Name: 성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: 배우세요 Aplysia bag cell 신경원 배양 및 고해상도 성장 콘 이미징 기법을 통해 신경 성장과 유도 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 세포골격 역학 분석에 활용됩니다.

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우리는 해부 비디오 편집과 지원을위한 절차와 로드니 맥페일을 (생물 과학학과, 퍼듀 대학교) 촬영을 위해 라이언 마네리을 (오이스터캐쳐 프로덕션, LLC) 감사드립니다. 수터 실험실 연구는 DMS에 퍼듀 대학에서 NIH (R01 NS049233)와 빈들리 Bioscience 센터에서 기금에 의해 지원됩니다

솔루션 <ul><li> L15 - ASW의 세포 배양 매체 (일리터) <ul><li> L15 가루 1 봉지 </li><li> H 2 O ultrapure 800 ML을 추가 </li><li> NaCl 400 MM </li><li> MgSO 4 27 MM </li><li> MgCl 2 28 MM </li><li> L - 글루타민 4 MM </li><li> Gentamicin 50 μg / ML </li><li> HEPES 5 MM </li><li> 산도 7.9로 조정 </li><li> (precipitates 경우 스톱) 드롭 CaCl 2 9.3 MM을 들러 추가 </li><li> 1리터에 H 2 O ultrapure 추가 </li><li> osmometer (증기압, Wescor # 5520)와 osmolarity (950-1000 mmol / kg)를 확인 </li><li> 긍정적인 압력 여과 장치 (Millipore의 SVGV010RS 필터)를 사용하여 필터 0.22 μm의 </li><li> 최대 1 개월 4 ° C에 보관 </li></ul></li><li> 폴리 - L - 라이신은 (70-150 KD) 200 살균 H 2 O ultrapure에 μg / ML 주식 솔루션은 -20 O C에서 보관 </li><li> 0.5 M MgCl 2 용액 </li></ul> 1 일 : Aplysia 복부 신경절의 해부 효소 분리 솔루션의 준비 <ol><li> Eppendorf 튜브에 : Dispase 효소 (LS02111 워싱턴, 고양이)의 90-10 MG를 달다 </li><li> L15 - ASW 문화 매체 900 μl 및 살균 H 2 O ultrapure 100 μl 추가 </li><li> 실온 (RT)에서 혼합 및 장소 </li></ol> 복부 신경절의 해부 <ol><li> 0.5 M MgCl 2 솔루션으로 50 ML의 주사기를 채우십시오. </li><li> 탱크에서 한 동물을, 동물의 inking 방어 반응을 피하기 위해 부드럽게 처리할 수 있습니다. </li><li> 왼쪽으로 오른쪽, 꼬리쪽으로 절개 보드의 측면에 Aplysia (스티로폼 보드), 주동이의 옆에 놓습니다. </li><li> 그냥 머리 뒤에 동물에 바늘을 삽입하고 뱃속에 모든 MgCl 2 솔루션을 주입. </li><li> 부드럽게 뱃속 내내 MgCl 2 솔루션을 해산하기 위해 동물을 문질러 완전히 anaesthetized하는 동물을위한 몇 분 동안 기다립니다. </li><li> 이 바늘로 해부 보드 동물의 머리와 꼬리를 핀. </li><li> 측면에 큰 열기를 만들기 위해 머리와 꼬리를 향해 큰 가위로 피부와 근육의 계층을 통해 잘라내기, 피부를 리프트에 집게를 사용하십시오. </li><li> 브러시와 같은 난소에서 복부 신경절을 찾아보십시오. 복부 신경절 앞에서 1cm에 대한 연결 신경 잡아 집게를 사용하여, 포셉 보관 위치 앞에와 복부 신경절 뒤에 해부 가위로 신경을 절단. </li><li> 22 Dispase 솔루션 및 15-16 H에 대한 부화에 플레이스 신경절 ° C 온도 제어 물을 욕조를 사용합니다. </li></ol> 일 2 : Aplysia 가방 세포의 도금 폴리 - 라이신 - 코팅 coverslips 준비 <ol><li> 흐름 벤치에서, 4 ML L15 - ASW 매체 각을 작성, 신경절의 해부를 위해 요리를 작업을 피해 3 35mm 배양 접시를 준비합니다. 소화의 15.5 시간 후 작업 요리 중 하나 dispase 솔루션에서 복부 신경절을 전송합니다. </li><li> 포셉 취할 사용하면 산성 - 청소 # 1.5 coverslips (22x22 mm)는 에탄올에 저장된, 알코올을 제거하고 알콜 램프를 통해 간단히 그들을 불타는하여 coverslips을 소독. 문화 요리에 coverslips를 삽입하기 전에 그들이 잠시 더위 좀 식히자. </li><li> 알콜 램프에 비해 노란색 팁 (불꽃은 간단히 플라스틱의 용융을 피하기 위해를!) 굴곡하여 곡선 도금 팁을 준비합니다. </li><li> 무균 H 2 O ultrapure 200 μg / ML 주식 솔루션을 diluting 20 μg / ML - 폴리 리신 솔루션의 적절한 금액을 준비합니다. </li><li> 20 μg / ML - 폴리 리신과 RT에서 20 분에 대해 품어 500 μl 각 coverslip을 커버. </li><li> 500 μl 무균 H 2 O ultrapure 각 각 coverslip 3-5 번 씻으십시오. </li><li> coverslips 물을 제거, L15 - ASW 문화 매체 4 ML 각 요리를 입력합니다. </li></ol> 가방 세포의 분리 <ol><li> 해부 현미경에서 이전에 95 %의 에탄올 (그림 1 라인 1) 청소 이분의 일 사용 해부 가위와 집게의 복부 신경절를 잘라. </li><li> 가방 전지 클러스터 hemiganglion 세포 (그림 1 2 호선) 사이 컷 신경절, 그리고 가방 세포의 반대편에 남아있는 신경 확장 (그림 1 라인 3) 버려야 중 절반에. 한 번에 신경절의 반은 작업, 첫 번째 클러스터의 세포가 도금되는 동안 접시에있는 다른 반쪽을 두십시오. </li><li> 이 포셉 (또는 한 포셉 및 해부 가위), 가방 전지 클러스터를 둘러싼 결합 조직 칼집을 별도로 추진하여 릴리스 가방 셀 클러스터를 사용합니다. 필요한 경우 해부 가위 들고 도망 결합 조직을 잘라. 이 과정에서 당기 너무 많은 가방 셀 클러스터를 만지지 않도록 조심하십시오. </li><li> 대부분 결합 조직의 제거되면 B를 전송벤트 노란 팁으로 새 작업을 그릇에 AG 전지 클러스터는 이전 준비. 가방 전지 클러스터가 노란색 팁 안에 갇혀 또는 공기 / 미디어 인터페이스에 붙어있을 수 있도록하지 않도록주의하십시오. </li><li> 개인 가방 세포를 제거하는 노란색 팁으로 클러스터를 씹다. 팁에서 퇴원 클러스터를 pipetting하여이 작업을 수행합니다. 낮은 전단 병력과 함께 시작하여 필요에 따라 힘을 향상시킬 수 있습니다. 항상 너무 많은 세포를 죽이지 않고 뉴런을 제거하는 데 필요한 최저 힘을 사용합니다. </li><li> 3-5 건강한 가방 세포를 수집하고 쓰임새 라이신 - 코팅 coverslip있는 요리로 전송할 수 있습니다. 죽은 세포 (그들은 중앙에 검은 / 투명) 및 결합 조직의 파편을 채취하지 마십시오. </li><li> 6 단계를 반복합니다. 각 coverslip의 중심에 15-25 살 뉴런에 대한 곳. 죽은 세포이나 먼지가 잘으로 전송하는 경우, 그것을 수확하거나 건강한 세포에서 멀리 불어하여 ​​원치 않는 물질을 제거합니다. 이 과정은 두 클러스터에 대한 2-3시간 걸립니다. </li><li> 일단 (원치 않는 진동을 피하기 위해 해제 흐름 벤치 송풍기 유지) 세포를 첨부할 수 있도록 RT 적어도 2 시간 흐름 벤치에서 문화 요리를 보관 마쳤다. </li><li> ° C 하룻밤, 또는 추가를 사용하기 전까지 14에서 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 성장 원뿔은 40-10시간에서 개발 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="그림 1. Aplysia californica 복부 신경절의 개략도. 가방 전지 클러스터를 얻기 위해 상처 어디에 컬러 라인 나타냅니다." /> 그림 1. Aplysia californica 복부 신경절의 개략도. 가방 전지 클러스터를 얻기 위해 상처 어디에 컬러 라인 나타냅니다. 3 일 : Aplysia 가방 세포의 라이브 영상을위한 챔버 설정 이미지 챔버 조립 <ol><li> 라이브 셀 이미징 실험을위한 가방 세포를 사용하기 전에, 낮은 전력 현미경에서 세포를 검사합니다. 세포가 건강하게 성장 콘을 개발하지 않은 경우, 1-2 시간 동안 RT에서 신선한 매체와 휴가를 제공합니다. </li><li> 신선한 L15 - ASW 매체와 번호판을 공급하기 위해 진공 라인 오래된 매체의 절반 (~ 2ml)를 제거하고 새로운 2 ML L15 - ASW의 배양 접시 당 매체를 추가하십시오. 이 coverslip에서 세포를 제거하므로 완전히 한꺼번에 접시에서 모든 매체를 제거하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 가방 세포 이미징을 위해, 우리는 샌드위치와 같은 영상 챔버의 두 coverslips 두 플라스틱 스페이서를 조립. 샌드위치의 맨 coverslip는 중간 및 시약을 쉽게 교환할 수 있도록 짧은 컷입니다. 조립하는 동안 연결된 가방 세포와 coverslips는 dislodging에서 세포를 방지하기 위해 항상 L15 - ASW 매체에 빠져들해야합니다. </li><li> 챔버를 준비하려면, 잘라 ~ 2mm를 다이아몬드 펜 (유리 커터)와 통치자와 # 1 coverslips 22x22 mm의 오른쪽에서. </li><li> 1 ML의 주사기를 사용하여 짧은 coverslip의 양면 높은 진공 그리스를 적용하고, 각 측면에 플라스틱 스페이서를 연결합니다. 두 스페이서의 상단에 진공 그리스를 적용합니다. </li><li> coverglass에 가방 세포를 포함하는 페트리 접시에 coverslip와 스페이서 조립, 장소 반전. 정렬 부드럽게이 Q - 팁 리버스 엔드와 하단 coverslip 맨 coverslip을 막대기 아래로 누르십시오. </li><li> 포셉을 사용하여 부드럽게 밖으로 누출 매체없이는 배양 접시의 샌드위치 조립을 리프트. 필요한 경우, 두 coverslips를 정렬하고, Kimwipe로 초과 매체를 닦아. 현미경 슬라이드 홀더의 하단 부분에 샌드위치를​​ 장소와 클립을 사용하여주의 덮개를 부착합니다. </li><li> Q - 팁을 샌드위치의 맨 위에 측면의 중심을 깨끗이 유리 청소기 ( &#39;스파클&#39;은 유리 청소기로 사용됩니다)에 dabbed. 신속 리크 라인을 피하기 위해 두 번째 건조 Q - 팁과 유리 청소기를 건조. 하단 coverslip에 대해 동일한 작업을 수행. 리크 라인 무료 깨끗한 coverslips는 고품질의 영상을 위해 중요합니다. </li></ol> 현미경에 가방 세포 Aplysia 가방 세포의 연결을 문화가 저밀도에 있기 때문에 귀하의 현미경 설정은 세포 사이를 전환할 촉진 무대 위치 기능을 가지고있다면, 그것은 최고입니다. 가방 세포는 쉽게 이미징 실험을하는 동안 무대에서 몇 시간 동안 RT에 보관하실 수 있습니다. 증발을 방지하기 위해 정기적으로 매체를 교환.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Aplysia 가방 세포 뉴런은 거의 비의 연결을 세포와 혈청의 연결이없는 세포 배양 시스템을 제공합니다. 이러한 뉴런 중요한 세포 생물 학적 질문 숫자를 해결하기 위해 적합한 매우 큰 성장 원뿔을 형성합니다. 가방 세포 뉴런 쉽게 몇 시간 동안 조작하고 실온에서 몇 군데하실 수 있습니다. 형광등을 사용하면 하나 양적 F - 굴지와 미세 소관의 중합 및 translocation 역학의 다양한 매개 변수를 분석할 수 현미경 (FSM)을 스페클. 최근 출시된 Aplysia 게놈 정보뿐만 아니라 개선 표현 기법과 함께 이러한 이미징 도구의 연결을 성장 콘 운동성 및지도 분자 및 세포 메커니즘을 공부하고 이러한 뉴런은 강력한 모델 시스템을합니다.

<table><tbody><tr><td>#1 유리 커버슬립 22x22 mm</td><td>도구</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 유리 커버슬립 22x22 mm</td><td>도구</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>도구</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>배지 여과용 필터</td><td>도구</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>도구</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>삼투압 측정기</td><td>도구</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 심</td><td>도구</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>L15 배지</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시약</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시약</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (70-150 kD)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>염화 나트륨</td><td>시약</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>중성 프로테아제 (Dispase)</td><td>시약</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 aplysia에서의 연결을 셀 문화

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

의 연결을 성장 콘은 환경에서지도 신호를 감지하고 적절한 대상 세포쪽으로 방향 움직임에이 정보를 transduce 수 axons의 끝에 높은 운동성이있는 구조입니다. 완벽하게지도 정보가 기본 동적 cytoskeletal 네트워크에 세포 표면에서 전달하는 방법 이해하기 위해서, 하나는 높은 시간적 및 공간적 해상도에서 단백질 역학 라이브 셀 이미징에 적합한 모델 시스템이 필요합니다. 전형적인 척추 성장 콘은 양적 F - 굴지와 미세 소관의 역학을 분석하는 너무 작은 수 있습니다. 군소 Aplysia californica에서 뉴런은 뉴런 척추보다 5-10 배 큰 쉽게 실온에서 보관 수 있으며, 미세 조작 및 biophysical 측정을 매우 강력한 세포 수 있습니다. 그들의 성장 콘은 매우 세포질 지역과 잘 설명 cytoskeletal 시스템을 정의했습니다. 의 연결을 세포 기관은 성장 콘 운동성 및지도를 공부에 대한 프로브의 다양한 microinjected 수 있습니다. 현재의 프로토콜에서는 복부 신경절, 가방 셀 뉴런의 문화와 성장 콘 라이브 셀 이미징에 대한 이미징 챔버를 설정 해부를위한 절차를 설명합니다.

Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

신경세포 성장원추는 축삭 끝에 위치한 매우 운동성이 높은 구조물로, 환경 내의 유도 신호를 감지하고 이 정보를 전달하여...

가상 실험실에서 우리는 해양 연체동물인 Plegia californica의 신경절 세포를 배양합니다. 이 뉴런들은 매우 큰 성장 원추(growth cone)를 뻗어내기 때문에, 특히 세포골격 역학을 분석하기 위한 성장 원추의 운동성 및 유도에 관한 고해상도 연구에 매우 적합한 모델 시스템이 됩니다. 본 영상에서는 Plegia의 해부 및 신경절 세포 배양 방법을 시연합니다.안녕하세요, 퍼듀 대학교 생물과학과의 Daniel Suter입니다. 오늘은 glial back cell 뉴런의 박리, 배양 및 이미징 절차를 보여드리겠습니다. C, her apia CAA의 뉴런은 학습 및 기억 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다.Apia는 단순한 신경계를 가지고 있으며 전기생리학 연구에 적합한 거대 뉴런을 보유하고 있습니다. 본 연구실에서는 이러한 뉴런들의 성장 원추(growth cone)가 크고, 성장 원추의 운동성 및 유도와 관련된 단백질 역학의 고해상도 이미징에 매우 적합하기 때문에 이를 사용합니다. 전체 과정은 다음과 같은 단계로 구성됩니다.1일 차에는 동물을 희생시키고 해부하여 복부 신경절을 얻습니다. 2일 차에는 배양 플레이트를 준비합니다. 등쪽 세포 군집을 해부하고 개별 뉴런을 플레이팅합니다.3일 차에는 DIC(미분 간섭 대비) 현미경을 이용한 세포의 타임랩스 이미징을 위한 이미징 챔버를 제작하며, 이를 시연하고 설명합니다. 오늘의 실험 절차는 저희 연구실의 대학원생인 iTune Lee가 진행하겠습니다. 이제 그녀가 배양된 신경세포를 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.시작하겠습니다. 후세포 뉴런은 플레기아 신경계의 복부 신경절의 일부이므로, 효소 소화를 위해 복부 신경절 전체를 박리하겠습니다. 그런 다음 나머지 신경절로부터 두 개의 백 세포 클러스터를 분리하겠습니다.복강 신경절을 이 2단계 용액에서 15~16시간 동안 소화시켜 결합 조직을 느슨하게 만듭니다. 이제 동물을 희생시키기 위해 0.5 M 염화마그네슘을 채운 대용량 60 mL 주사기와 세척된 해부 도구인 핀셋, 해부 가위, 대형 가위를 준비해야 합니다. 우리는 캘리포니아 해안에서 채집한 무게 약 150 g의 야생 Plegia California car를 사용합니다.동물은 바닷가재 수조에서 최대 3~4주 동안 유지합니다. 염화마그네슘 용액을 동물의 머리 근처 체강에 주입합니다. 동물을 가볍게 문질러주면 용액이 잘 퍼지며 동물이 수축하는 것을 방지할 수 있습니다.주사바늘을 사용하여 동물의 머리와 꼬리 부분을 스티로폼 보드에 고정합니다. 핀셋 하나로 체벽 근육을 들어 올린 후, 큰 가위로 체강을 절개합니다. 그런 다음 머리부터 꼬리까지 측면을 따라 체벽을 절개하고 근육을 보드에 고정합니다.다음으로, 붓 모양의 황색 기관인 난소 아래에서 복강 신경절을 찾아야 합니다. 복강 신경절을 찾은 후, 해부 가위를 사용하여 신경절의 전면과 후면의 신경을 절단하여 신경절을 분리하십시오.그다음 신경절을 1 mL의 치환 용액이 들어 있는 시험관으로 옮기고 22 °C 워터 배스에서 15.5시간 동안 둡니다. 이 배양 과정 동안 결합 조직이 느슨해져 후방 세포 집단(back cell clusters)을 쉽게 제거할 수 있게 됩니다. 후방 세포 배양을 시작하기 전에, 뉴런을 배양할 커버슬립을 준비합니다.우리는 35 millimeter 페트리 접시에 라미닌이 코팅된 커버슬립을 놓고 배아 신경세포를 배양합니다. 그 후, 고염 배양 배지인 L 15 A SW 배지에 침전시킵니다. 이러한 유형의 세포의 경우, 일반적으로 동물 한 마리당 커버슬립이 포함된 페트리 접시 8~10개를 준비합니다.이제 가방세포 뉴런의 플레이팅에 사용되는 도구들에 대해 논의해 보겠습니다. 가방세포 군집의 해부를 위해 커버슬립이 없는 L 15 A SW가 채워진 페트리 접시 3개, 알코올로 멸균한 미세 핀셋과 가위, 그리고 P 20 파이펫에 부착된 구부러진 옐로우 팁이 필요합니다. 옐로우 팁은 분젠 버너 불꽃 위로 빠르게 통과시켜 가열한 후 핀셋을 사용하여 구부려 준비합니다.굴곡진 부분을 으깨지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 나중에 백 셀 클러스터(bag cell cluster)가 그 부위에 끼어 움직이지 못할 수 있습니다. Plegia 백 세포의 해부 및 플레이팅은 실온에서 해부 현미경 하에 수행합니다.이제 15.5시간의 효소 배양이 완료되었으므로, 복부 신경절을 디스크 공간에서 L 15 A SW 배지가 들어 있는 작업 접시 중 하나로 옮길 수 있습니다. 백세포(bag cells)를 분리하는 방법을 보여드리기 전에, 먼저 도식도를 살펴보겠습니다. 복부 신경절이 어떻게 해부되는지 시각화하기 위해, 우선 복부 신경절의 중심부를 절단합니다.이 선에서 보시는 바와 같이, 뒤쪽의 앞뒤로 두 번 절개합니다. 여기 보시는 것처럼 클러스터를 형성합니다.이제 실체현미경으로 관찰하면 복신경절의 중앙이 절단된 것을 볼 수 있으며, 두 절단면이 배세포 군집(bag cell cluster)의 앞뒤로 만들어진 것을 확인할 수 있습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 결합 조직의 틈을 찾고, 배세포 군집을 둘러싸고 있는 결합 조직 초를 조심스럽게 아래로 밀어냅니다. 박리용 가위를 사용하여 가능하면 결합 조직을 군집에서 한 조각으로 제거하십시오.하지만 백 cell 클러스터가 손상되지 않도록 주의하십시오. 굽은 팁에 배지를 취해 백 cell 클러스터를 다른 작업용 디쉬로 조심스럽게 옮깁니다. 옐로우 팁을 사용하여 백 cell 클러스터를 부드럽게 저어 클러스터에서 개별 백 cell을 분리합니다.이를 위해 파이펫 팁으로 클러스터를 흡입한 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 밀어냅니다. 클러스터 내의 살아있는 세포를 poly 코팅된 커버슬립이 들어 있는 디쉬로 옮깁니다. 죽은 세포는 중심부가 검게 보이며, 살아있는 세포는 하얗게 보입니다.현미경 관찰을 위해 세포를 커버슬립의 중앙에 배치하고, 세포 파편과 사멸된 세포를 가능한 한 빨리 제거하는 것이 중요합니다. 불필요한 물질을 집어내거나 불어내어 제거하면, 건강한 세포가 폴리리신 플레이트에 빠르게 부착될 것입니다. 커버슬립당 약 15~25개의 세포를 배치하십시오.첫 번째 클러스터의 모든 세포 배치가 완료되면, 두 번째 클러스터의 결합 조직을 제거하고 동일한 세포 도말 절차를 계속합니다. 모든 플레이트 작업이 완료되면, 세포가 적절히 부착될 수 있도록 진동을 피하면서 바닥 벤치의 실온에서 최소 2시간 동안 그대로 둡니다. 그 후, 디쉬를 스티로폼 또는 플라스틱 트레이에 담아 추가로 사용하기 전까지 14 degree 인큐베이터로 옮깁니다.일반적으로 플레이팅 후 1~2일 뒤에 신경 성장 원추(growth cone)를 이미지화합니다. 신경 성장 원추 역학의 라이브 이미징을 위해, 플라스틱 스페이서로 분리된 두 개의 커버슬립으로 작은 이미징 챔버를 제작합니다. 아래쪽 커버글라스에는 뉴런이 부착되어 있습니다.배지 교환을 용이하게 하기 위해 다이아몬드 펜을 사용하여 상단 커버슬립을 더 짧게 자릅니다. 그다음 현미경 스테이지 위에서, 커버슬립 샌드위치를 현미경에 장착하기 위해 맞춤 제작된 홀더에 배치합니다. 배지가 새어 나오지 않도록 챔버 구성 요소들을 고정하는 데 스테이지 고진공 그리스를 사용합니다. 작은 시린지를 사용하여 상단 커버 글라스에 고진공 그리스를 도포한 후, 핀셋으로 스페이서를 배치하고 그 위에 진공 그리스를 추가로 도포합니다.그 다음 어셈블리 전체를 들어 올려 반대로 돌린 후, 배양 접시에 세포가 잠겨 있는 상태의 커버슬립 위에 조심스럽게 누릅니다. 면봉을 사용하여 커버슬립의 위치를 맞추고, 위쪽 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하며 누릅니다. 이후 접시에서 샌드위치 구조물을 조심스럽게 꺼내어 여분의 배지를 닦아내고 홀더 바닥에 놓습니다.압력으로 인해 커버 글라스가 깨지지 않도록 주의하며 샌드위치를 홀더에 배치하십시오. 면봉에 sparkle 유리 세정제를 묻혀 양쪽 커버 글라스를 닦아내십시오. sparkle 세정제는 유리에 자국을 덜 남기므로 이를 사용하는 것이 좋습니다. 중심에서부터 원을 그리듯 커버 글라스를 닦은 후, 즉시 마른 면봉으로 닦아 자국이 남지 않게 하십시오.고품질 이미징, 특히 DIC 광학계를 사용할 때는 커버 글라스를 깨끗하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 척수 배측 세포 뉴런 배양물은 저밀도 배양물이므로, 현미경에 스테이지 위치 지정 기능이 있으면 서로 다른 세포 간에 쉽게 전환할 수 있어 매우 유용합니다. 이제 성장 원추의 형태와 운동성을 관찰할 준비가 되었습니다.우리는 고해상도 미분 간섭 대비(DIC) 타임랩스 이미징을 통해 성장 원추의 형태와 운동성의 성장을 시각화합니다. DIC 이미징은 이 60배율 DIC 타임랩스 영상에서 볼 수 있듯이 성장 원추 구조의 표면 뷰를 제공하므로 이러한 응용 분야에 유용합니다. 이를 통해 전형적인 성장 원추의 세 가지 영역을 명확하게 확인할 수 있습니다.말초 영역은 lamellipodia와 filopodia가 풍부하게 구성되어 있습니다. 전이 영역은 ruffling 활성이 특징이며, 중앙 영역은 주로 미세소관과 세포소기관을 포함합니다. 성장 원추 조향(growth cone steering)의 메커니즘을 연구하기 위해, 본 분석법에서는 구속 비드 상호작용(restrained bead interaction, RBI) 분석법을 개발하였습니다.아테신(artesian) 단백질로 코팅된 마이크로비드는 세포 표적 기질을 모사하는 데 사용됩니다. DIC 타임랩스 영상에서 마이크로니들을 사용하여 비드를 성장 원추(growth cone)의 주변부 영역에 배치합니다. 중앙 영역에서 역행성으로 이동하는 파동을 통해 역행성 효과와 흐름을 관찰할 수 있습니다.소기관은 미세소관을 따라 이동합니다. 유의미한 변화가 없는 초기 기간이 지난 후, 중앙 도메인 경계가 구속된 비드 방향으로 갑작스럽게 전진 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 선단 성장과 장력 증가가 수반되며, 특히 비드 상호작용 축을 따라 흐름 감쇠 및 미세소관 신장 효과가 관찰될 수 있습니다.성장 원추의 세포골격 역학을 분석하기 위해 형광 반점 현미경(fluorescent speckle microscopy)을 사용합니다. 형광 표지된 tubulin과 actin 프로브를 신경세포체에 미세 주입하고 타임랩스 영상을 촬영합니다. 세포골격의 동적인 움직임 중, 빨간색으로 표시된 actin은 선단부(leading edge)를 따라 조립되며 역행성 흐름(retrograde flow)에 의해 후방으로 이동하고 전이 구역(transition zone)에서 재활용됩니다.녹색으로 표시된 동적인 미세소관이 조립과 전위 동작의 결합을 통해 성장 원추 주변부의 성장을 탐색하는 모습이 나타났습니다. 적은 양의 라벨링으로 인해 점박이 패턴이 형성되었으며, 이를 통해 세포골격 역학의 다양한 파라미터를 정량적으로 분석할 수 있었습니다. 신경 성장 원추의 고해상도 이미징을 원하시는 분들을 위해, 배아 배아 세포의 박리, 배양 및 이미징 방법을 안내해 드렸습니다.성장 원추의 크기가 크고, 세포질 영역이 뚜렷하며, 세포골격이 잘 기술되어 있기 때문에 이 시스템을 사용하는 것이 매우 유용합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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