Name: Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 SARS-CoV-2 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프를 다중 이중 리포터 전략으로 프로파일링하는 방법을. 이 기법은 바이러스-숙주 상호작용 연구와 항바이러스 약물 선별에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Dual-Reporter 및 Multiplex 기술을 사용한 SARS-CoV-2 분석

<ol><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+features+of+enveloped+viruses+and+implications+for+immunogen+design+for+next-generation+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common features of enveloped viruses and implications for immunogen design for next-generation vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li>
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<li>Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+multiplex+dual+reporter+IgG+and+IgM+SARS-CoV-2+neutralization+assay+for+a+multiplexed+bead-based+flow+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62487(2021).</li>
<li>Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).</li>
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<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Luminex+xMAP+assay+for+simultaneous+detection+of+antibodies+against+rabbit+hemorrhagic+disease+virus%2C+Sendai+virus%2C+and+rabbit+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High-throughput Luminex xMAP assay for simultaneous detection of antibodies against rabbit hemorrhagic disease virus, Sendai virus, and rabbit rotavirus.</a> Archives of Virology. 164 (6), 1639-1646 (2019).</li>
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<li>Opalka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantitation+of+antibodies+to+neutralizing+epitopes+on+virus-like+particles+for+human+papillomavirus+types+6%2C+11%2C+16%2C+and+18+by+a+multiplexes+lumina+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on virus-like particles for human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18 by a multiplexes lumina assay.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 108-115 (2003).</li>
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<li>Niraja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+virometry+process+proposed+for+detection+of+SARS-CoV-2+and+large-scale+screening+of+COVID-19+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">A flow virometry process proposed for detection of SARS-CoV-2 and large-scale screening of COVID-19 cases.</a> Future Virology. 15 (8), 525-532 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>ACE2-Biotin</td><td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td><td>AC2-H82E6-25 ug</td><td>Conc: 340 &micro; g/mL, LOT#BV35376-203HFI-2128</td></tr><tr><td>Anti-Goat IgG, PE 활용</td><td>Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA)&nbsp;</td><td>705-116-147</td><td>숙주 종: 당나귀&nbsp;</td></tr><tr><td>반인간 IgG R-PE&nbsp;</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>H10104</td><td>Conc: 0.15 mg/mL, LOT#2079224, 숙주 종: Goat</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, PE-conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>115-116-146</td><td>숙주 종: 염소&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-래빗 IgG, PE-활용&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch(펜실베이니아주 웨스트 그로브)&nbsp;</td><td>111-116-144</td><td>숙주 종: 염소&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>20RUO</td><td>100 mM, pH 10 Conc. PBS</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>37528</td><td>LOT#VD301372</td></tr><tr><td>Blocker reagent for ELISA (BRE)</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>11112589001</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-DYKDDDDK Tag 항체 (Anti-FLAG) 0.2 mg/ml, rat IgG2a, &lambda;</td><td>BioLegend (네덜란드 암스테르담)</td><td>637321</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Saveen & Werner (Limhamn, Sweden)</td><td>B2000-500</td><td>LOT#04D5865</td></tr><tr><td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td><td>Proteochem (Hurricane, UT)</td><td>C1100-custom (65 mg)</td><td>LOT# MK3857</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-ACE2 polyclonal antibody</td><td>R& D Systems/Bio-Techne (미네소타주 미니애폴리스)</td><td>AF933</td><td>숙주 종: 염소&nbsp;</td></tr><tr><td>Goat IgG</td><td>Bethyl Labs (Montgomery, TX)</td><td>P50-200</td><td>LOT#P50-200-6</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>저결합 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브&nbsp;</td><td>VWR (Radnor, PA)</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex-C Microspheres</td><td>Luminex Corporation (Austin, TX)</td><td>MC10XXX-01</td><td></td></tr><tr><td>MEM tissue cuture media</td><td>Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>21430-020</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96-Well, 폴리스티렌, 절반 면적, Clear</td><td>Greiner Bio-One (Kremsm&uuml; nster, Austria)</td><td>675101</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)</td><td>25080-060</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (매사추세츠주 월섬)</td><td>31000</td><td>LOT#UK292857</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Medicago AB (스웨덴 웁살라)</td><td>09-9400-100</td><td>LOT#272320-01</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco/Thermo Fisher (매사추세츠주 월섬)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올)</td><td>Sigma-Aldrich (미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td></td><td></td>360627</tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>ProClin 300</td><td>Sigma-Aldrich (미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>48915-U</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Bethyl Labs (Montgomery, TX)</td><td>P120-301</td><td>LOT#12</td></tr><tr><td>scFv-FAb1</td><td>자체 생산</td><td></td><td>인간 항체 치료제, Scilifelab, Sweden. 단클론 scFv. 농도 : 0.12 mg / mL.</td></tr><tr><td>scFv-FAb2</td><td>자체 생산</td><td></td><td>인간 항체 치료제, Scilifelab, 스웨덴. 단클론 scFv. 콘크 배치1: 0.38mg/mL. Conc batch2: 0.45 mg/mL</td></tr><tr><td>scFv-FAb3</td><td>자체 생산</td><td></td><td>인간 항체 치료제, Scilifelab, 스웨덴. 단클론 scFv. 농도 : 0.34 mg / mL.</td></tr><tr><td>scFv-FAb4</td><td>자체 생산</td><td></td><td>인간 항체 치료제, Scilifelab, 스웨덴. 단클론 scFv. 농도 : 2.85 mg / mL.</td></tr><tr><td>scFv-FAb5</td><td>자체 생산</td><td></td><td>인간 항체 치료제, Scilifelab, 스웨덴. 단클론 scFv. 농도 : 2.7mg / mL.</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 감염 입자, 스웨덴 분리 사</td><td>내 생산&nbsp;</td><td></td><td>스웨덴 공중보건국</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 스파이크 항체 (Hu-anti-S1)</td><td>Novus Biologicals (Centennial, CO)</td><td>NBP2-90980&nbsp;</td><td>단클론 항체. 농도 : 1 mg / mL. 진행자: 인간. 클론: CR3022. 동형: IgG1 카파. LOT#T201B06</td></tr><tr><td>인산나트륨 단염기성, 무수</td><td>시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide)</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>24510</td><td>LOT#</td></tr><tr><td>XH321563 Tween</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>BP337-50</td><td>LOT#194435</td></tr><tr><td>자외선 램프</td><td>Vilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Germany)</td><td>VL-215. G</td><td>파장 = 254 nm; 2 &times; 15 와트 전구</td></tr><tr><td>Vero E6 셀</td><td>ATCC (Manassus, VA)</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE (듀얼 리포터 플로우 기기)</td><td>Luminex Corporation (오스틴, 텍사스)</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex dual-reporter strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

활용 테스트 접합 테스트는 goat-IgG와 neutravidin-biotinylated ACE2가 미세구에 성공적으로 접합되었음을 보여주었습니다. 분석 검출 특이성은 다양한 동물 종에서 생성된 PE 표지 2차 항체가 있는 ACE2 복합 마이크로구를 조사하여 확인되었습니다(그림 2). 서로 다른 검출 항체 간의 교차 반응은 관찰되지 않았습니다. 염소 항-ACE2 + 항-염소 IgG PE로 비드 혼합물을 조사했을 때, ACE2 및 염소 IgG 접합 마이크로스피어 모두에 대해 배경 위의 중간 형광 강도(MFI, 임의 단위) 값이 검출되었지만, 비접합 마이크로스피어(베어) 또는 비오틴 코팅 마이크로스피어에 대해서는 검출되지 않았습니다. 항-마우스 IgG PE 및 항-토끼 IgG PE를 위양성 신호를 확인하기 위한 음성 대조군으로 사용하였다. 마이크로스피어로 배양할 때 무시할 수 있는 형광 신호가 생성되었으며, 이는 ACE2 및 염소 IgG에 대한 양성 신호가 특이적임을 나타냅니다.
세포 상층액에서 바이러스 입자 검출 가능성 재조합 인간 ACE2에 결합된 마그네틱 비드를 사용하여 감염 및 대조(바이러스 없음) VeroE6 세포 배양 상층액에서 SARS-CoV-2 바이러스 입자를 포획한 다음 단클론 항체와 5개의 별개의 scFv 중 하나를 사용하여 2개의 별개의 바이러스 스파이크 영역을 동시에 조사했습니다. SARS-Cov-2 감염 세포 상층액의 희석액에서 농도 의존적 신호가 두 리포터 채널(RP1 및 RP2)에서 관찰되었으며(그림 3), 이는 상용 Hu-anti-S1 항체와 다른 scFv 모두 ACE2 접합 미세구에 결합된 바이러스 입자를 검출했음을 나타냅니다. 5개의 scFv 중 3개의 바이러스는 1:18(scFv2, scFv3, scFv5)까지 희석하여 검출할 수 있습니다. 나머지 2개의 scFv(scFv7 및 scFv9)의 경우 1:6 희석까지 검출할 수 있습니다. 이는 대상에 대한 다른 친화력에 기인할 수 있습니다. 그림 3 과 표 1에서 볼 수 있듯이 scFv3는 가장 높은 MFI 강도를 제공하고 각각 scFv5, scFv2, scFv7 및 scFv9가 그 뒤를 잇습니다.
전 세계적으로 scFvs 감지는 Hu-anti-S1에 비해 MFI가 낮습니다. 이는 친화도가 낮다는 것을 나타낼 수 있지만 다른 형광 염료(PE 및 BV421)로 라벨링하기 때문에 인공물일 수도 있습니다. scFv7 및 scFv9에서 볼 수 있는 또 다른 추세는 다른 세 가지 컨피그레이션에 비해 RP1 채널(안티스파이크)에 대한 MFI 값이 약간 낮다는 것입니다. 이는 scFv가 ACE2-Hu-anti-S1 상호 작용과 교차 반응하거나 다른 방식으로 간섭하고 있음을 나타낼 수 있으며, 이는 RP2 채널의 더 낮은 신호를 설명할 수도 있습니다. RP1 또는 RP2 채널에서 감염되지 않은 Vero E6 세포의 상층액에서 바이러스 입자가 검출되지 않았습니다.
뉴트라비딘-비오틴 복합 미세구, 염소-IgG 미세구 및 비접합 미세구는 음성 대조군 비드로 사용됩니다. 바이러스 입자는 ACE2에 결합된 자기 미세구로 포획하고 RP1 리포터 채널에서 상용 인간 안티 스파이크로 테스트하고 RP2 리포터 채널에서 다른 scFv로 테스트했습니다(scFv는 각 패널의 왼쪽 상단에 표시됨). 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플에서 바이러스 입자가 검출되지 않았습니다.
분석 정밀도 및 견고성 분석 정밀도를 평가하기 위해 모든 조건을 삼중으로 실행했습니다. ACE2 마이크로스피어에 대한 분산 계수(CV)는 각 희석 지점에 대해 계산되었습니다. 분석을 위해 계산된 모든 CV는 15% 미만이었으며, 여기서 가장 높게 측정된 CV는 13%였고 가장 낮은 CV는 1%였습니다(표 2). RP1 채널의 밀도 플롯(그림 4)에서 볼 수 있듯이 상용 Hu-anti-S1의 PE 검출은 주로 3%의 CV에 집중되어 더 높은 정밀도를 보여줍니다. RP2 채널, scFV의 BV 감지는 더 높은 CV를 보여줍니다. 그러나 표 2 에서 볼 수 있듯이 CV의 더 높은 범위는 블랭크와 같은 바이러스 입자의 농도가 낮은 샘플에 의해 주도됩니다. 프로토콜의 견고성을 테스트하기 위해 서로 다른 작업자가 서로 다른 날짜에 생성된 비드 혼합물과 더 적은 샘플 부피(72% 더 낮음)를 사용하여 분석을 두 번 반복했습니다. RP1 및 RP2 채널 모두에서 0.98과 1 사이의 매우 우수한 Pearson 상관 관계가 관찰되었으며(p-값 &lt; 0.01), 이는 분석 견고성과 사용 가능한 샘플이 적을 때 분석을 적용할 가능성을 확인했습니다(그림 5). 이 유동 분석 기술은 "주변 분석물 이론"17을 따르므로 분석은 농도에 민감하지만 부피에는 민감하지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig01.jpg"> 그림 1: 바이러스 입자 분석. (A) 감염된 세포와 감염되지 않은 Vero E6 세포 모두의 세포 상층액을 96웰 또는 384웰 플레이트에 연속 희석하여 뉴트라비딘과 접합된 자기 마이크로스피어와 함께 첨가한 다음 비오틴화된 인간 ACE2 또는 비오틴에 결합합니다. 염소-IgG 및 베어 마이크로스피어와 결합된 비접합 마이크로스피어는 뉴트라비딘-비오틴 복합 마이크로스피어와 함께 음성 대조군으로 사용됩니다. (B) 형성된 마이크로스피어-바이러스 입자 복합체는 Hu-anti-S1과 FLAG-tag가 있는 다양한 scFv 중 하나로 구성된 검출 칵테일로 검출됩니다. 그런 다음 scFv를 표적으로 하는 Hu-anti-S1 및 anti-FLAG Brilliant Violet 421을 표적으로 하는 항인간 IgG PE와 형광 혼합물을 첨가합니다. (C) 3개의 레이저, 이중 검출 시스템은 적색, 녹색 및 보라색 레이저를 방출하여 미립자 복합체를 검출합니다. 적색 레이저는 마이크로스피어 염료 라벨을 감지하는 반면, 녹색 및 보라색 레이저는 각각 anti-S1 및 scFv를 감지합니다. 그런 다음 생성된 데이터를 분석합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig02.jpg"> 그림 2: 접합 확인 플롯. 비드 혼합물은 각각 다른 단백질, 즉 뉴트라비딘-비오틴-ACE2(ACE2), 비결합 미세구(베어 비드), 뉴트라비딘-비오틴(비오틴) 및 염소-IgG(염소 IgG)와 접합된 4개의 서로 다른 마이크로스피어 ID로 구성되었습니다. 접합 테스트에서는 세 가지 다른 구성의 검출 형광단이 사용되었습니다. 즉, 염소 항 ACE2 + 항 염소 IgG PE, 항 마우스 IgG PE 및 항 토끼 IgG PE. Y축은 세 가지 다른 조건을 가진 각 마이크로스피어에서 측정된 평균 MFI(median fluorescence intensity; 임의 단위) 신호를 보여줍니다. X축은 적용된 다양한 포획 항체를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig03.jpg"> 그림 3: 표면 단백질의 다중 검출. Y축: 조건당 3중 웰에서 분석된 각 샘플에 대한 평균 MFI(median fluorescence intensity, 임의 단위 ± 표준 편차)입니다. X축: 세포 상층액의 연속 희석점. 주황색: SARS-CoV-2 WT에 감염된 Vero E6의 상층액에 있는 바이러스 입자가 인간 항 스파이크 + 항인간 PE(피코에리트린)로 감지되었습니다. 파란색: SARS-CoV-2 WT에 감염된 Vero E6의 상층액이 다른 scFvs + anti-FLAG Brilliant Violet 421로 감지되었습니다. 회색: 인간 안티 스파이크 + 안티 인간 PE로 검출된 비감염 세포 상층액. 검정색: 5가지 scFvs + anti-FLAG Brilliant Violet 421로 검출된 비감염 세포 상층액. 바이러스 입자는 ACE2에 결합된 자기 마이크로스피어로 포획하고 RP1 리포터 채널에서 상용 인간 안티 스파이크 항체로 테스트하고 RP2 리포터 채널에서 다른 scFv로 테스트했습니다(scFv는 각 패널의 왼쪽 상단에 표시됨). 감염되지 않은 샘플에서 바이러스 입자가 검출되지 않았습니다. scFv3에 의해 표적이 된 에피토프(epitope)는 친화도가 가장 높았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig04.jpg"> 그림 4: 변동 분산 플롯. Y축은 사건의 빈도이고, X축은 서로 다른 표본의 각 반복실험에 대한 분산 계수(CV)를 백분율로 표시합니다. RP1 및 RP2는 각각 phycoerythrin 및 Brilliant Violet 421과 관련된 형광을 감지하는 첫 번째 및 두 번째 리포터 채널입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66230/66230fig05.jpg"> 그림 5: 상관 행렬 실행. (A,B) Y축: 세 개의 다른 작업자와 다른 비드 혼합물로 실행되는 세 개의 개별 런 사이의 log10-scale의 Pearson 상관 행렬. 세 번째 실행에서 더 낮은 샘플 부피가 적용되었습니다. 히스토그램은 측정된 MFI를 기반으로 여러 변수 군집의 분포를 보여줍니다. (A) 서로 다른 실행 간의 RP1 리포터 채널에 대한 상관 관계. (B) 서로 다른 실행 간의 RP2 리포터 채널에 대한 상관 관계. MFI=임의의 단위의 평균 형광 강도. P &lt; 0.001입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/66230fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>탐지</td>
			<td>반응성</td>
		</tr><tr><td>scFv2</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>scFv3</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>scFv5</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>scFv7</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>scFv9</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>인간 안티 스파이크 IgG</td>
			<td>++++</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 표준 곡선에서 얻은 MFI 강도를 기반으로 한 검출에서 scFv의 순위. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>RP1 (PE)</td>
			<td>RP2 (BV421)</td>
		</tr><tr><td>시료 희석</td>
			<td>CV 범위 [%]</td>
			<td>CV 범위 [%]</td>
		</tr><tr><td>빈</td>
			<td>3–11</td>
			<td>2–13</td>
		</tr><tr><td>1:1458</td>
			<td>1–7</td>
			<td>2–7</td>
		</tr><tr><td>1:456</td>
			<td>4–6</td>
			<td>3–8</td>
		</tr><tr><td>1:162</td>
			<td>3–6</td>
			<td>3–7</td>
		</tr><tr><td>1:54</td>
			<td>2–4</td>
			<td>2–4</td>
		</tr><tr><td>1:18</td>
			<td>2–4</td>
			<td>1–4</td>
		</tr><tr><td>1:6</td>
			<td>2–6</td>
			<td>1–6</td>
		</tr><tr><td>1:2</td>
			<td>1–5</td>
			<td>1–3</td>
		</tr></tbody></table>표 2: RP1 및 RP2 리포터 채널 모두에 대한 SARS-CoV-2 감염 상층액의 각 희석 지점의 CV%(평균/표준 편차 × 100) 범위.
보충 파일 1: 면역글로불린 단쇄 가변 단편(scFv) 생성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 재조합 스파이크(RBD)의 직렬 희석에 대해 Fab와 쌍으로 scFv를 스크리닝합니다. 다양한 검출 펩타이드의 성능을 평가하기 위해 스파이크 단백질인 Fab의 12가지 조합을 재조합 RBD로 스파이크된 완충액에서 포획으로 사용했습니다. 스파이크 단백질의 상이한 항원결정기를 표적으로 하는 10개의 scFv를 검출로 적용하였다. 캡처-탐지 쌍의 성능에 따라 실패(-) 또는 성공(+)으로 표시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: SARS-Cov-2에 감염된 Calu-3 세포 상층액의 연속 희석에 대해 Fabs와 쌍을 이루는 scFv 스크리닝. 다양한 검출 펩타이드 성능을 평가하기 위해 SARS-Cov-2에 감염된 Calu-3 세포 상층액에서 스파이크 단백질인 Fab의 12가지 조합을 포획으로 사용했습니다. 스파이크 단백질의 상이한 항원결정기를 표적으로 하는 10개의 scFv를 검출로 적용하였다. 캡처-탐지 쌍의 성능에 따라 실패(-) 또는 성공(+)으로 표시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66230/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

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여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

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여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

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멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

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