Name: 세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 생쥐 ICSI-ET 모델을 이용한 세포질 내 정자 주입 기술로 자손의 혈당 대사 변화를 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 생식 건강과 대사 질환 연구에 중요한 기초를 제공합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>포도당 대사에 대한 장기적인 영향을 연구하기 위한 ICSI-ET 마우스 모델

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.25 % 아베르틴 (2,2,2- 트리 브로 모에탄올)</td> <td>남경 Aibei</td><td>M2960</td><td>마취</td></tr><tr><td>세균 페트리 접시 35 x 10mm 스타일 승 / 꽉 뚜껑, 크리스탈 학년 버진 폴리스티렌, 멸균</td><td>BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>세균 페트리 접시 50 x 9mm 스타일 승 / 꽉 뚜껑, 크리스탈 등급 버진 폴리스티렌, 멸균</td><td>BD</td><td>351006</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>ESCO</td><td>class <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/66212/66212eq01.jpg" style="여백: 자동; "> BSC</td><td>무균 작업, 배양 접시 만들기, 시약 분취 등</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>배아 배양</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>마우스 배아 이식에 사용</td></tr><tr><td>Fluorinert Fc-770</td><td>SIGMA</td><td>F3556</td><td>Fluorinert FC-770은 높은 절연 강도와 저항력을 가진 열적으로 안정적인 완전 불소화 액체로, 작동 유체</td></tr><tr><td>휴대용 혈당계</td><td>Roche</td><td>AccuChek performa</td> Blood로 사용됩니다<td>. 포도당 측정</td></tr><tr><td>HTF</td><td>Merck</td><td>MR-070-D</td><td>마우스 IVF와 함께 사용하도록 설계된 액체인 EmbryoMax HTF(Human Tubal Fluid)(1x)는 50mL 형식으로 제공되며 배아 배양을 위해 최적화 및 검증되었습니다.</td></tr><tr><td>유압식 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram 4r Oil, 5196000030</td><td>For sperm</td></tr><tr><td>injection Inverted</td><td>Microscope Nikon</td><td>TI2-U</td><td>Micromanipulation observation host</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Medium (1x), liquid, with Phenol Red</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>NTX-N4</td><td>마이크로 매니저션 암</td></tr><tr><td>미네랄 오일 </td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>미네랄 오일은 다양한 분자 생물학 응용 분야에서 증발 및 교차 오염을 제어하기 위한 커버 레이어로 사용하기에 적합합니다.</td></tr><tr><td>바늘 절단기</td><td>Nanjing Aibei</td><td>Sutter MF-800</td><td>미세 조작 바늘 제작에 사용</td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>Nanjing Aibei</td><td>Sutter 모델 p-100</td><td>미세 조작 바늘 제작에 사용</td></tr><tr><td>Piezo Drill Trip Mouce ICSI</td><td>Eppendorf</td><td>5195000.087</td><td>ICSI 주사 바늘의 적용.</td></tr><tr><td>Piezoelectric Micromanipulator (Membrane Breaker)</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf PiezoXpert</td><td>마이크로 펄스를 사용하여 난모세포의 투명대와 난포를 파괴</td></tr><tr><td>Pneumatic Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram 4r Air, 5196000013</td><td>난모세포 고정용</td></tr><tr><td>즉시 사용 가능한 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (Hcg)</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>멸균 시약, 복강 내 주사.50 IU/mL</td></tr><tr><td>바로 사용 가능한 임산부 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)</td><td>난징 Aibei</td><td>M2620</td><td>살균 시약, 복강 내 주사.50 IU / mL</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>난모 세포 채취 및 배아 발달 관찰</td></tr></tbody></table>

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

우리 실험실에서는 생쥐의 부고환 꼬리 정자와 함께 ICSI를 사용하여 89.57%의 수정률과 87.38%의 2세포 비율을 달성했습니다. ET 이후의 자손의 출산율은 약 42.50%입니다. 놀랍게도, 모든 수정률, 2세포 비율 및 자손 출생률은 인간 ART에서 달성한 수준과 비슷하여 마우스에서 인간 ART 기술의 여러 단계를 종합적으로 시뮬레이션할 수 있습니다. 자세한 내용은 표 1 및 표 2에 나와 있습니다. 성장 및 발달 과정에서 자연적으로 태어난 마우스와 ICSI 마우스 간의 무작위 혈당 수치에는 유의한 변동이 없었습니다(그림 2). 그러나 수컷 ICSI 마우스는 실험 내내 지속적으로 높은 수준의 공복 혈당을 보였는데(그림 3), 이는 공복 혈당 항상성 장애를 나타냅니다. 흥미롭게도, 암컷 ICSI 마우스는 대조군에 비해 아무런 변화도 보이지 않았다. GTT에서 혈당 수치는 수컷 ICSI 마우스와 대조군 간에 유의미한 변화를 보였으며(그림 4), 암컷 마우스에서는 이러한 차이가 없었습니다. 이 결과는 ICSI 기술을 사용하여 얻은 자손이 당뇨병을 앓고 있을 수 있음을 시사했으며, 그 결과는 성별과 관련이 있었습니다. 암컷 마우스는 당뇨병 표현형을 나타내지 않았지만 수컷 및 암컷 ICSI 마우스의 과체중 표현형은 일관되었습니다(그림 5).
여기에 설명된 세포질 내 정자 주입(ICSI) 프로토콜을 사용하여 마우스에서 높은 수정 및 배아 발달률을 달성했습니다. 대표적인 실험에서 난모세포의 89.57%가 ICSI 후 수정되었으며, 이는 두 개의 전핵(pronuclei)이 형성된 것으로 입증되었습니다. ICSI 후 24시간이 지났을 때 접합체의 87.38%가 2세포 배아 단계로 발달했습니다. 수혜 암컷에게 배아를 이식한 후 살아있는 새끼의 출생률은 42.50%였습니다(긍정적인 결과). 여기에 설명된 최적화된 세포질 내 정자 주입(ICSI) 프로토콜을 사용하여 쥐 난모세포와 정자에서 자손을 효율적으로 생성했습니다. 중요한 것은, ICSI 유래 동물의 철저한 특성 분석이 심각한 발달 결함이 없는 상태에서 대사 섭동을 드러냈다는 것입니다.
자연적으로 사육된 대조군과 비교했을 때, 암컷이 아닌 수컷 ICSI 마우스는 공복 혈당 상승(그림 3)과 복강 내 포도당 내성 검사에서 포도당 내성 감소(그림 4)로 입증된 포도당 항상성 장애를 보였습니다. 이러한 변화는 ICSI 매개 수정 중 재프로그래밍 결함 또는 정자 조작 중에 발생하는 미묘한 유전적/후성유전학적 이상에서 비롯될 수 있습니다.
또한, 수컷과 암컷 ICSI 마우스 모두 대조군에 비해 체중이 증가했으며(그림 5), 이는 비만 성향을 시사합니다. 마우스 ICSI 기술은 인간 ICSI 결과를 신뢰할 수 있게 모델링하지만, 관찰된 대사 표현형은 ICSI 동물 모델의 결과를 신중하게 해석해야 할 필요성을 강조합니다. 성장, 건강 및 행동에 대한 포괄적인 평가는 다운스트림 응용 분야에 대한 ICSI 마우스의 적합성을 결정하는 데 필수적입니다.
종합하면, 이러한 데이터는 연구를 위한 자손을 효율적으로 생성하기 위한 마우스 ICSI 프로토콜의 유용성을 보여주는 동시에 ICSI 유래 동물에서 표현형 결과를 철저히 평가하는 것의 중요성을 강조합니다. 이 예에서 관찰된 성별에 따른 대사 이상은 ICSI 마우스 모델의 결과를 신중하게 해석해야 할 필요성을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig01.jpg"> 그림 1: 생쥐의 세포질 내 정자 주입을 위한 접시 준비 다이어그램. 세포 배양 접시 뚜껑은 상반부와 하반부로 나뉘었다. 상반부에는 정자 배치를 위한 10% 폴리비닐피롤리돈 용액의 물방울이 포함되어 있었습니다. 하반부에는 ICSI 절차를 수행하기 위한 M2 매체의 액적이 포함되어 있습니다. 모든 물방울은 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일로 덮여 있습니다. 이 접시 설정을 통해 PVP와 M2 액적 사이에서 정자와 난모세포를 순차적으로 전달하여 ICSI 과정을 가능하게 했습니다. 분리된 영역은 절차 중 매체의 혼합을 방지했습니다. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection; PVP = 폴리비닐피롤리돈. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig02.jpg"> 그림 2: 출생 후 발달 중 자연적으로 사육된 대조군(n = 5) 및 ICSI(n = 5) 마우스의 주간 무작위 혈당 수치. 혈당 수치는 혈당계를 사용하여 대조군과 ICSI 마우스의 꼬리 정맥에서 하룻밤 금식 후 매주 측정했습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 통계적 유의성은 이원 분산 분석, ns, P &gt; 0.05를 사용하여 평가하였다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig03.jpg"> 그림 3: 출생 후 발달 중 자연적으로 사육된 대조군(수컷의 경우 n=7, 암컷의 경우 n=7)과 ICSI 처리된 마우스(수컷의 경우 n=7, 암컷의 경우 n=7)의 주간 공복 혈당 수치. 하룻밤 단식 후, 혈당계를 사용하여 공복 대조군과 ICSI 처리된 마우스의 꼬리 정맥에서 혈당 수치를 매주 측정했습니다. 암컷이 아닌 수컷 ICSI 처리 마우스는 생후 8주부터 성별이 일치하는 대조군에 비해 공복 혈당 수치가 크게 상승한 것으로 관찰되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 통계적 유의성은 양방향 분산 분석(two-way ANOVA, ns, P &gt; 0.05, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001)을 사용하여 평가하였다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig04.jpg"> 그림 4: 생후 16주에 자연적으로 사육된 대조군(n = 5) 및 ICSI 처리된 수컷 마우스(n = 5)의 복강 내 포도당 내성 테스트. 하룻밤 단식 후, 마우스는 복강내 포도당 주사(체중 2g/kg)를 받았습니다. 그런 다음 주사 후 0, 30, 60 및 120분에 혈당 수치를 측정했습니다. 수컷 ICSI 처리된 마우스는 자연적으로 사육된 대조군에 비해 IPGTT 중 30분, 60분 및 120분에서 상당히 높은 혈당 수치를 보였습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 분석은 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. ns, P &gt; 0.05. *P &lt; 0.05. 약어: IPGTT = 복강 내 포도당 내성 검사; SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66212/66212fig05.jpg"> 그림 5: 생후 4주에서 20주까지 자연적으로 사육된 대조군(n = 수컷 5명, n = 암컷 5명) 및 ICSI 처리된 마우스(n = 수컷 5명, n = 암컷 5명)의 체중 추적. 주간 측정에 따르면 ICSI를 처리한 수컷과 암컷 쥐 모두 생후 8주부터 성별이 일치하는 대조군에 비해 체중이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 분석은 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. P &lt; 0.001입니다. P &lt; 0.0001입니다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66212/66212fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">난모세포(Oocyte)</td>
			<td style="min-width: 60px;">접합자(Zygotes)</td>
			<td style="min-width: 60px;">수정률(%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">2-셀</td>
			<td style="min-width: 60px;">2세포 속도(%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">4-8 셀</td>
			<td style="min-width: 60px;">4-8 세포 속도(%)</td>
			<td style="min-width: 60px;">모룰라</td>
			<td style="min-width: 60px;">Morula 비율</td>
			<td style="min-width: 60px;">배반포(Blastocysts)</td>
			<td style="min-width: 60px;">배반포 비율</td>
		</tr><tr><td style="min-width: 60px;">카우다 정자 ICSI1</td>
			<td style="min-width: 60px;">90</td>
			<td style="min-width: 60px;">84</td>
			<td style="min-width: 60px;">93.33</td>
			<td style="min-width: 60px;">76</td>
			<td style="min-width: 60px;">90.48</td>
			<td style="min-width: 60px;">72</td>
			<td style="min-width: 60px;">85.71</td>
			<td style="min-width: 60px;">69</td>
			<td style="min-width: 60px;">82.14</td>
			<td style="min-width: 60px;">64</td>
			<td style="min-width: 60px;">76.19</td>
		</tr><tr><td style="min-width: 60px;">카우다 정자 ICSI2</td>
			<td style="min-width: 60px;">80</td>
			<td style="min-width: 60px;">72</td>
			<td style="min-width: 60px;">90</td>
			<td style="min-width: 60px;">62</td>
			<td style="min-width: 60px;">86.11</td>
			<td style="min-width: 60px;">59</td>
			<td style="min-width: 60px;">81.94</td>
			<td style="min-width: 60px;">53</td>
			<td style="min-width: 60px;">73.61</td>
			<td style="min-width: 60px;">46</td>
			<td style="min-width: 60px;">63.89</td>
		</tr><tr><td style="min-width: 60px;">카우다 정자 ICSI3</td>
			<td style="min-width: 60px;">60</td>
			<td style="min-width: 60px;">50</td>
			<td style="min-width: 60px;">83.33</td>
			<td style="min-width: 60px;">42</td>
			<td style="min-width: 60px;">84</td>
			<td style="min-width: 60px;">37</td>
			<td style="min-width: 60px;">74</td>
			<td style="min-width: 60px;">32</td>
			<td style="min-width: 60px;">64</td>
			<td style="min-width: 60px;">28</td>
			<td style="min-width: 60px;">56</td>
		</tr><tr><td style="min-width: 60px;">합계</td>
			<td style="min-width: 60px;">230</td>
			<td style="min-width: 60px;">206</td>
			<td style="min-width: 60px;">89.57</td>
			<td style="min-width: 60px;">180</td>
			<td style="min-width: 60px;">87.38</td>
			<td style="min-width: 60px;">168</td>
			<td style="min-width: 60px;">81.55</td>
			<td style="min-width: 60px;">154</td>
			<td style="min-width: 60px;">74.76</td>
			<td style="min-width: 60px;">138</td>
			<td style="min-width: 60px;">66.99</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 마우스 ICSI에 따른 발달 결과. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>아니요.</td>
			<td>아니요. 이식된 배아의 수</td>
			<td>아니요. 출생 (%)</td>
			<td>남성</td>
			<td>여성</td>
			<td>출생률(%)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>합계</td>
			<td>40</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>42.5</td>
		</tr></tbody></table>표 2: ICSI 마우스 배아의 자궁 이식 후 출산 결과. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection.

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 쥐의 뇌에 지속적으로 약물을 주입하는 것이 혈당 수치에 미치는 영향을 보여줍니다. 포도당 대사는 공복 한 쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하고 경구 포도당 투여 전후의 포도당 수치를 측정하여 평가합니다. 인슐린 내성은 특정 간격으로 포도당 수치를 기록하여 마우스에 인슐린을 주입하여 평가합니다.

말초 포도당 수치에 대한 마우스 뇌에 대한 지속적인 약물 주입의 효과 평가

이 프로토콜은 길 항 근, 메트로CCL5, 마이크로 삼 투 펌프 뇌 주입 시스템을 사용 하 여 쥐의 뇌에 전달 하 여 시상 하 부에 chemokine (C C 모티브) ligand 5 (CCL5)의 역할을 연구 합니다. 이 일시적인 억제 CCL5 활동의 중단 hypothalamic 인슐린 신호, 포도 당 옹 졸 및 주변 조직의 인슐린 감도.

쥐의 뇌에 지속적인 약물 주입 시스템 주변 포도 당 옹 졸 Hypothalamic 인슐린 신호를 공부

이 연구에서 우리는 살아있는 유기 체에서 인슐린 모방 화합물을 테스트 하는 유망한 도구로 -비켜 시스템을 설명 합니다. 주요 이점 적절 한 처리량 속도 허용 비용, phytochemicals 인슐린 모방 속성의 id를 포함 합니다.

인슐린 모방 화합물 테스트용 비켜에서 모델

여기에서 우리는 포도당의 꼬리 정맥 주입을 통해 2개의 parabionts의 공유 혈액 순환의 성공적인 설치를 검출하는 새로운 방법을 기술합니다, 이는 최소한의 손상을 일으키는 원인이 되고 parabionts에 치명적이지 않습니다.

카달 정맥 포도당 주사에 의한 파라바이오틱 마우스의 공유 혈액 공급 확립 감지

이 연구는 다낭성 난소 증후군 마우스 모델에서 간 포도당 생산의 직접적인 측정을 설명하며, 꼬리 정맥을 통해 안정적인 동위 원소 포도당 추적자를 사용하여 단식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 함께 한다.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

이 기사에서는 생쥐의 뇌척수액(CSF)에서 포도당 농도를 증가시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 높은 CSF 포도당이 생쥐의 신경변성, 인지 및 말초 포도당 대사에 미치는 영향을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.

마우스 뇌척수액의 포도당 농도 증가를 위한 삼투압 미니펌프 이식

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

마우스 라운드 Spermatid 주입

이 프로토콜은 임신 전 암컷 마우스에서 엽산 또는 콜린의 식이 섭취를 줄이는 방법을 설명하며, 모계 식이요법이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 조사하기 위한 것입니다.

결핍이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 연구하기 위해 산모의 식이 엽산 또는 콜린 수치를 수정합니다.

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

배우세요 생쥐 ICSI-ET 모델을 이용한 세포질 내 정자 주입 기술로 자손의 혈당 대사 변화를 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 생식 건강과 대사 질환 연구에 중요한 기초를 제공합니다.

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

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