, 생체 적합성 및 사용 편의성으로 인해 황금 표준 소재로 인정받고 있습니다15. 그럼에도 불구하고, EV를 포함한 작은 친유성 분자를 흡수하는 이의 알려진 성향은 EV 분야(13)에서의 응용에 문제가 될 수 있다.
고리형 올레핀 공중합체(COC)는 생체 적합성, 분자 흡수율이 낮고 내화학성이 높기 때문에 미세유체역학에서 자주 사용되는 재료입니다15. 그러나, COC 장치의 제조에는 종종 복잡한 공정이나 특수 장비가 포함된다16. 대안으로, 오프화학량론 티올-엔(OSTE)은 저분자의 흡수 감소, 우수한 화학적 안정성, 제조 용이성 및 확장 가능한 제조 공정으로 인해 PDMS에 대한 유망한 대안입니다17,18. 그러나, 튜빙에 대한 복잡한 연결로 인해, 장치는 누출되기 쉬울 수 있다19.
이 연구의 목적은 소변이나 세포 배지와 같은 대용량 샘플에서 EV 분리를 위해 OSTE와 COC와 분기된 A4F 원리를 결합한 미세유체 장치를 설계하고 제작하는 것이었습니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 & 마이크로; m 카르복실레이트 FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>재고 농도: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT에 따라 다름)</td></tr><tr><td>0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Luer cone syringe 일회용 without needle RAYS</td><td></td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro; m 폴리스티렌 FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>재고 농도: 1 x 1010 beads/mL (LOT에 따라 다름)</td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Protein LoBind tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringes</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 &마이크로; m ID 폴리에테르 에테르 케톤 튜빙</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO 원심 필터 장치</td><td>Merck Millipore,UFC200324</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL 의료용 주사기(바늘 없음</td>) <td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti 고정각 초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 &마이크로; m ID 폴리테트라플루오로에틸렌 튜빙</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 마이크로플레이트, f-bottom, med. 결합</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA 플레이트</td></tr><tr><td>B-27 보충제(50개), 무혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 현미경 슬라이드 플랫폼</td><td>Microfluidic Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 현미경 슬라이드 플랫폼 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>미세유체 칩샵</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 압력 컨트롤러</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer 커넥터</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>마스크 정렬기 Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec 그룹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>믹서 Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>나노 입자 분석기&nbsp;</td></tr><tr><td>광학 현미경 Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg 무료입니다. 피셔 생물 시약. 100g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC 멤브레인(50nm 공극 직경, 11.8% 밀도)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35nm 컬럼</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC 컬럼</td></tr><tr><td>QSIL 216 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resin Tough Black</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti 스윙 초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 서스펜션 플라스크</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc 단백질</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>양고추냉이 과산화효소 기판</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척 장치 P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>범용 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>소변 수집 컵, 150mL, 멸균</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 주사기 필터</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>동적 광 산란(DLS) 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>조트랙스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분기된 a4f 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

세포외 소포체(EV)는 진단, 약물 전달 및 재생 의학을 포함한 다양한 생물의학 응용 분야에 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 EV를 분리하는 현재의 방법론은 복잡성, 시간 소비, 부피가 큰 장비의 필요성과 같은 중요한 문제를 제시하여 임상 번역을 방해합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 연속적인 방식으로 대용량 샘플에서 EV를 효율적으로 분리하기 위해 COC-OSTE(Cyclic Olefin Copolymer-off-stoichiometry thiol-ene)를 기반으로 하는 혁신적인 미세유체 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구에 사용된 기술은 크기 및 부력 기반 분리를 활용하여 소변 및 세포 배지 샘플의 기존 접근 방식에 비해 훨씬 더 좁은 크기 분포를 달성하여 향후 응용 분야에서 특정 EV 크기 분획을 표적으로 삼을 수 있습니다. 분기된 비대칭 유동장-유동 분획 기술을 활용하는 당사의 혁신적인 COC-OSTE 미세유체 장치 설계는 대용량 시료에 대한 간단하고 지속적인 EV 분리 접근 방식을 제공합니다. 또한 이 미세유체 장치의 대량 제조 잠재력은 확장성과 일관성을 제공하여 높은 일관성과 처리량이 필수 요구 사항인 일상적인 임상 진단 및 산업 공정에 EV 절연을 통합할 수 있습니다.

우리는 분기된 A4F 원리(그림 2B, C)를 기반으로 고처리량 EV 분리를 위해 소프트 리소그래피(그림 2A)를 통해 3D 프린팅된 이중 네거티브 몰드(그림 1)를 사용하여 미세유체 장치를 제작했습니다. 이 설정에는 그림 3에서 볼 수 있듯이 자동화된 방식으로 EV를 격리하기 위해 펌프와 플로우 스루 스테이션이 필요합니다. 첫째, 장치의 개념 증명을 평가하기 위해 직경이 100nm 및 1000nm인 폴리스티렌 비드의 혼합물을 제조하여 각각 소포 및 미세 세포 파편(10)을 나타냅니다. 선형 속도가 분리 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해 분기 흐름이 있거나 없는 비드 혼합물에 대해 다양한 유속으로 실험을 수행했습니다. 모든 실험에서 작은 비드의 회수율은 90%10 이상으로 일관되게 유지되어 EV를 회수할 수 있는 장치의 잠재력을 보여주었습니다.
그런 다음 최소한의 사전 처리로 복잡한 생체 유체에서 대용량(&gt;1mL)의 EV를 분리하는 COC-OSTE 장치의 잠재력을 평가하고 비교했습니다. 따라서 10명의 건강한 기증자의 소변(그림 4)과 두 개의 서로 다른 전립선 세포주의 세포 배지(그림 5)를 템플릿으로 사용하여 초원심분리(UC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 A4F 미세유체역학 기반 OSTE-COC 장치의 세 가지 절차에 따라 EV를 동시에 분리했습니다. 분리 후, 나노 입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 입자의 총 수와 크기 분포를 평가했습니다. 평균적으로 OSTE-COC 장치는 UC에 비해 생체 유체에서 더 나은 총 입자 회수율을 보였지만 통계적 유의성은 두 포트의 입자 수를 결합할 때만 달성되었습니다(그림 4A). 장치 성능을 다른 시스템과 비교하려면 R &amp; L 콘센트를 함께 고려해야합니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, L &amp; R 콘센트 함께 EV 복구 성능이 UC 및 SEC를 능가합니다. 이와 별도로 L-포트는 작은 EV 분획을 포착하도록 설계된 반면, R-포트는 유사한 크기의 다른 분자와 함께 더 큰 EV 분획을 수집하도록 설계되었습니다. 흥미롭게도 OSTE-COC 장치의 R-PORT를 사용한 복구율은 SEC 및 UC만 사용한 복구율보다 약간 높았습니다(그림 4A). CD63 발현은 유사한 패턴을 보였다(그림 4C). 이 결과는 OSTE-COC 장치가 전체 EV 복구에 더 효과적이었음을 나타냅니다. 더 큰 입자 크기 분포를 보여주는 UC를 제외하고는 서로 다른 방법론 간에 동등한 크기 분포가 발견되었습니다(그림 4B).
세포 배지 배양에서 유사한 결과가 관찰되었습니다. 두 시나리오 모두에서 두 장치 포트의 총 입자 회수율은 SEC 또는 UC 방법론에 비해 우수한 성능을 보였습니다(그림 5A,B 참조). 특히, PC3 세포에서 파생된 EV는 다른 실험군과 비교할 때 L-PORT 분포에서 더 큰 균질성과 함께 뚜렷한 크기 분포를 보여주었습니다(그림 5C,D). 또한 CD63 발현 분석은 COC-OSTE 장치를 사용하여 달성된 더 높은 EV 회수율을 확인했습니다(그림 5E,F 참조). 본 연구에서 조사한 다양한 방법론의 분리 특성을 비교한 요약은 표 1에서 확인할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> 그림 1: 3DP 구불구불한 모양의 이중 네거티브 금형 치수 및 등각 투영 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> 그림 2: COC-OSTE 미세유체 장치. (A) OSTE-COC 장치 제작의 다양한 주요 단계 구성표. (B) 장치 작동 원리. (C) 완성된 장치의 이미지. 눈금자: 15mm. 이 수치는 Priedols et al.10 및 Bajo-Santos et al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> 그림 3: 장치의 실험적 구성. 주사기 펌프는 왼쪽에, OSTE-COC 장치는 가운데에, 회수 스테이션은 오른쪽에 있습니다. 이 수치는 Priedols et al.10 및 Bajo-Santos et al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> 그림 4: 초원심분리(UC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 COC-OSTE 장치를 사용한 10명의 기증자의 소변 EV 크기 분포 및 입자 회수. (A) 나노 입자 추적 분석(NTA)에 의해 각 분리 방법에서 회수된 입자량. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 표시됩니다. * (p&lt;0.05)로 표시되는 통계적 유의성. (B) 상자 그림은 NTA에서 평가한 모든 소변 샘플의 평균 입자 크기 분포를 표시하며, 수염은 최소값과 최대값을 나타냅니다. p-값은 UC와의 비교에서 도출되었으며, ****는 높은 통계적 유의성을 나타냅니다(p&lt;0.0001). (C) 각 분리 방법에 대해 이중 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(dsELISA)을 사용하여 평가한 평균 CD63 양의 중앙값 및 범위는 모든 샘플에서 계산되었습니다. L-포트: 왼쪽 포트; R-포트: 오른쪽 포트. 이 그림은 Bajo-Santos et al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> 그림 5: 다양한 방법을 사용하여 PC3 및 LNCaP 전지에서 분리된 EV의 특성 분석. (A) 평균+/- 표준 편차로 표시되는 나노 입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 PC3 매체에서 회수된 입자량. (B) NTA를 사용하여 LNCaP 세포 매질에서 회수된 입자량은 평균 +/- 표준 편차로 표시됩니다. (C) 범위와 함께 PC3 배양에서 EV의 중간 입자 크기 분포는 NTA에 의해 결정되었습니다. (D) 범위가 있는 LNCaP 배양에서 분리된 EV의 중간 크기 분포. (E) 이중 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(dsELISA)을 사용한 PC3 세포주 유래 EV에 대한 각 분리 방법에 대한 CD63 발현의 중앙값 및 범위. (F) 각 분리 방법에 대한 dsELISA에 의한 LNCaP 유래 EV CD63 발현의 중앙값 및 범위. UC: 초원심분리; SEC: 크기 배제 크로마토그래피; L-포트: 왼쪽 포트; R-포트: 오른쪽 포트. 이 그림은 Bajo-Santos et al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC (영어)</td>
			<td>초</td>
			<td>COC-OSTE (영어)</td>
		</tr><tr><td>처리 시간/샘플</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>처리량</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>비용/샘플</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>순도</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>자동화</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>EV 수율</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>사이즈 선택</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>표 1. EV의 절연 특성과 UC, SEC 및 COC-OSTE 장치의 세 가지 방법 비교. UC: 초원심분리; SEC: 크기 배제 크로마토그래피. COC-OSTE: 고리형 올레핀 공중합체-오프-화학량론 티올-엔. +: 낮음; ++: 중간; +++: 높음. * 장치에 따라 다릅니다.

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

우리는 세포외 소포체의 잠재력을 알고 있지만, 특히 생물반응기 배지와 같은 큰 샘플 생체유체로부터 소포체를 분리하는 것이 어렵다는 것도 알고 있습니다. 이 연구에서 우리는 세포외 소포체를 분리하기 위해 비대칭 유동장-유동 분획을 사용할 수 있는지 테스트했습니다. 현재로서는 생물반응기에 통합하기 위해 연속적인 흐름으로 생체유체에서 직접 세포외 소포체를 분리하는 것은 불가능합니다.대신 생체 유체를 먼저 수집하고 처리해야 하므로 변동성과 노동력이 추가됩니다. 대용량 생체 유체에서 세포 외 소포 분리를 위해 설계된 당사의 장치는 지속적인 흐름 및 자동화를 위해 생물 반응기와 통합할 수 있습니다. 우리는 액체 점도가 비대칭 전계 흐름 분별을 사용하여 세포 외 소포체 분리에 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다.우리는 생체유체와 완충액 흐름을 점도에 적응시키는 것이 분리를 강화할 수 있는지 조사하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

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