Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

뮬러 세포는 망막의 주요 신경교세포입니다. 그들은 망막의 대사적으로 활발한 뉴런을 유지하는 데 매우 중요한 역할을 합니다. 우리 연구실은 마우스 눈에서 뮬러 세포를 분리하는 기술을 확립했습니다. 이 기술을 통해 다양한 망막 질환에서 뮬러 세포의 역할을 연구하고, 질병의 발병기전을 이해하고, 치료 표적을 개발할 수 있습니다.

[해설자] 기관에서 승인한 방법에 따라 윤리적으로 마우스를 안락사시키십시오. 안와 부위에 5/45 스타일 핀셋을 눌러 안구 돌출을 유도한 후 핀셋의 팔을 눈 뒤쪽에 위치시켜 눈을 적출한 다음 안와 부위에서 부드럽게 당깁니다. 눈을 10mL의 뮬러 세포 안구 용액에 넣고 밤새 또는 실온에서 약 18시간 동안 그대로 둡니다. 18시간 후, 버릴 튜브에서 눈 용액을 부어 디캔팅합니다. 따뜻한 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 눈을 씻습니다. PBS를 폐기할 튜브에서 부어 다시 디캔팅합니다. 그런 다음 10mL의 트립신 용액이 들어 있는 100mm 페트리 접시에 눈을 넣습니다. 접시를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도 및 5% CO2에서 1.5-2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 눈을 약 5mL의 완전한 1차 뮬러 세포 성장 배지가 들어 있는 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 더 나은 가시성과 명확한 시연을 위해 비디오가 후드 외부에서 녹화되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 실제 실험의 경우 그림과 같이 층류 후드에서 수행해야 합니다. 눈을 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작합니다. M5S 스타일 핀셋과 Vannas 가위를 사용하여 결합 조직, 외안근 및 시신경을 제거합니다. 여기에서 시신경은 Vannas 가위로 절단됩니다. M5S 스타일 핀셋으로 눈을 잡고 Vannas 가위 또는 주사기 바늘로 ora serrata 부분을 절개합니다. 두 개의 M5S 스타일 핀셋으로 절개 부위를 잡고 눈의 뒤쪽 부분에서 각막을 당기거나 찢기 시작합니다. 망막의 무결성이 손상되지 않도록 조금씩 당깁니다. 다음은 아이컵 뒤쪽에서 각막을 제거하는 방법에 대한 데모입니다. 수정체와 신경망막이 노출되면 홍채가 부착되어 있을 가능성이 있는 눈의 색소층을 제거합니다. 그런 다음 수정체에서 신경망막을 제거합니다. 분리의 순도를 높이기 위해 신경망막에서 색소 조직을 제거합니다. 신경망막의 끈적끈적한 특성을 감안할 때 모든 색소 조직을 제거할 가능성은 거의 없습니다. 모든 신경 망막을 모아 더 작은 조각으로 찢습니다. 4mL의 완전한 1차 뮬러 세포 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 신경망막을 플레이트합니다. 마지막으로 플라스크를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도 및 5% CO2에서 배양합니다. 패널 A는 0계대와 1계대에서 건강한 뮐러 세포 배양을 보여줍니다. 색소가 부족하다는 것은 분리의 주요 오염 물질인 RPE 세포가 없음을 나타냅니다. 이것은 RP 특정 마커인 RP65를 사용하여 패널 B에서 강화됩니다.