CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성
April 11th, 2025
CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.
우리의 연구는 포유류 프로그램 세포 사멸에 중점을 두고 있으며, 특히 고혈당증의 맥락에서 세포사멸과 괴사증 사이의 균형을 연구합니다. 가장 최근에는 세포 사멸 단백질 RIP1 키나아제가 괴사 동안 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 우리의 현재 실험 과제는 현탁액에서 성장하는 면역 세포를 유전적으로 조작하는 것, 특히 CRISPR-Cas9를 사용하여 RIP1 키나아제 유전자를 녹아웃하는 것입니다.
우리의 프로토콜은 두 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 렌티바이러스를 이용하여 현탁액으로 성장하는 면역세포의 형질감염 방법을 개선하고, CRISPR-Cas9를 이용하여 유전적 녹아웃을 생성하는 과정에서 단세포 클로닝의 필요성을 없애고, 우리의 결과는 괴사증의 고혈당 변화에서 RIP1 키나아제의 역할을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 렌티바이러스 벡터가 포함된 사분면 줄무늬를 시작하려면 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 보충된 Luria-Bertani 또는 LB 한천 플레이트에 RNA를 안내합니다.
플레이트의 가장 묽은 영역에서 개별 콜로니가 보일 때까지 섭씨 37도에서 1-2일 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 선택하고 50밀리리터 원뿔형 튜브에 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램을 보충한 LB 국물 5밀리리터에 첨가합니다. 튜브 캡을 통풍시키고 테이프로 감습니다.
튜브를 섭씨 37도 및 225RPM의 궤도 셰이커에서 8시간 동안 배양합니다. 한편, 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램을 보충한 LB 국물 40밀리리터를 50밀리리터 튜브 4개에 넣습니다. 배양 후, 성장한 배양액 40마이크로리터를 4개의 튜브 각각에 옮깁니다.
튜브의 캡을 통풍시키고 테이프로 감은 후 섭씨 37도 및 225RPM의 궤도 셰이커에서 12-16시간 동안 배양합니다. 다음날, 스윙 버킷 로터에서 3, 220 x g의 배양액을 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기물 비커에 디캔팅하고 4개의 펠릿을 모두 암피실린을 보충한 10밀리리터의 LB 국물에 결합합니다.
결합된 펠릿을 스윙 버킷 로터에서 최대 속도로 20분 동안 원심분리하여 단일 펠릿을 얻고 가능한 한 많은 상청액을 폐기물 비커에 버립니다. HEK293T 세포를 6개의 10배의 3배 내지 5배의 농도로 DMEM이 들어 있는 T25 플라스크에 시드합니다. 플라스크를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다.
한편, 1:1:1:1 비율의 플라스미드 및 환원된 혈청 배지로 플라스미드 DNA에 대한 형질감염 시약의 3:1 비율을 사용하여 형질감염 혼합물을 준비합니다. 형질감염 시약 75마이크로리터, 환원 혈청 배지 2, 500마이크로리터, 총 플라스미드 DNA 25마이크로그램을 혼합한다. 혼합물을 실온에서 15-30분 동안 배양합니다.
다음으로, 형질감염 혼합물을 배지가 들어 있는 플라스크의 합류 HEK293T 세포에 조심스럽게 피펫팅합니다. 혼합물의 적절한 균질화를 보장하기 위해 플라스크를 부드럽게 휘젓고 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 배양 2일 후, 생산자 HEK293T 세포 플라스크에서 배지를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
튜브를 800 x g에서 5분 동안 원심분리하여 나머지 HEK293T 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 함유한 모든 바이러스를 조심스럽게 제거하고 새 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. U937 세포 현탁액의 필요한 부피를 계산하고 계산하여 2 x 10의 펠릿을 6셀의 거듭제곱으로 얻습니다.
그런 다음 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브에 400 x g으로 10분 동안 원심분리하고 상청액을 디캔팅하여 세포 펠릿을 튜브에 남겨둡니다. 세포 펠릿을 상청액을 함유한 바이러스에 재현탁하고 튜브를 290 x g으로 60분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 피펫을 사용하여 튜브에 상청액이 포함된 바이러스와 함께 펠릿을 재현탁합니다.
튜브를 끝 회전 장치에 60분 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 400 x g에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 포함하는 바이러스와 10% 열 비활성화 FBS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배지의 1:1 비율로 펠릿을 재현탁합니다. 세포 혼합물을 새로운 T25 조직 배양 플라스크로 옮기고 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다.
배양 후, U937 세포를 400 x g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 10% 열 비활성화 FBS와 푸로마이신 밀리리터당 5마이크로그램을 보충한 완전한 RPMI 1640 배지로 펠릿을 재현탁합니다. 세포 배양을 T25 플라스크로 옮깁니다.
세포를 섭씨 37도에서 2-3주 동안 배양하고 1-2일마다 세포에 성장 징후가 있는지 확인합니다. 웨스턴 블롯 분석은 야생형 및 비표적 대조군 세포의 강한 신호와 비교하여 검출 가능한 신호가 없는 RIP1 CRISPR 돌연변이 세포에서 RIP1 단백질 발현의 손실을 확인했습니다. TCZ로 처리하면 야생형 및 비표적 대조군 세포에서 상당한 괴사 세포 사멸이 유도되었으며, 이는 네크로스타틴-1s 처리에 의해 역전되었습니다.
대조적으로, RIP1 CRISPR 녹아웃 세포는 네크로스타틴-1의 효과가 없는 야생형 및 비표적 대조군 세포에 비해 유의하게 낮은 세포 사멸을 보여 RIP1 기능의 상실을 나타냅니다. 살아있는 세포 형광 현미경은 TCZ 처리 후 야생형 및 비표적 대조군 세포에서 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 생산이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 네크로스타틴-1s 처리 시 감소했습니다. RIP1 CRISPR 녹아웃 세포는 네크로스타틴-1s 처리의 관찰 가능한 효과 없이 최소한의 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 생성을 나타냈습니다.
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개요
본 연구는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 수용체 상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 만드는 데 주목합니다. 그것은 CRISPR의 유용성을 강조하면서 특정 실험 조건에서 발생할 수 있는 합병증에도 초점을 맞추고 있습니다.
주요 연구 구성요소
연구 분야
- 유전학
- 세포 생물학
- 신호전달 경로
배경
- 유전자 변형에서의 CRISPR/Cas9의 중요성
- 세포 신호전달에서의 RIPK1의 역할
- CRISPR 응용에서 직면한 도전 과제
사용된 방법
- CRISPR/Cas9 유전자 편집
- 인간 세포주 생합성
- 녹아웃 효과성 분석
주요 결과
- RIPK1 녹아웃 세포주의 성공적인 생성
- 유전자 편집 중 직면한 도전 과제의 식별
- 미래 연구에 대한 함의에 대한 논의
결론
- 본 연구는 특정 유전자 녹아웃을 만드는 데 있어서 CRISPR/Cas9의 효과를 입증합니다.
- RIPK1에 대한 이해를 돕고 유전자 연구에서의 실험 도전 과제를 해결할 필요성을 강조합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated knockout of RIP1 in U937 cells enables precise interrogation of cell death pathways, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This capability strengthens predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions for programs focused on regulated cell death. The approach is adaptable for functional genomics across diverse cell death regulators, enhancing translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional validation of RIP1 as a cell death regulator.
- Supports mechanistic de-risking by isolating RIP1-dependent pathways.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of necroptosis and related mechanisms.
- Provides a platform for evaluating the impact of gene knockout on cellular phenotypes.
Screening & Assay Development
- Generates validated knockout cell lines for downstream viability and ROS assays.
- Improves assay reproducibility by standardizing genetic backgrounds.
- Enables quantitative assessment of cell death and mitochondrial ROS outputs.
- Supports scalable screening of compounds targeting cell death pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cell death mechanisms.
- Provides continuity from genetic perturbation to functional phenotypic readouts.
- Enables risk-adjusted advancement of cell death modulators into preclinical models.
- Supports identification of translational biomarkers linked to RIP1 activity.
Pipeline & Workflow Integration
This knockout workflow integrates at the early discovery and target validation stages, providing a foundation for lead identification and preclinical evaluation of cell death modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of RIP1 function in cell death.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell systems for quantitative viability and ROS assays.
- Analytics: Enables robust measurement of cell death and mitochondrial ROS as functional readouts.
- Translational Research: Bridges genetic perturbation with disease-relevant phenotypes for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable knockout platform adaptable to other cell death regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death research.
- Operational Value: Standardizes knockout generation and functional validation workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell death-targeted programs and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and functional pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design and lentiviral delivery.
- Needs access to fluorescence microscopy and viability assay platforms.
- Demands rigorous validation of knockout efficiency and functional loss.
- May require adaptation for other cell lines or death regulators.
- Potential pitfalls include off-target effects and incomplete knockout, as addressed in the protocol.
