고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용
2023년 11월 10일
극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.
초저온 전자 현미경 시료 전처리의 일반적인 과제는 공기-물 계면에서 입자 국소화를 통해 입자가 선호하는 방향과 변성을 채택하도록 하는 것입니다. 대신, 입자가 그래핀처럼 박막이 지지하는 격자 표면에 놓이는 것이 좋습니다. 또 다른 과제는 상대적으로 높은 시료 농도에 대한 요구 사항이며, 이는 그래핀으로도 해결할 수 있습니다.
그래핀 코팅 그리드는 CryoEM 구조 결정에 많은 이점을 제공하지만, 역사적으로 사내에서 재현 가능하게 제작하기 어려웠을 뿐만 아니라 상업적으로 구매하기에는 비용이 많이 들었습니다. 이 프로토콜은 단층 그래핀의 강력한 증착을 허용하여 사용자가 연구에 이러한 그리드를 사용하는 데 대한 장벽을 낮춥니다. 그래핀은 재료 특성 때문에 독특합니다.
탄소의 단층이므로 배경 소음이 최소화됩니다. 비정질 탄소 또는 산화 그래핀 플레이크의 얇은 층과 같은 다른 CryoEM 그리드 지지체는 단일 단층으로 적용할 수 없으며 더 많은 배경 신호에 기여합니다. 이제 cryoEM 그리드에 그래핀을 적용하기 위한 강력한 프로토콜을 확립했으므로 세포 용해물에서 직접 그리드 캡처를 위한 친화성 핸들이 있는 그래핀 코팅 그리드의 기능화를 추구하고자 합니다.
이는 CryoEM 검체 준비의 또 다른 병목 현상을 완화할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드를 그래핀 단분자층으로 코팅하는 프로토콜을 제시합니다. 그래핀을 사용하면 입자 밀도가 높아지고, 공기-물 계면과의 상호작용이 최소화되며, 입자의 배향 분포가 개선됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 초저온 전자현미경법
- 재료 과학
- 시료 준비 기술
배경
- 공기-물 계면에서의 입자 국소화는 cryo-EM에서 흔히 발생하는 과제입니다.
- 선호 배향성은 입자의 변성을 초래할 수 있습니다.
- 그래핀 지지체는 입자가 그리드 표면에 안착하는 것을 도울 수 있습니다.
- 과거에는 그래핀 코팅 그리드를 제작하는 것이 어렵고 비용이 많이 들었습니다.
연구 목적
- cryoEM 그리드 상에 단층 그래핀을 증착하기 위한 견고한 프로토콜을 제공합니다.
- 연구자들이 그래핀 코팅 그리드를 활용하는 데 따르는 진입 장벽을 낮춥니다.
- cryo-EM 구조 결정의 장점을 극대화합니다.
사용된 방법
- 그래핀 코팅 프로토콜 개발.
- 입자 밀도 및 배향 평가.
- 그래핀 코팅 그리드와 전통적 그리드의 비교.
- 그리드 제작의 재현성 평가.
주요 결과
- 그래핀 코팅 그리드는 입자 국소화(localization)를 현저히 개선합니다.
- 입자 밀도의 향상은 더 나은 구조 결정(structure determination)을 가능하게 합니다.
- 견고한 프로토콜을 통해 연구실 내에서 그래핀 그리드를 직접 제작할 수 있습니다.
- 연구자들의 비용 부담을 줄이고 접근성을 높였습니다.
결론
- cryo-EM 그리드에 그래핀을 사용하면 시료 준비의 주요 과제들을 해결할 수 있습니다.
- 본 프로토콜은 연구 분야에서 그래핀 코팅 그리드의 더 폭넓은 도입을 가능하게 합니다.
- 그래핀의 독특한 특성은 cryo-EM 성능을 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
초저온 전자현미경(cryoEM)의 시료 준비 과정에서 발생하는 병목 현상은 초기 발굴 및 구조 생물학 파이프라인 내 고해상도 구조 결정의 처리량과 신뢰성을 제한합니다. 초저온 전자현미경 그리드에 단층 그래핀을 적용하면 입자 위치 지정, 배향 편향 및 시료 농도 요구 사항과 같은 핵심 과제를 해결할 수 있으며, 이는 표적 검증 및 기전 연구의 예측 신뢰도에 직접적인 영향을 미칩니다. 견고하고 재현 가능한 그래핀 그리드 프로토콜은 더 광범위한 기업적 도입을 가능하게 하여, 리스크가 조정된 포트폴리오 진전과 효율적인 자원 배분을 지원합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 거대분자 표적을 원자 수준에 가까운 해상도로 고정밀 구조 분석할 수 있게 합니다.
- 시료의 변성과 배향 편향을 줄여 기전상의 리스크 제거를 지원합니다.
- 입자 밀도와 이미징 일관성을 향상시켜 확신 있는 표적 검증을 가능하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 cryoEM 워크플로우를 위해 표준화되고 재현 가능한 그리드 지지체를 준비합니다.
- 배경 노이즈를 최소화하고 정량적 이미징 출력을 향상시켜 분석의 신뢰성을 높입니다.
- 더 낮은 시료 농도에서 구조적으로 다양한 복합체의 확장 가능한 스크리닝을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련 복합체의 구조 연구를 가능하게 하여 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 발견 단계의 구조 규명부터 분자 기전의 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 구조 데이터의 품질을 확보함으로써 후기 단계의 생물학적 실패 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
단층 그래핀 그리드 제작은 초기 발견부터 리드 물질 식별 및 전임상 연구에 이르는 cryoEM 워크플로우에 통합되어, 가설 기반의 구조 결정과 기전적 통찰을 지원합니다.
- 발견 생물학: 조건 간의 정확한 구조적 비교를 가능하게 하여 강력한 귀무가설 검정을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량적 이미징 및 분석 표준화를 위해 재현 가능하고 배경 잡음이 낮은 그리드를 제공합니다.
- 분석: 통계 분석 및 의사 결정을 위한 고품질의 회절 패턴과 밀도 맵을 제공합니다.
- 중개 연구: 질병 관련 표적 및 복합체에 대한 구조 데이터의 연속성을 유지합니다.
- 기업 내 재사용: 다양한 R&D 프로그램을 위해 확장 가능하고 재현 가능한 그리드 준비 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 구조 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 그리드 준비 과정을 표준화하고 재현성을 높이며, 시료 투입 요구량을 낮춥니다.
- 전략적 가치: 시료 준비의 병목 현상을 줄임으로써 go/no-go 결정의 품질과 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 구조적으로 검증된 표적의 리스크 조정 우선순위 설정 및 진전을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 그래핀 취급 및 cryoEM 그리드 제작에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 스핀 코터, 글로우 방전 장치 및 UV 오존 세정기 사용이 가능해야 합니다.
- 재현성과 데이터 비교 가능성을 위해 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 서로 다른 거대분자 시스템이나 시료 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 취급 시의 취약성 및 전사 과정 중 단층 무결성 확보와 같은 실질적인 제약 사항이 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
