Name: 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 HEK-293 세포에서 면역침전을 이용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을. DYKDDDDK-PRDM16과 HA-EHMT1 결합 확인을 통해 갈색 및 베이지 지방 발달의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 일본 과학 진흥회(JSPS) KAKENHI 보조금 번호 19K18008(G.N.), JSPS KAKENHI 보조금 번호 22K16415(G.N.), JSPS KAKENHI 보조금 번호 22K08672(H.O.), 일본 당뇨병 학회 젊은 연구자를 위한 연구 보조금(G.N.), MSD 생명과학재단 젊은 연구자를 위한 연구 보조금(G.N.)의 지원을 받았습니다.

그림 1 은 프로토콜의 개요를 보여줍니다.
1. 용액 및 완충액의 준비
<ol><li>단백질 용해 완충액: 이전에 발표된 보고서7 (표 1)에 따라 단백질 용해 완충액을 준비합니다.</li>
	<li>단백질 용해 완충액 + 프로테아제 억제제(PI): 프로테아제 억제제( 재료 표 참조)를 위에서 준비된 완충액(단계 1.1)에 추가합니다. -20 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>시료 완충액: 900μL의 4x Laemmli 시료 완충액( 재료 표 참조)과 100μL의 2-메르캅토에탄올을 혼합합니다. -20 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(PBS-P)와 인산염 완충 식염수(PBS): PBS 1.998L와 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 2mL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 실온에서 보관하십시오.</li>
	<li>1x Tris/Glycine/SDS 완충액: DDW 450mL와 10x Tris/Glycine/SDS 50mL를 혼합합니다. 사용 당일은 상온에서 준비하십시오.</li>
</ol>2. 플라스미드 transfection
<ol><li>10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 단위/mL 페니실린 G 및 10,000 μg/mL 스트렙토마이신)을 함유한 Dulbecco의 변형 독수리 배지를 사용하여 10cm 콜라겐 코팅 접시에서 하위 합류점(80%-95%)으로 HEK-293 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>접시당 1-10 μg의 plasmid7 을 transfection하고 transfection mix를 만듭니다. 접시당 250μL의 최종 부피에 150mM NaCl을 추가합니다. 혼합물을 소용돌이치게 하고 회전시킵니다.</li>
	<li>접시당 60μL의 1mg/mL 폴리에틸렌민(PEI, 재료 표 참조)을 추가한 다음 150mM NaCl을 PEI 용액 250μL의 최종 부피에 추가합니다.</li>
	<li>PEI 용액을 transfection mix에 추가하여 혼합 용액을 만듭니다. 즉시 소용돌이치고(3-5초 동안 최고 속도로, 그 후에도 동일한 수행) 스핀 다운합니다.</li>
	<li>실온에서 15-30분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 HEK-293 세포의 배지를 변화시킵니다.</li>
	<li>HEK-293 세포 접시 전체에 500 μL/접시의 혼합 용액을 뿌리고 하룻밤(13-14시간) 배양합니다.</li>
	<li>다음날 매체 교환을 실시하십시오.</li>
</ol>3. 세포 용해 및 시료 전처리
참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 가능한 한 샘플을 보존하거나 동결-해동하지 않고 후속 단계를 수행해야 합니다.
<ol><li>transfection 후 약 48시간 후에 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 3회 세척하고, 500 μL/접시의 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하고, 얼음 위에서 단백질 흡착이 적은 튜브에 세포 스크레이퍼와 피펫으로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>5분마다 소용돌이치고 10분 동안 얼음 위에서 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>16,400 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 채취하여 단백질 흡착이 적은 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 농도 측정 키트를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>각 샘플에서 동일한 양의 단백질 200-1000μg을 분리한 다음 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하여 총 부피를 500-1000μL로 조정합니다. 알림: 다음 단계는 얼음 위에서 수행됩니다.</li>
</ol>4. 슬러리의 제조
참고: 단백질 G 겔과 에피토프 태그 친화성 겔의 1:1 슬러리를 면역침전 전날 또는 당일에 준비합니다.
<ol><li>단백질 G 겔의 준비<ol><li>끝이 잘린 팁을 사용하여 잘 섞은 다음 단백질 G 겔( 재료 표 참조)을 분리하여 샘플당 20μL의 비드가 준비되도록 합니다.</li>
		<li>12,000 x g 에서 4 °C에서 20초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 1분 동안 비드를 얼음 위에 놓습니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.</li>
		<li>단계 4.1.2에서 준비한 단백질 G 겔에 단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 추가하고 탭하고 뒤집어서 혼합합니다. 4 °C에서 12,000 x g 에서 20 초 동안 원심 분리하고 비드를 얼음 위에 1 분 동안 올려 비드가 수평을 이루도록 한 다음 상층액을 버립니다.</li>
		<li>4.1.3단계를 세 번 반복합니다.</li>
		<li>단백질 G 겔에 동일한 부피의 단백질 용해 완충액을 추가하여 1:1 단백질 G 겔 슬러리를 만듭니다. 단백질 G 겔 슬러리는 4°C에서 약 1일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>epitope tag 친화성 겔의 제조<ol><li>끝이 잘린 팁을 사용하여 잘 저어준 다음 에피토프 태그 친화성 겔( 재료 표 참조)을 분리하여 샘플당 10-15μL의 비드가 준비되도록 합니다.</li>
		<li>5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 얼음 위에서 1분 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.</li>
		<li>단계 4.2.2에서 준비한 epitope tag affinity gel에 단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 추가하고 탭하고 뒤집어 혼합합니다. 4 °C에서 5,000 x g 의 원심분리기로 30초 동안 원심분리를 하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이룰 수 있도록 한 다음 피펫으로 상층액을 버립니다.</li>
		<li>4.2.3단계를 두 번 반복합니다.</li>
		<li>단계 4.2.4에서 준비한 에피토프 태그 친화성 겔에 500μL의 0.1M 글리신(pH 3.5)을 첨가하고 두드리거나 뒤집어 혼합합니다. 이 단계는 유리 에피토프 태그 항체를 제거하기 위해 수행됩니다. 글리신 첨가 후 20분 이내에 4°C에서 5,000 x g 으로 30초 동안 원심분리하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이루도록 한 다음 상층액을 버립니다.</li>
		<li>500단계에서 준비한 epitope tag affinity gel에 4.2.5μL의 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하고 탭하고 반전하여 혼합합니다. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이룰 수 있도록 한 다음 상층액을 버립니다.</li>
		<li>4.2.6단계를 세 번 반복합니다.</li>
		<li>동일한 부피의 단백질 용해 완충액을 에피토프 태그 친화성 겔에 추가하여 1:1 에피토프 태그 친화성 겔 슬러리를 준비합니다. 에피토프 태그 친화성 겔 슬러리는 4°C에서 약 1일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 단백질 G 겔로 사전 클리어링하고 에피토프 태그 친화성 겔로 단백질 복합체를 포획합니다.
<ol><li>1:1 단백질 G 슬러리(4단계에서 준비)를 절단 팁이 장착된 피펫과 혼합하고 한 번에 40μL를 샘플에 추가합니다.</li>
	<li>냉장 챔버(4°C)에서 사이클당 약 30초 내에 로테이터( 재료 표 참조)에서 1시간 동안 샘플을 회전시킵니다.</li>
	<li>12,000 x g 에서 4 °C에서 20초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 1분 동안 비드를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>상층액을 채취하여 단백질 흡착이 적은 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>5.4단계에서 주입용 시료를 시료에서 분리하여 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>20-30 μL의 1:1 에피토프 태그 겔 슬러리를 샘플에 추가합니다.</li>
	<li>냉장 챔버(4°C)에서 2시간 동안 사이클당 약 30초 동안 회전합니다.</li>
	<li>5.5단계에서 준비한 입력에 샘플 버퍼를 추가하여 4배로 희석하고 98°C에서 10분 동안 가열합니다. 입력은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 알림: 동결 및 해동으로 인한 단백질 분해 가능성 때문에 가능한 한 단백질을 보존하지 않고 후속 단계를 수행해야 합니다.</li>
</ol>6. 침전된 단백질을 세척하고 용출시키기
<ol><li>히트 블록의 온도를 98°C로 설정합니다.</li>
	<li>5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 얼음 위에서 1분 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.</li>
	<li>단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 넣고 두드리거나 뒤집어 섞습니다. 냉장 챔버(30°C)에서 사이클당 약 4초 동안 로테이터를 5분 동안 회전합니다. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리기를 하고 비드가 수평을 이룰 때까지 얼음 위에서 1분 동안 기다린 다음 상층액을 버립니다.</li>
	<li>6.3 단계를 5-10회 반복합니다.</li>
	<li>6.4단계에서 준비한 샘플에 10μL의 샘플 버퍼를 추가합니다. 98°C에서 10분 동안 끓입니다.</li>
	<li>4°C에서 5,000 x g 으로 30초 동안 원심분리기.</li>
	<li>단백질 흡착이 적은 새 튜브에 컬럼을 넣고 절단 팁이 있는 피펫을 사용하여 겔을 컬럼으로 옮깁니다. 겔의 오염을 방지하기 위해 컬럼이 사용됩니다.</li>
	<li>9,730 x g 에서 4 °C에서 1분 동안 원심분리기. 플로우 스루를 수집합니다. 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 참고: 샘플 분해가 우려되는 경우 동결하지 않고 다음 면역블로팅을 수행해야 합니다.</li>
</ol>7. 면역블로팅
참고: 면역블로팅 절차는 이전 보고서 7,8을 기반으로 합니다.
<ol><li>소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE, 재료 표 참조)에 전체 샘플을 로드합니다. 참고: 필요한 경우 전체 샘플이 전달될 수 있도록 대형 웰 젤을 사용하십시오. 여기에는 50μL 웰이 있는 겔이 사용되었습니다.</li>
	<li>전기영동 챔버에 겔을 놓고 겔 주위에 적절한 부피까지 1x Tris/Glycine/SDS 완충액( 재료 표 참조)을 추가합니다.</li>
	<li>100 V 및 400 mA에서 전기영동 겔.</li>
	<li>폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF, 재료 표 참조) 멤브레인으로 전사합니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 PBS-P의 5% 탈지유로 PVDF 멤브레인 블롯을 차단합니다.</li>
	<li>PBS-P로 셰이커에서 최고 속도로 5분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다. 그 후 세탁할 때도 동일한 절차를 수행하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 1차 항체( 재료 표 참조)가 있는 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음날 PBS-P로 멤브레인을 세 번 세척합니다.</li>
	<li>2차 항체를 쉐이커에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: 타겟 단백질의 분자량이 약 50kDa의 분자량을 갖는 IgG 중쇄에 가까운 경우, 경쇄 특이적 2차 항체를 사용하여 타겟 밴드와 IgG 중쇄의 중복을 방지할 수 있습니다. 이 연구는 IP 검출 시약으로 경쇄 특이적 항체7 또는 Veriblo을 사용했습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>peroxidase luminescent substrates를 가진 단백질 띠를 식별합니다. 멤브레인은 PBS-P로 두 번 세척한 후 PBS에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>스트리핑 용액으로 10분 동안 스트리핑합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>세 번 씻고 PBS-P에 5% 탈지유로 차단합니다. 그 이후의 프로토콜은 7.6단계 이후와 동일합니다.</li>
</ol>

Co-immunoprecipitation을 사용한 HEK-293 세포의 단백질 상호 작용 분석

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+from+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li>
<li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics%3B+current+achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li>
<li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLAG+peptide%2C+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemical+and+biophysical+methods%22%5BJournal%5D)">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li>
<li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+PPAR%CE%B1+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143(2023).</li>
<li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16%2FCtBP+transcriptional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li>
<li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li>
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<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243(2009).</li>
<li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+%28IP%29+coupled+with+LC-MS%2FMS+identification+of+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li>
<li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).</li>
</ol>

우리는 저자 중 누구도 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 이전에 보고된 프로토콜 5,7,14,15와 거의 유사합니다. 이 프로토콜의 중요한 점은 세포 용해 단계에서 면역침전 단계까지 실험을 중단하지 않는다는 것입니다. 단백질 분해는 PPI 검출을 방해합니다. 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기는 단백질을 분해합니다. SDS-PAGE에 있는 전기 이동법은 또한 단백질 강직을 극소화하기 위하여 뿐만 아니라 또한 PPI 탐지를 확대하기 위하여 immunoprecipitation의 동일한 날에 실행되어야 합니다.
열발생 지방세포에서 EHMT1과 PRDM16 사이의 상호작용은 선행 연구13에서 보고되었다. EHMT1 - PRDM16 복합체는 갈색 지방세포 세포의 운명과 열 발생을 조절한다13. EHMT1은 PRDM16 - 아밀로이드 단백질 결합 단백질(APPBP)의 상호작용을 차단하여 PRDM16을 안정화시킨다 216. 이 PRDM16 안정화는 cullin(CUL) 2-APPBP2 및 EHMT116에 의해 조절됩니다.
이 연구에서는 HEK-293 세포가 재조합 단백질17의 생산에 널리 사용되기 때문에 HEK-293 세포를 사용했습니다. 플라스미드로 transfection하기 쉬운 다른 세포주, 예를 들어 Cos-7 세포 및 Hela 세포를 사용할 수 있습니다. PEI는 종래의 지방검사에 비해 경제적이고 간단하기 때문에 형질주입에 사용되었습니다.
사전 투명화, epitope tag 친화성 겔에서의 회전 및 세척은 이 방법에서 특히 중요한 단계입니다. 프리클리어링(preclearing)은 겔에 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거할 수 있습니다. 또한, 과도한 시간은 비특이적 단백질 검출을 초래할 수 있고, 시간이 부족하면 타겟 단백질의 검출을 방해할 수 있기 때문에 epitope tag affinity gel을 사용한 회전 시간이 중요하다.
다음 사항에 유의해야 합니다. HEK-293 세포는 쉽게 분리됩니다. 따라서 샘플을 준비할 때 콜라겐 코팅 접시를 사용해야 합니다. PEI 용액은 세포 독성이 있습니다. 따라서, 배지는 transfection 후 장기간 세포를 떠나지 않고 교체해야 합니다. PPI가 관찰되지 않는 경우, transfection된 plasmid의 양이 불충분하거나 IP로 유입되는 단백질의 양이 적을 수 있습니다. 또한 세탁 횟수가 과도하면 상호 작용을 놓칠 수 있습니다. 이를 해결하기 위해 HEK-293 세포에 도입되는 플라스미드의 양을 늘리고, IP에 사용되는 단백질의 양을 늘리고, 세척 횟수를 줄이는 방법을 고려할 수 있습니다. 또한, 최종 세척에 너무 많은 상층액이 남아 있으면 소듐 도데 실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔의 우물에서 넘쳐 나옵니다. 비특이적 밴드가 관찰되는 경우, IP에 사용되는 플라스미드/단백질의 양이 너무 많거나, 세척 횟수 또는 강도가 충분하지 않을 수 있습니다. 이는 IP에 사용되는 플라스미드/단백질의 양을 줄이거나, 세척 횟수를 늘리거나, 세척 완충액의 염분 농도를 증가시켜 세척력을 증가시킴으로써 해결할 수 있습니다.
폴리옥시에틸렌(10), 옥틸페닐 에테르와 같이 일반적으로 사용되는 세제는 기능적으로 중요한 PPI를 방해할 수 있다18. 더 가벼운 세제는 기능적으로 중요한 복합체의 회수를 증가시킬 수 있는 반면, 불완전한 용해화로 인해 허용할 수 없는 수준의 비특이적 상호 작용을 생성할 수 있습니다. 현재 연구에 사용된 단백질 용해 완충액에는 1% 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르가 포함되어 있습니다. 이 완충액은 transfection된 plasmid에 의해 과발현된 많은 양의 단백질과 함께 세포질 단백질을 용해합니다. 핵과 세포질을 분리하여 제조한 샘플에 대해 면역침전을 수행하면 전세포 용해로 준비한 샘플에 비해 배경이 줄어들고 명확한 표적 밴드를 식별할 수 있다17. 핵 내의 단백질로 면역침전을 수행하는 경우, 핵 단백질은 상용 핵 추출 키트를 사용하거나 세제를 함유한 저염 완충액으로 세포질을 파괴 및 제거한 후 고염 완충액(19)으로 핵 단백질을 추출할 수 있습니다. 면역블로팅의 개발 시간은 배경을 피하는 것뿐만 아니라 특정 밴드를 검출하기 위해 조정되어야 합니다.
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 먼저 탐지할 것으로 예상되는 PPI를 사용했습니다. 둘째, 플라스미드의 조합에 따라 각 유전자의 발현이 달라지기 때문에 단백질이 충분히 얻어지지 않을 수 있으며, 따라서 상호작용이 검출되지 않을 수 있다.
요약하면, 이 방법을 사용하면 PPI를 질량 분석법에 비해 경제적이고 쉽게 확인할 수 있습니다. 다양한 에피토프 태그 융합 단백질 사이의 PPI는 에피토프 태그 친화성 겔 대신 각 태그에 대한 친화성 항체를 사용하여 확인할 수도 있습니다. 유사한 면역침전 방법은 DYKDDDDK 태그에 융합된 임의의 단백질을 발현하는 플라스미드를 도입함으로써 다른 세포 유형에서 수행될 수 있습니다. 또한, epitope tag affinity gel 대신 endogenous antibody를 사용하면 다양한 세포 유형에서 endogenous PPI를 확인할 수 있습니다.

단백질은 정보 처리, 신진대사, 수송, 의사 결정 및 구조적 조직을 포함한 모든 세포 기능에서 중요한 역할을 합니다. 단백질은 다른 분자와 물리적으로 상호 작용하여 기능을 매개합니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI)은 신호 전달 매개, 환경 감지, 에너지를 물리적 움직임으로 전환, 대사 및 신호 전달 효소의 활동 조절, 세포 조직 유지와 같은 세포 기능을 매개하는 데 중요합니다1. 따라서 PPI는 알려지지 않은 기능을 설명하는 데 사용할 수 있습니다2. PPI를 검출하는 방법은 in vitro, in vivo 및 in silico의 세 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 공면역침전(co-IP), 친화성 크로마토그래피, 탠덤 친화도 정제, 단백질 어레이, 파지 디스플레이, 단백질 절편 보완, X선 결정학 및 핵 자기 공명 분광법이 체외 PPI 검출에 사용되었습니다3. 이러한 방법 중 co-IP는 단순성으로 인해 널리 사용됩니다.
융합 태그 FLAG는 엔테로키나제 절단 부위를 포함한 8개의 아미노산(AspTyrLysAspAspAspLys: DYKDDDDK)으로 구성되며, 면역친화성 크로마토그래피4를 위해 특별히 설계되었습니다. DYKDDDDK 태그 단백질은 anti-DYKDDDDK 항체를 사용하여 인식되고 캡처됩니다. 따라서 DYKDDDDK 결합 아가로스 비드5 를 사용하여 효율적으로 끌어내려 간단한 방법으로 특정 단백질에 대한 결합을 확인합니다. 면역침전은 다양한 세포에서 수행될 수 있으며, 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 광범위한 PPI를 확인할 수 있습니다. anti-DYKDDDDK 아가로스 비드를 사용한 면역침전 및 펩타이드 용출은 이전에 보고된 바 있다5.
여기에서는 DYKDDDDK 태그 단백질을 암호화하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 일시적으로 도입하여 두 관심 단백질의 연관성을 확인하는 간단한 면역침전 방법을 제공합니다. 특정 DYKDDDDK 항체는 융합 단백질의 N-말단과 C-말단 모두에 결합할 수 있지만 다른 항체는 결합할 수 없다6. 따라서 혼동을 피하기 위해 N-말단과 C-말단 모두에 융합된 태그를 인식하는 항체를 선택해야 합니다. 에피토프 태그를 삽입할 때, 에피토프 태그와 타겟 단백질 사이에 3 내지 12개의 염기쌍을 삽입함으로써 단백질의 구조적 변화를 피할 수 있을 수 있다. 그러나 삽입된 시퀀스는 프레임 이동을 피하기 위해 3의 배수로 된 기본 쌍이어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH8.0)</td> <td>Nippon gene</td><td>311-90075</td><td></td></tr><tr><td>10 % Mini-PROTEAN TGX 프리 캐스트 단백질 겔, 10-well, 50 &micro; L</td><td>Biorad</td><td>4561034</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, HRP Linked Whole Ab Sheep</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP linked Whole Ab Donkey</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper M</td><td>Sumitomo 베이클라이트</td><td>MS-93170</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I 코트 접시 100mm</td><td>IWAKI</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 글루타맥스 서플리먼트</td><td>인비트로겐</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>후지필름 와코</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>후지필름 와코</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>후지필름 Wako</td><td>077-00735</td><td></td></tr><tr><td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724</td><td>세포 신호 전달</td><td>C29F4</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바이오 스핀 크로마토그래피 컬럼</td><td>Biorad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>미니 프리캐스트 겔용 Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658004JA</td><td></td></tr><tr><td>mouse에서 생산된 단클론 ANTI-FLAG M2 항체</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td><td>이 논문</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-EHMT1</td><td>이 논문</td><td>N/A</td> pcDNA3.1-vector 이 논문 N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfection Grade Linear 폴리에틸렌 하이드로클로라이드</td><td>PSI</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>후지필름 Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르</td><td>후지필름 Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트</td><td>후지필름 Wako</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs</td><td>Cytiva</td><td>17061801</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108442</td><td></td></tr><tr><td>ROTATOR RT-5</td><td>TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유</td><td>Morinaga</td><td>0652842&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>스트리핑 솔루션</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>193-16375</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td><td>Biorad</td><td>1704156B03</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo System</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>USDA 테스트 완료 소 태아 혈청(FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Veriblot</td><td>Abcam</td><td>ab131366</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin (13E5) Rabbit mAb&nbsp;#4970</td><td>세포 신호</td><td>4970S</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 anti-epitope tag affinity gel을 사용한 면역침전

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

단백질-단백질 상호 작용(PPI)은 세포 조직, 세포 내 신호 전달 및 전사 조절과 같은 생물학적 현상에서 중추적인 역할을 합니다. 따라서 PPI를 이해하는 것은 표적 단백질의 기능에 대한 추가 연구를 위한 중요한 출발점입니다. 본 연구에서는 폴리에틸렌이민 방법을 사용하여 HEK-293 세포에 포유류 발현 벡터를 도입하고, 집에서 만든 단백질 용해 완충액에서 세포를 용해하고, 에피토프 태그 친화성 겔에서 표적 단백질을 끌어내려 두 표적 단백질의 결합을 결정하는 간단한 방법을 제안합니다. 또한, 다양한 에피토프 태그 융합 단백질 간의 PPI는 에피토프 태그 친화성 겔 대신 각 태그에 대한 친화성 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포주에서 핵 추출물을 포함한 다양한 PPI를 검증하는 데에도 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 PPI 실험에서 기본 방법으로 사용할 수 있습니다. 단백질은 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기에 의해 분해됩니다. 따라서 세포 용해, 면역침전 및 면역블로팅은 가능한 한 원활하게 수행되어야 합니다.

갈색 및 베이지색 지방세포라고도 하는 열발생 지방세포는 잠재적인 항비만 및 항포도당 불내성 효과가 있습니다. PR(PRD1-BF1-RIZ1 상동) 도메인 함유 16(PRDM16)은 열발생 지방세포 정체성 9,10을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 전사 보조인자입니다.
GLP라고도 하는 EHMT1(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1)은 주로 보조 인자 S-아데노실 메티오닌11을 사용하여 히스톤 H3(H3K9)의 라이신 9의 단중 및 디메틸화를 촉매합니다. 이전 보고서에 따르면 EHMT1은 히스톤 메틸화12,13을 통해 열발생 지방 세포 운명을 제어하는 PRDM16 복합체의 필수 메틸전이효소입니다. 또한, PRDM16 및 EHMT1의 발현 수준이 인간 신장 주위 갈색 지방 조직(BAT)의 열발생 유전자와 유의한 상관관계가 있다고 보고한 바 있으며, 이는 PRDM16 및 EHMT1이 모두 인간 BAT 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다8.
PPI를 확인하는 방법으로서 이 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해 DYKDDDDK-PRDM16 및 HA-EHMT1을 HEK-293 세포에 transfection하고 위의 프로토콜을 사용하여 DYKDDDDK-PRDM16을 면역침전시켰습니다. DYKDDDK 태그된 PRDM16 및 HA 태그된 EHMT1을 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1의 클로닝 부위에 삽입하였다( 재료 표 참조). 면역블로팅은 DYKDDDDK-PRDM16 및 HA-EHMT1로 형질주입된 그룹에서 DYKDDDDK-PRDM16과 HA-EHMT1 사이의 연관성을 확인했습니다(그림 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig01.jpg"> 그림 1: co-immunoprecipitation의 개략도 . 프로토콜의 회로도는 다음과 같습니다. 오른쪽에는 프로토콜의 워크플로가 표시됩니다. 왼쪽은 반응을 그래픽으로 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig02.jpg"> 그림 2: PRDM16은 EHMT1과 연결됩니다. HEK-293 세포는 벡터(음성 대조군), DYKDDDDK-PRDM16 또는 DYKDDDDK-PRDM16 및 HA-EHMT1로 형질주입되었습니다. 이어서 DYKDDDDK 태그 친화성 겔을 사용하여 공동 면역침전을 수행한 후 면역블로팅을 수행했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">단백질 용해 완충액 250mL(0.22μm 여과, 4°C에서 보관)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>mL</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>1 M 트리스 pH 8.0</td>
			<td>12.5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>5개 m NaCl</td>
			<td>7.5</td>
			<td>150 밀리미터</td>
		</tr><tr><td>0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1 m엠</td>
		</tr><tr><td>글리세롤</td>
			<td>25</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>합계</td>
			<td>250</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 1: 단백질 용해 완충액의 조성.

단백질-단백질 상호작용은 표적 단백질의 기능을 규명하는 데 중요하며, co-IP(co-immunoprecipitation)를 통해 PPI를 쉽게 확인할 수 있습니다. 에피토프 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 임시로 transfection하고 두 타겟 단백질의 결합을 쉽게 확인할 수 있는 면역침전 방법을 개발했습니다.

단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

우리의 연구 범위는 갈색과 베이지색 지방의 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 탐구하는 것을 포함합니다. 최근에 발견된 PRDM 16 복합체, NFIA 및 PPR 알파 ELK-1 복합체와 같은 줄기, 마찰 인자 및 보조 인자는 갈색과 베이지색의 지방 세포의 운명과 기능을 조절합니다. 또한 면역 세포 지방 세포 누화(crosstalk)가 주요 요인으로 확인되었습니다.귀하의 분야에서 연구를 발전시키기 위해 당사는 여러 최첨단 기술을 사용합니다. 여기에는 유전자 발현의 변화를 분석하기 위한 정량적 PCR 및 염색질 면역침전뿐만 아니라 베이지색 지방세포로의 분화와 관련된 단백질-단백질 상호 작용(PPI)의 변화를 조사하기 위한 호출 면역침전 및 질량 분석법이 포함됩니다. 면역침전을 위한 표준 프로토콜을 따랐음에도 불구하고 PPI를 검출하는 것은 종종 어려운 것으로 판명되었습니다.단백질 분해는 이 문제의 주요 원인이며 신중하게 피해야 합니다. 이 프로토콜은 PPI를 검사하는 다른 기술보다 간단하고 저렴하며 공정에 동결 해동을 포함하지 않으므로 단백질 분해를 최대한 줄일 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 PVDF 멤브레인의 공동 면역침전된 단백질 복합체를 보여줍니다. 복합체에서 감소된 단백질을 트립신으로 처리하여 더 작은 펩티드에서 개별 단백질을 절단한 다음 나머지 펩티드를 PVDF 막에서 추출했습니다. 그런 다음 복합체의 두 단백질에서 유래된 끌어낸 펩타이드를 건조시키고 추가 분석을 위해 저농도의 포름산에 재현탁시켰습니다.

상호 작용 연구를 위한 공동 면역침전된 단백질을 준비하기 위한 막상 단백질 분해

이 비디오에서는 항 GFP 항체로 코팅된 비드를 사용하여 GFP 태그가 지정된 야생형 및 돌연변이 PD-1 단백질의 공동 면역침전을 수행하는 기술을 보여줍니다. bead-bound PD-1-GFP 단백질은 PD-1과 상호 작용하는 SHP2 단백질과 함께 배양되어 SHP2 상호 작용에서 중요한 역할을 하는 PD-1의 특정 구조 모티프를 식별할 수 있습니다.

형질주입된 세포에서 효소 수용체 상호작용을 연구하기 위한 면역침전 분석

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.<br...

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

배우세요 HEK-293 세포에서 면역침전을 이용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을. DYKDDDDK-PRDM16과 HA-EHMT1 결합 확인을 통해 갈색 및 베이지 지방 발달의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전

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