Name: 히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 학습하세요 아세틸 클릭 화학 분석을 통해 HAT1 히스톤 아세틸전이효소 활성을 측정하는 방법을. 이 기법은 고처리량 스크리닝을 통해 소분자 억제제를 효율적으로 선별할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구입니다.

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H4K12CoA를 제공해 주신 George Zheng에게 감사드립니다. 유용한 토론과 피드백을 주신 Gruber Lab 구성원 여러분께 감사드립니다. NIH/NCI(1K08CA245024), CPRIT(RR200090) 및 V Foundation(V2022-022)의 지원에 감사드립니다.

1. 방법 1: 재조합 HAT1/Rbap46 복합체 생산 및 정제
<ol><li>HEK293f 세포 해동, 회수 및 확장<ol><li>1-1,000만 HEK293f 포유류 세포26 개를 100mL 플라스크에서 30mL 자유형 293 발현 배지로 해동합니다. 60 rpm으로 회전하면서 37 °C에서 8 % CO2 에서 배양합니다.</li>
		<li>다음날 세포 생존율을 계산하고 확인한 다음 회전 속도를 120rpm으로 조정합니다. 1L 플라스크에서 300mL 배양액으로 확장하여 파종 밀도를 500,000 cells/mL로 유지하고 밀도가 3 x 106 cells/mL를 초과하기 전에 세포를 분할합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>HEK293f 트랜스펙션<ol><li>1L 플라스크에 300mL 배양액에 5 x 105 세포/mL를 파종하고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포가 7.5 x 105 에서 1.2 x 106 cells/mL 사이인지 확인하기 위해 세포를 세십시오.</li>
		<li>30mL의 PBS에 300μg의 pHEK-FLAG-HAT1과 300μg의 pHEK-Rbap46 플라스미드 DNA의 혼합물을 준비합니다. 폴리에틸렌민(PEI) 1.2mL를 DNA/PBS에 넣고 섞습니다. RT에서 20분 동안 배양합니다. DNA/PBS/PEI 혼합물을 300mL 배양액에 넣고 37°C에서 120rpm에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 채취<ol><li>세포가 1.7 x 106 에서 2.5 x 106 세포/mL 사이에 있는지 계산합니다. 이 세포 밀도에서 포스콜린을 12.5μM의 최종 농도에 첨가하여 HAT1을 활성화하고 30분, 37°C, 120rpm 동안 세포를 배양합니다.</li>
		<li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 펠렛화하고 30mL의 PBS로 한 번 세척한 다음 액체 N2에서 급속 냉동합니다. 단백질이 정제될 때까지 -80°C에서 보관하거나 바로 정제를 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>HAT1/Rbap46 복합체 FLAG-비드 정제<ol><li>세포를 용해하고 단백질 추출물을 준비합니다.<ol><li>50mL의 RSB-500(20mM Tris-HCl pH 7.5, 500mM NaCl, 25mM MgCl2)에 프로테아제 억제제 칵테일(PIC) 1정을 첨가하여 용해 완충액을 준비합니다.</li>
			<li>300mL 배양액의 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 0.1% Triton X-100을 사용하여 40mL의 얼음 저온 용해 완충액으로 용해합니다. 얼음 위에서 초음파 처리 한 다음 10,000 x g 에서 4 ° C에서 10 분 동안 회전시킵니다. 모든 상층액을 얼음 위의 50mL 튜브 하나에 모으면 단백질 추출물이 나옵니다.</li>
		</ol></li>
		<li>FLAG 비즈를 준비합니다.<ol><li>5mL의 0.1M 글리신 pH 3.5, 0.01% Triton X-100을 포함하는 각 튜브에 400μL의 M2-FLAG 아가로스 비드 슬러리를 추가하여 FLAG 비드를 4개의 15mL 원뿔형 튜브로 분할합니다. 각 튜브를 손으로 5초 동안 세게 흔듭니다.</li>
			<li>4°C에서 1000 x g 에서 30초 동안 펄스 원심분리기, 상층액을 흡입하고 RSB-500 + 0.1% Triton X-100(Tx-100, 단백질 분해 효소 억제제 없음) 5mL로 2회 세척하고 얼음에서 배양합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>FLAG 면역침전을 수행합니다.<ol><li>세척된 비드가 들어 있는 각 15mL 원뿔형 튜브에 단백질 추출물 10mL를 추가합니다. 튜브를 4°C에서 역회전하여 최소 90분 또는 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
			<li>결합된 비드를 RSB-500 + 0.1% Tx-100 10mL 10mL에 5회 세척합니다. 세척할 때마다 튜브를 2x-5x 뒤집어 비드를 재현탁한 다음 1000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 펠릿합니다. 마지막으로 RSB-100 (20mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 25mM MgCl2) + 0.1 % Tx-100에서 1x 세척합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>FLAG 펩타이드 용출: 0.5mg/mL FLAG 펩타이드를 함유한 1.5mL의 용출 완충액(EB)에서 HAT1 복합체를 용리합니다. 4 °C에서 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 용리된 비드를 1000 x g 에서 4°C에서 30초 동안 펄스 원심분리하고 정제된 HAT1/Rbap46 복합체를 포함하는 상층액을 수집합니다.</li>
		<li>단백질을 농축하고 FLAG 펩타이드를 제거합니다.<ol><li>20mL, 10,000Dalton 차단 필터 튜브에 용리액을 추가합니다. EB를 사용하여 부피를 15mL까지 올립니다. 4°C에서 15분 동안 2500 x g 으로 회전하고 매번 15mL의 EB를 추가로 사용하여 두 번 반복합니다.</li>
			<li>필터 튜브에서 최종 용리액을 회수하고 A260으로 단백질 농도를 확인합니다. EB 6mL에 총 단백질 1mg의 농도가 예상됩니다(시작 배양 300mL 기준). SDS-PAGE, Coomassie, immunoblotting을 통해 단백질 순도를 확인하고 분취액은 -80°C에서 보관합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 방법 2: HAT1 아세틸 클릭 표준 곡선
<ol><li>표준 곡선 준비<ol><li>SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)] 서열로 양성 대조군 H4 N-말단 펩타이드를 합성합니다.</li>
		<li>Pra 펩타이드를 DMSO에서 0.1mg/mL로 재현탁시킵니다. Pra 펩타이드를 비오틴화된 히스톤 H4 펩타이드(1-23-GGK-비오틴)와 혼합하여 표준 곡선을 만듭니다(그림 2, 표 1에서 찾을 수 있는 부피). 표준 곡선은 플레이트 바인딩 전에 새로 만들거나 미리 만든 경우 20μL의 8M 요소와 혼합하여 3.3단계까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 방법 3: HAT1 아세틸 클릭 분석
<ol><li>테스트 억제제를 사용한 아세틸화 반응 조립<ol><li>다음 구성 요소에서 0.2mL PCR 튜브 또는 96-웰 PCR 플레이트에 아세틸화 반응을 중복으로 조립합니다: DMSO에서 0.1mg/mL(34.8μM)로 재현탁된 비오틴화 히스톤 H4 펩타이드(1-23-GGK-비오틴), EB에 미리 희석된 HAT1 효소, 20배 완충액(1M Tris pH 8.5, 0.1% NP40), 2mM DTT, 물에 1mg/mL(1mM)로 용해된 4-펜티노일-CoA. 20μL 반응은 10μL의 효소, 1μL의 H4 펩타이드, 1μL의 20x 완충액, 1μL의 DTT로 구성되며 사전 혼합되어 얼음 위의 96웰 PCR 플레이트의 웰에 분주됩니다.</li>
		<li>웰당 1μL의 DMSO(음성 대조군) 또는 1-10μM에 용해된 테스트 화합물 또는 H4K12CoA25 (또는 적절한 양성 대조군 억제제)를 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 얼음 위에서 10분 동안 배양하여 효소: 억제제 복합체가 형성되도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아세틸화 반응 연속<ol><li>2μL의 4-펜티노일-CoA를 4μL의 물과 결합한 다음 우물에 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고, 상온에서 300 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 내용물을 수집하고, 37°C에서 뚜껑이 있는 튜브 또는 재밀봉 가능한 호일이 있는 플레이트에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>반응 생성물을 위해 내용물을 직접 처리하거나 20μL의 8M 요소로 담금질하고 처리할 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Neutravidin 플레이트에 대한 펩타이드 결합<ol><li>웰당 80μL의 PBST(PBS + 0.1% Tween-20)를 포함하는 소 혈청 알부민(BSA) 사전 차단된 검은색 뉴트라비딘 코팅 96웰 플레이트에 요소 유무에 관계없이 반응 내용물을 추가합니다.</li>
		<li>표준 곡선 펩타이드를 80μL의 PBST를 함유한 자체 웰에 중복으로 추가합니다. 실온(RT)에서 1시간 동안 부드러운 궤도 흔들림으로 펩타이드를 결합합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세척: 결합이 완료된 후 웰에서 액체를 흡인하고 플레이트 와셔를 사용하여 200μL의 PBST 3x 15스트로크(180μL 스트로크 부피)로 웰을 세척합니다.</li>
	<li>클릭 화학 반응<ol><li>다음과 같이 클릭 반응을위한 시약을 준비한다 : 100 mM Tris (3- 하이드 록시 프로필 트리아 졸리 메틸) 아민 (THPTA) 리간드 물 및 20 mM CuSO4 물에서. THPTA는 Cu (II) 촉매 가수 분해를 방지하고 O2 / Cu / 아스코르브 산염에서 생성 된 라디칼 및 과산화물을 소멸시킵니다.</li>
		<li>THPTA/Cu 혼합물을 물에 있는 300mM 아스코르브산나트륨에 첨가하고 DMSO에 2.5mM 비오틴 아지드화물을 첨가합니다. 원클릭 반응에는 PBS 140μL, THPTA 10μL, CuSO4 10μL, 아스코르브산나트륨 10μL, 비오틴-아지드 20μL가 포함됩니다. 항상 클릭 시약을 신선하게 혼합한 다음 각 웰에 190μL를 분주하고 플레이트를 밀봉한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세척: 웰에서 액체를 흡입하고 PBST(180μL 스트로크 부피, 세척 당 15스트로크)로 플레이트를 3회 세척합니다.</li>
	<li>스트렙타비딘-고추냉이 과산화효소 결합: 스트렙타비딘-HRP(0.224mg/mL)를 스트렙타비딘(0.224mg/mL)에 1:10으로 희석한 다음 PBST에서 1:1000으로 더 희석합니다. Steptavidin-HRP: streptavidin 혼합물(웰당 100μL)을 추가하고 부드러운 궤도 흔들림으로 RT에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>이전 단계와 같이 PBST로 3번 세척합니다.</li>
	<li>Amplex 적색 산화<ol><li>Amplex 적색 검출 시약을 다음과 같이 결합합니다: 4.45mL의 NaHPO4 완충액(1x = 50mM 최종 농도), 50μL amplex 적색(DMSO에 희석된 20mM), 500μL의 희석된H2O2.</li>
		<li>1x NaHPO4 완충액에H2O2를 30% 스톡에서 3%로 희석한 후, 22.7μL의 3%H2O2를 977μL의 1x NaHPO4 완충액(암플렉스 반응에 사용되는H2O2)에 첨가한다. 웰당 100μL의 amplex 적색 반응 혼합물을 추가하고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 30분 동안 배양한 다음 표준 형광 플레이트 리더를 사용하여 571/585nm의 형광 여기/방출을 검출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 억제 계산: 다음 공식에 따라 억제율(그림 3)을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66054/66054eq01.jpg" style="margin: auto;">여기서 D 는 DMSO로만 처리한 대조 반응의 형광 값, X 는 테스트 화합물로 처리한 반응의 값, BG 는 배경 웰(H4 펩타이드 대조군, 효소 첨가 없음)의 값입니다.</li>
	<li>용량 곡선: 화합물을 연속적으로 희석하여 반복 분석을 위해 HAT1 효소 활성을 억제하는 것으로 밝혀진 테스트 화합물을 선택합니다. 화합물 희석액을 경험적으로 측정한다. 예를 들어, 2mM 스톡 농도로 시작한 다음 8회 희석을 위해 1:3으로 연속적으로 희석합니다. 그런 다음 1:20을 효소 분석에 희석하여 100μM 최고 용량을 산출합니다.<ol><li>곡선 그리기: 최소 제곱 회귀를 사용하여 데이터 분석 소프트웨어(GraphPad Prism)에서 용량-반응 억제 곡선(3.10단계의 억제 백분율 값 사용)을 피팅하고 각 화합물에 대한 IC50 값을 도출합니다(그림 4).</li>
	</ol></li>
	<li>아세틸-CoA와의 아세틸화 반응:<ol><li>이를 사용하여 4-펜티노일-CoA 대신 네이티브 보조 인자 아세틸-CoA로 효소 활성을 확인합니다. 3.1-3.2단계에서 설명한 대로 4-펜티노일-CoA 대신 아세틸-CoA를 사용하여 HAT4 아세틸화 분석을 수행합니다.</li>
		<li>반응 생성물을 니트로셀룰로오스 멤브레인(1-2μL)에 놓고 건조시킨 다음 항-H4-라이신-12-아세틸 또는 항-H4-라이신-5-아세틸 항체로 도트 블롯합니다. 밀도 측정법으로 면역블롯 신호를 정량화합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

HAT1 효소 활성을 스크리닝하기 위한 클릭 기반 분석 개발

<ol><li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li>
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<li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li>
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<li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li>
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<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967(2021).</li>
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</ol>

당사는 HAT1 아세틸 클릭 분석법(PCT/US20/29395)을 기술하는 특허를 출원했습니다. J.J.G.는 Sharma Therapeutics, LLC 및 Guidepoint와의 컨설팅 계약 및 Hummingbird Biosciences의 연구 지원(그의 기관)을 보고합니다.

지난 10년 동안 클릭 화학이 두각을 나타내면서 상호 작용하는 화학 구조의 정밀한 설계가 가능해졌습니다. 이러한 맥락에서, 다양한 생체 직교 공유 연결(bioorthogonal covalent connections)21 은 자연 환경에서 복합체를 형성하기 위한 유망한 옵션으로 등장했다. 클릭 화학은 일반적으로 "클릭 반응"으로 알려진 빠르고 선택적인 반응을 나타내는 작용기 쌍을 사용합니다. 이러한 반응은 환경 친화적이고 부드러운 수성 조건에서 효율적으로 발생합니다. 여기에서, 우리는 HAT1 아세틸전이효소 활성을 식별하고 특성화하기 위해 설계된 플랫폼의 개발을 제시한다24. 이 플랫폼은 클릭 케미스트리로 구현되는 고처리량 펩타이드 기반 효소 분석을 활용합니다.
이 분석의 주요 장점 중 하나는 박테리아 공급원이 아닌 인간 세포 정제에서 얻은 인간 HAT1/Rbap46 효소 복합체에 의존한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 펩타이드 기질의 효소 활성을 직접 측정하여 비특이적 억제에 취약할 수 있는 결합 반응의 필요성을 제거합니다. 효소 활성21을 평가하기 위해 항체 기반 방법을 사용할 수 있지만, 아세틸 클릭 분석은 생물학적 변동성 및 항체 관련 비용을 방지함으로써 뚜렷한 이점을 제공합니다. 또한 96웰 플레이트에서 고처리량 기능을 성공적으로 검증하여 광범위한 화학 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 클릭 화학 접근법은 다른 아세틸전이효소와 함께 사용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 재조합 아세틸전이효소는 펩티드 아실화를 유도하기 위해 4-펜티노일-CoA와 함께 천연 기질을 모방하는 다른 히스톤 펩티드와 함께 배양될 수 있습니다. 그런 다음 펩타이드 결합, 기능화 및 amplex 적색 산화에 대한 후속 분석 단계를 신속하게 조정할 수 있습니다. 분석 정량화를 허용하기 위해 표준 곡선에 대한 적절한 양성 및 음성 대조군을 설계하는 데 주의를 기울여야 합니다.
분석의 특정 제한 사항을 염두에 두어야 합니다. 첫째, 이 프로토콜은 HAT1에 최적화되어 있지만, 모든 아세틸전이효소가 펜티노일-CoA를 아세틸-CoA 모방체로 받아들일 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 추가적인 아실-공여체 분자의 개발은 고려될 수 있거나(26), 또는 촉매 포켓의 돌연변이 유발이 클릭-호환 보조-인자(27,28)의 수용을 허용하기 위해 요구될 수 있다. 둘째, 클릭 가능 보조 인자에 대한 친화도는 자연 보조 인자와 다를 수 있으므로 항체 기반 검출과 같은 결과를 확인하기 위해 2차 후속 분석을 사용하는 것이 좋습니다(3.12단계 참조). 마지막으로, 결과를 확인하기 위해 추가적인 확증적 효소, 생물물리학 및 세포 분석을 수행해야 합니다. 단백질 복합체에 대한 소분자 결합은 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 기기(예:29)로 확인할 수 있습니다.
분석이 원활하게 진행되고 해당 결과가 정확한지 확인하기 위해 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 293f 세포의 기하급수적인 성장은 우수한 단백질 발현을 달성하기 위해 DNA transfection 전후에 분명해야 합니다. transient transfection 시스템에서 높은 단백질 발현을 생성하는 플라스미드(예: 여기에 사용된 pHEK-293 plasmid)를 사용해야 합니다. HAT1 효소는 이 의정서에 있는 forskolin에 의해 활성화됩니다, 그러나 유사한 결과는 orthovanadate로 달성되었습니다, post-translational 수정이 HAT1 활동을 위해 필요하다는 것을 건의하. 정제된 HAT1/Rbap46 효소 제제는 비교적 안정적이며 효소 활성의 손실 없이 동결/해동 주기에서 살아남을 수 있음을 관찰했습니다. 그러나 효소 분취액을 소량으로 냉동하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 한 번 이상의 동결/해동 주기 후에 효소를 사용하지 않습니다.
아세틸 클릭 분석 중에는 항상 삼중 대조 반응을 포함하는 것이 중요합니다: DMSO 처리 반응은 음성 대조군으로, H4K12CoA 처리 반응은 각각 효소 억제에 대한 양성 대조군 역할을 합니다. DMSO 처리된 효소 반응 형광 값은 신호 포화를 피하기 위해 25-50% 양성 Pra 펩타이드 사이의 선형 표준 곡선에 있어야 합니다. 이를 위해서는 약물 검사 전에 대조 반응에서 HAT1/Rbap46 효소의 양을 신중하게 적정해야 할 수 있습니다. 예를 들어, HAT1/Rbap46 효소는 EB에서 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 및 1:100으로 희석한 다음 아세틸 클릭 반응에 사용하여 Pra 펩타이드의 25%-50% 사이의 신호를 생성하는 데 필요한 효소의 양을 결정할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 100nM 효소로 충분하지만 효소의 새로운 각 준비에 대해 경험적으로 결정해야 한다는 것을 발견했습니다. 스트렙타비딘-HRP와 스트렙타비딘을 혼합하는 목적은 암플렉스 산화 신호를 감소시키는 것입니다. 스트렙타비딘의 희석은 필요에 따라 출력 신호로 조정할 수 있습니다. 빠른 신호가 생성되면 신호 포화를 피하기 위해 30분 전에 플레이트를 읽어야 할 수도 있습니다. 초기 분석 최적화 중에는 5분, 15분, 30분에 판독하는 것이 좋습니다. 직렬 읽기는 신호에 영향을 주지 않고 수행할 수 있습니다. 분석이 잘 보정된 경우 5분에서 30분 사이에 생성된 amplex 적색 신호는 선형적으로 확장되어야 합니다.

수많은 진핵 아세틸 전이 효소 중에서, HAT1은 1,2,3 분리 될 초기 히스톤 아세틸 전이 효소였습니다. 후속 연구는 염색질 복제, 특히 S상4단계 동안 새로운 뉴클레오솜 합성에서 중추적인 역할을 확고하게 확립했습니다. 우리의 연구 노력은 HAT1이 유방 세포의 표피 성장 인자(EGF) 치료에 의해 매우 자극된다는 것을 인식하게 했다5. 또한, HAT1은 생체 내 빠른 세포 증식 및 종양 형성에 필요하다는 것이 밝혀졌습니다 6,7,8,9. 데이터에 따르면 HAT1은 세포 분열을 위한 동화 작용 및 후성유전학적 과정을 조정하여 종양 성장을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다.
HAT1은 히스톤을 결합하고 아미노 말단을 HAT1에 제시하는 샤페론 단백질 Rbap46과 복합체로 라이신 5 및 12에서 히스톤 H4의 아미노 말단 꼬리를 디 아세틸화합니다. 히스톤 사량체 또는 디솜(10)은 HAT1/Rbap46 및 다른 히스톤 샤페론(11)과 함께 핵으로 수입된다. 그런 다음 히스톤은 복제 포크 또는 유전자 활성화 또는 억제를 지원하기 위해 다른 부위에 기탁되도록 방출됩니다. 히스톤 H4에 대한 HAT1 디 아세틸화 표시의 기능은 완전히 이해되지 않았습니다. H15가 염색질에 삽입 된 후 히스톤 탈아 세틸 화제 12,13,14,15의 작용에 의해 30-4 분 이내에 빠르게 제거 될 가능성이 높습니다. 따라서, HAT1 디-아세틸화 표시는 염색질에서 증식되지 않으며, 초기 염색질에 대한 염색질 변형 효소의 모집에 대한 역할이 가정되었지만, 진정한 후성유전학적 역할을 하지 않을 수 있다12. 또한 HAT1은 염색질을 직접 아세틸화하지 않습니다. 그 활성은 용해성 히스톤으로 제한됩니다.
저분자 히스톤 아세틸전이효소 억제제의 개발은 비특이적이고 처리량이 낮은 분석에 의해 방해를 받아 종종 생물학적 반응성 화합물16,17의 생성을 초래합니다. 아세틸전이효소 활성을 측정하기 위한 골드 스탠다드 분석에는 처리량이 제한되고 방사선이 필요한 3H-아세틸-coA를 사용해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 최근에는 CBP/p30018 및 KAT6A/B19,20을 표적으로 하는 특이적이고 매우 강력한 저분자 아세틸전이효소 억제제가 3 H-아세틸-CoA의 사용을 통해 기술되고 확인되었습니다. 앞으로 더 나은 처리량을 달성하고 실험실 위험을 피하기 위한 개선된 분석법이 고안되고 있습니다.
아세틸화 모니터링(acetylation monitoring)21 의 최근 발전은 효소 반응 모니터링을 가능하게 하기 위해 클릭 화학(click chemistry)을 사용하였다. 간단한 합성 경로로 접근하거나 효소 반응에 통합할 수 있는 구매가 가능한 다양한 클릭 기반 전구체가 있습니다. 이러한 반응은 전형적으로 재조합 시스템에서 수행되지만, 세포 기반 분석도 가능하다22. 클릭 가능 보조 인자 및 기질의 장점은 스크리닝이 종종 스크리닝 화합물에 의해 교란되고 추가 처리 단계가 필요한 결합된 판독 시스템 없이 효소 활성을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 효소 단계에서만 억제제 처리가 가능한 반면, 모든 다운스트림 기능화 및 검출 단계는 화합물을 제거하기 위해 광범위한 세척 후에 수행되므로 분석 간섭이 발생할 가능성이 제한됩니다. 이러한 장점으로 인해 클릭 기반 분석의 설계는 일반적으로 유리 코엔자임 A의 검출에 의존하는 결합 분석보다 선호됩니다.
한 가지 중요한 고려 사항은 클릭 가능 보조 인자를 효소 활성 부위에 수용하는 것입니다. 기존의 클릭 지원 보조 요인은 기본 보조 요인에 최적화된 활성 사이트와 완전히 호환되지 않을 수 있습니다. 구조 정보 및 모델링은 변형된 기질(23)을 통합하기 위해 활성 부위를 확대하기 위한 아미노산 치환을 설계하는데 사용될 수 있다. 이를 통해 향상된 효소 역학과 더 낮은 기질 및 효소 수준으로 스크리닝할 수 있습니다. 이 접근법의 단점은 변형된 촉매 포켓이 네이티브 효소와 강하게 상호 작용하는 억제제를 식별하지 못할 수 있다는 것입니다. 궁극적으로, 잠재적인 효소 억제제를 식별하고 검증하기 위해서는 다양한 접근법의 조합이 필요합니다.
여기에서는 클릭 보조 인자 4-펜티노일-CoA24를 사용하여 HAT1 효소 활성을 정제하고 분석하기 위해 개발된 방법을 설명합니다. 이 분석법(그림 1)은 효소 활성을 높이는 것으로 밝혀진 필수 파트너 단백질 Rbap46과 복합체의 네이티브 효소 서열을 사용합니다. 인간 세포에서 효소를 정제하면 셀룰로에서 효소가 활성화되어 완전한 효소 활성에 중요한 자극적인 번역 후 변형을 보존할 수 있습니다. 고처리량 화학 스크리닝을 위한 재조합 효소 분석의 설계 및 최적화는 HAT1 저분자 억제제를 식별하고 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>4P CoA</td><td>Cayman Chemical</td><td>10547</td><td>Click chemistry co-factor</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Fisher Sci</td><td>A12222</td><td>형광 기질</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Azide</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64996MC</td><td>Click 화학</td></tr><tr><td>구리 황산염</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7758-98-7</td><td>클릭 화학</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 67-68-5</td><td>희석제</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Acros Organics</td><td>03-12-3483</td><td>환원제</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>VWR</td><td>102987-310</td><td>단백질 발현</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>Media</td></tr><tr><td>Freestyle 293-F cells</td><td>Thermo Fisher</td><td>R790-07</td><td>단백질 발현</td></tr><tr><td>H4-펩타이드/1-23-GGK-비오틴</td><td>Anaspec</td><td>AS65097</td><td>펩타이드 기질</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7365-45-9</td><td>EB 버퍼</td></tr><tr><td>과산화수소 30% 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; Z00183-99-0</td><td>개시</td></tr>제 <tr><td>M2 FLAG 항체 슬러리</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A2220</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Macrosep 10K 필터 (Pall Lab)</td><td>VWR</td><td>89131-980</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Neutravidin Plate</td><td>Thermo Sci</td><td>15127</td><td>BSA-pre-blocked</td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL)</td><td>MP 생물 의학</td><td>198596</td><td>20x 완충액</td></tr><tr><td>pHEK-293 플라스미드</td><td>Takara Bio</td><td>3390</td><td>단백질 발현</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; Z00082-33-6</td><td>세척 버퍼</td></tr><tr><td>프라 펩타이드</td><td>Genscript</td><td>맞춤형 합성</td><td>비오틴화</td></tr><tr><td>아스코르브산 나트륨 시</td><td>그마-알드리치</td><td>&nbsp; 134-03-2</td><td>클릭 화학</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; 7647-14-5</td><td>EB 버퍼</td></tr><tr><td>소듐 포스페이</td>트 <td>VWR International</td><td>7558-80-7</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>스트렙타비딘</td><td>EMD 밀리포어</td><td>189730</td><td>경쟁사</td></tr><tr><td>스트렙타비딘-HRP</td><td>세포 신호</td><td>3999S</td><td>효소</td></tr><tr><td>THPTA 리간</td><td>드 Fisher Sci</td><td>1010-500</td><td>클릭 화학</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; 77-86-1</td><td>20x 버퍼</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 9002-93-1</td><td>EB 버퍼</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>세척 버퍼</td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>57-13-6</td><td>담금질</td></tr></tbody></table>

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

히스톤 아세틸전이효소 1(Histone acetyltransferase 1)이라고도 하는 HAT1은 뉴클레오솜 조립 전에 초기 H4를 안정화하고 아세틸화하여 염색질 합성에 중요한 역할을 합니다. 다양한 시스템에서 종양 성장에 필요하므로 암 치료의 잠재적 표적이 될 수 있습니다. HAT1 효소 활성을 억제할 수 있는 화합물의 식별을 용이하게 하기 위해 당사는 신속한 스크리닝을 위한 아세틸 클릭 분석을 고안했습니다. 이 간단한 분석에서는 활성화된 인간 세포에서 정제된 재조합 HAT1/Rbap46을 사용합니다. 이 방법은 클릭 화학 접근 방식에서 아세틸-CoA 아날로그 4-펜티노일-CoA(4P)를 활용합니다. 여기에는 HAT1 의존성 아실화 반응을 통해 비오틴화된 H4 N-말단 펩타이드로 알카인 핸들의 효소 전달이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 펩타이드를 뉴트라비딘 플레이트에 고정시킨 후 비오틴-아지드로 클릭 화학 기능화를 수행합니다. 그 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 모집을 사용하여 amplex red를 산화시켜 정량적 형광 출력을 생성합니다. 아실화 반응 중에 화학적 억제제를 도입하면 형광 신호의 감소를 기반으로 효소 억제를 정량화할 수 있습니다. 중요한 것은 이 반응이 확장 가능하여 HAT1 효소 활성에 대한 잠재적 억제제의 고처리량 스크리닝이 가능하다는 것입니다.

중복된 표준 곡선(16웰)은 적절한 분석 성능을 보장하기 위해 모든 플레이트에 포함되어야 합니다. 표준 곡선 데이터는 용액 내 Pra 함유 펩타이드와 네이티브 H4 펩타이드의 비율에 따라 100%에서 0% 범위의 표 형식으로 설정해야 합니다(표 1). Amplex 적색 신호는 100% pra/0% 천연 H4 펩타이드 웰에서 가장 높고, 0% pra/100% 천연 H4 펩타이드 웰에서 가장 낮습니다. 형광이 검출되고 웰의 평균을 구한 후, 50% Pra 이상의 농도에서 신호의 포화를 관찰할 수 있지만 결과 표준 그래프는 직선에 맞아야 합니다(그림 2). Pra를 H4 대조군 펩타이드에 부적절하게 혼합하면 amplex 적색 신호가 거의 또는 전혀 발생하지 않거나 0-50% Pra 사이에서 amplex 적색 신호의 비선형 변화가 발생할 수 있습니다. 적절한 신호 및 곡선 결과는 클릭 화학 반응이 발생했음을 나타내며 그에 따라 데이터를 분석할 수 있습니다.
DMSO 처리 반응은 각각 음성 대조군으로, H4K12CoA 처리 반응은 효소 억제를 위한 양성 대조군 역할을 합니다. 이들은 강력한 분석 성능을 보장하고 억제율 계산을 허용하기 위해 모든 플레이트에 포함되어야 합니다. 1μM의 H4K12CoA를 함유하는 양성 대조군 웰은 0% Pra/100% H4 펩타이드 웰과 유사한 낮은 amplex 적색 신호를 가져야 합니다. DMSO를 함유한 음성 대조군 웰은 50% Pra/50% H4 펩타이드가 있는 웰의 형광 출력과 유사한 신호를 가져야 합니다. 테스트 화합물 웰에는 다양한 amplex 신호가 포함됩니다. 평균 중복 또는 삼중은 표준 오차가 있는 신호의 평균값을 구하기 위해 잘 작동합니다.
위의 공식을 사용하여 효소 억제를 계산하며, 여기서 D 는 DMSO 형광 출력, X 는 실험 출력, BG 는 효소가 없는 H4 펩타이드의 출력 또는 표준 곡선의 0% 웰입니다. 테스트 화합물이 효소 활성을 억제하는 경우 테스트 화합물 반응의 형광 출력은 DMSO보다 작으며 양성 억제 백분율 값을 초래합니다. 반대 효과는 효소 억제가 발생하지 않은 반응에서 볼 수 있습니다. 두 가지 농도(1μM 및 10μM)에서 스크리닝된 테스트 화합물의 예제 데이터가 그림 3에 나와 있습니다. 화합물의 연속 희석은 이 분석을 사용하여 테스트할 수도 있으며, 여기서 화합물의 IC50 은 데이터의 비선형 곡선 피팅으로 찾을 수 있습니다(그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig01.jpg"> 그림 1: HAT1 아세틸화/아실화 클릭 화학 개략도. HAT1 아세틸화 클릭 반응은 비오틴화 히스톤 H4 펩타이드, 4-펜티노일-CoA 및 테스트 화합물이 포함된 용액에서 정제된 HAT1 및 Rbap46 단백질로 발생합니다. 반응이 완료된 후 용액은 중성탄으로 코팅된 플레이트에 결합되고 황산구리와 비오틴-아지드화물을 사용한 클릭 케미스트리가 완료됩니다. 스트렙타비딘-HRP와 앰플렉스 레드를 최종적으로 첨가하면 적색 형광등이 출력됩니다. amplex 적색 형광 강도를 비교하여 HAT1 아세틸화 활성을 결정합니다. 이 그림은 Gaddameedi et al.24의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig02.jpg"> 그림 2: 표준 곡선의 예. 각 쌍에 대한 표준 곡선 값의 평균을 구한 후, 양성 대조군 Pra 펩타이드 비율에 대한 SEM± 평균을 그래프로 표시합니다. 결과 곡선은 표시된 곡선과 유사해야 하며 선형 선에 맞아야 합니다. 이 분석은 검출 한계(LOD)가 1.8% ± 0.89%이고 정량 한계(LOQ)가 5.4% ± 3.1%24입니다. 표준 곡선은 Pra 백분율&gt;50%에 대해 포화될 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig03.jpg"> 그림 3: 새로운 화합물을 세 배로 테스트합니다. 아세틸 클릭 분석은 새로 합성된 화합물의 억제 활성을 평가하는 데 사용되었습니다. 화합물을 10μM 및 1μM로 희석하여 중앙값을 표시한 삼중 테스트를 실시하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig04.jpg"> 그림 4: HAT1 아세틸 클릭 분석에서 테스트 화합물의 연속 희석. 화합물을 100μM에서 0.01μM로 희석하고 중복하여 테스트했습니다. 결과 용량 곡선은 화합물 A와 C가 여러 희석에 대해 HAT1 활성을 거의 100% 억제한다는 것을 보여줍니다. 그런 다음 추가 실험에 사용할 화합물의 IC50 을 계산하기 위해 데이터를 사용했습니다. 데이터는 중복 실험의 평균 ± SEM입니다. 비선형 피팅에 대한 R2 값은 화합물 A, B, C에 대해 각각 0.84, 0.78, 0.94입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>% 포지티브 컨트롤</td>
			<td>양성 대조군 펩타이드[2.5 rxns] DMSO(알카인 함유)에서 0.1mg/mL로 희석된 "PRA"</td>
			<td>DMSO에서 0.1mg/mL로 희석된 H4 펩타이드[2.5 rxns]</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>2.5 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>75</td>
			<td>1.875 마이크로리터</td>
			<td>0.625 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>1.25 마이크로리터</td>
			<td>1.25 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0.625 마이크로리터</td>
			<td>1.875 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>1.25 μL (1:10에서)</td>
			<td>1.25 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL (1:10의 경우)</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr><tr><td>합계</td>
			<td>8.5 μL</td>
			<td>25.5 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Pra control 펩타이드를 H4 펩타이드로 희석. 표준 곡선을 만드는 데 사용되는 양성 대조군 "Pra" 펩타이드 대 H4 펩타이드의 비율. Pra 스톡을 DMSO에서 4mg/mL로 처음 재현탁시킨 후 DMSO에서 최종 농도 0.1mg/mL로 1:40으로 희석해야 합니다. 비오틴화된 H4 펩타이드는 DMSO에서 0.1mg/mL(34.8μM)로 희석해야 합니다. 그런 다음 각 펩타이드를 표시된 비율로 함께 혼합해야 합니다. 각 표준물질은 96웰 플레이트에 중복으로 추가됩니다. 형광 출력 값은 표준 곡선을 만들기 위해 함께 평균화되어야 합니다.

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

당사가 개발한 아세틸 클릭 분석은 뉴클레오솜 통합 전에 H4 히스톤을 분리하는 데 중요한 HAT1 아세틸 전이효소 활성을 평가하는 도구 역할을 합니다. 당사는 HAT1 효소에 대한 저분자 억제제의 고처리량 스크리닝에 이 방법을 사용하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 펩타이드 기질에서 직접 효소 활성을 측정합니다.이는 생물학적 변동성 및 항체 관련 비용을 방지함으로써 다른 효소 분석에 비해 이점을 제공합니다. 이것은 또한 높은 처리량이며 다른 아세틸 전이효소와 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. 우리는 최근에 세포와 동물에서 활성을 갖는 이 분석을 기반으로 한 저분자 HAT1 억제제를 발표했습니다.우리는 이 분석을 사용하여 추가 화학 라이브러리를 스크리닝하고 구조 활성 관계를 수행합니다. 우리는 히스톤 생성, 접힘, 채퍼로닝 및 염색질 통합을 추적하는 방법을 발전시키고 있습니다. 이는 생물학적 메커니즘을 탐구하고 약물 발견을 촉진하기 위해 개선된 화학 도구의 필요성을 강조합니다.우리의 목표는 히스톤 생산을 표적으로 하는 것이 암과 같은 질병에 대한 치료 효과가 있을 수 있음을 입증하는 것입니다.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 프로토콜은 시르투인에 대한 특정 탈아세틸화 기질로서 단백질의 역할을 확립하고 번역 후 변형으로서의 가역적 라이신 아세틸화의 역할을 추가로 연구하기 위해 시험관 내 및 생체 내 탈아세틸화 분석을 실행하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

탈 아세틸 화 분석법은 시르 투 인 사이의 상호 작용 (SIRT2) 및 특정 단백질 기판을 해명

현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

이 문서의 목적은 acetylated 히스톤 잔류물의 정량화와 H3 및 H4 히스톤의 효율적인 정화를 종합적이 고 체계적인 가이드를 제공 하는 것입니다.

H3 및 H4 히스톤 단백질 및 세포와 뇌 조직 Acetylated 히스톤 부호의 부 량의 정화

클래스 1 히스톤 디 아 세 틸 아 제 (hdacs) 같은 rpda는 곰 팡이 감염을 치료 하는 잠재적인 대상으로 중요성을 얻고 있다. 여기에서 우리는 히스톤 데 아 세 틸 제 억제제의 시험관 내 효능 테스트를 허용 하는 hdac 활성 분석을 결합 한 탭 태그 rpda의 특정 농축을 위한 프로토콜을 제시 합니다.

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

지방 아실화에 대한 연구는 세포 단백질 상호 작용 및 질병에 중요한 영향을 미칩니다. 여기에 제시된 것은 지방 아실화 단백질의 클릭 화학 검출을 개선하기위한 변형 된 프로토콜이며, 이는 다양한 세포 유형에 적용될 수 있으며 펄스 체이스 및 질량 분광법을 포함한 다른 분석과 결합 될 수 있습니다.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

학습하세요 아세틸 클릭 화학 분석을 통해 HAT1 히스톤 아세틸전이효소 활성을 측정하는 방법을. 이 기법은 고처리량 스크리닝을 통해 소분자 억제제를 효율적으로 선별할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구입니다.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

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