Name: Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 배우세요 생쥐 눈에서 Müller 신경교세포를 분리하는 세포생물학 기법입니다. 이 방법은 망막 질환 연구와 치료 표적 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute, NEI)와 국립안과학연구소(National Eye Institute, NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜은 Müller 세포 분리 프로토콜에 따라 수정된 버전인 Sylvia B. Smith 박사에게 감사드립니다.

동물을 대상으로 한 모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명을 준수했으며 IACUC(Institute for Animal Care and Use Committee) 및 오클랜드 대학교 정책(프로토콜 번호 2022-1160)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 매체 및 용액 준비
<ol><li>1:1000으로 희석하여 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM, 재료 표의 세부 정보)을 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하여 Müller 세포 안구 용액을 준비합니다. 예를 들어, DMEM 10mL의 경우 페니실린/스트렙토마이신 10μL를 추가합니다. 참고: 이 제품은 제조된 간단한 무혈청 배지입니다. 또한 세포 배양 작업에 사용하기 전에 전체 배지를 37°C 수조에서 데우십시오.</li>
	<li>DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS, 열 비활성화) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지를 준비합니다. 예: (DMEM 배지 500mL + FBS 50mL + 페니실린/스트렙토마이신 5mL).</li>
	<li>200U/mL 농도의 콜라겐분해효소 IV와 함께 0.05% 트립신-EDTA 용액을 준비합니다(트립신-EDTA는 필요한 농도에 도달하기 위해 계산된 양의 콜라겐분해효소 IV 분말을 용해하는 데 사용됨).</li>
</ol>2. 적출
<ol><li>IACUC 지침에 따라 CO2 흡입을 사용하여 마우스를 윤리적으로 안락사시킵니다.<ol><li>간단히 말해서, 동물을 CO2 챔버에 넣어 100 % CO2 를 CO2 로 챔버 부피 / 분의 30-70 %의 충전 비율로 도입하여 마우스에 대한 고통을 최소화하면서 2-3 분 이내에 빠른 무의식 목표를 달성합니다.</li>
		<li>생쥐는 어린 나이(~10일)이기 때문에 적절한 안락사를 보장하기 위한 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>작업 영역을 70% 에탄올로 멸균한 후 멸균 언더패드에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>핀셋의 팔을 눈 뒤쪽에 위치시키고 안와 부위를 부드럽게 잡아 당겨 눈을 추출하고 5/45 스타일의 핀셋으로 안와 부위에 압력을 가하여 눈을 적출하여 돌출부를 일으킵니다. 알림: 해부 전에 70% 에탄올로 해부 도구를 소독한 다음 인산염 완충 식염수로 소독하십시오.</li>
	<li>눈을 천천히 적출하여 시신경이 여전히 눈과 연결되어 있는지 확인하십시오. 시신경(시각적으로 흰색 끈으로 식별됨)을 눈 뒤로 당겨야 합니다. 참고: 이 단계는 현미경으로 수행할 필요가 없으며 멸균된 벤치에서 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 적출된 눈의 치료
<ol><li>15mL 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 튜브에 10mL의 Müller cell eye 용액을 채웁니다.</li>
	<li>절개된 눈을 Müller 세포 안구 용액이 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 실온에서 하룻밤 또는 약 18시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>18시간 후 아이 용액을 디캔팅하고 따뜻한(37°C) 인산염 완충 식염수(PBS) 2-3mL로 눈을 잠시 헹굽니다.</li>
	<li>PBS를 디캔팅하고 눈을 10mL의 트립신 용액이 들어 있는 100mm 페트리 접시로 이동합니다. (1.3 단계에서 준비). 참고: 트립신은 적출된 눈 전체에 사용되며, 박리 중에 망막층에서 세포를 분리하는 것을 용이하게 하는 해리제 역할을 합니다. 절개된 망막에는 RPE 세포를 포함한 많은 세포가 있는데, 이 세포들은 끈적거리고 Müller 세포 배양을 오염시킬 가능성이 가장 높다14. 현미경 검사는 5일 동안 분리한 후(첫 번째 배지 교체 중) RPE 세포가 플레이트에서 분리되어 죽었다는 것을 명확하게 보여주었습니다13. RPE 분리에 사용되는 배지는 DMEM/F-12이며, DMEM(Müller 세포 분리에 사용)과 조성이 다르며 피루브산나트륨과 저포도당을 함유하고 있습니다.</li>
	<li>접시를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO2 에서 1.5-2 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 약 5mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 눈을 옮깁니다.</li>
</ol>4. 해부
참고: 이 절차는 배양 후드의 멸균 환경에서 수행해야 합니다. 따라서 모든 도구 및 해부 현미경과 함께 후드 표면을 70% 알코올로 철저히 살균하는 것이 중요합니다. 비디오는 더 나은 가시성과 더 명확한 시연 목적을 위해 후드 외부에서 녹화되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
<ol><li>멸균된 실험실 등급 조직의 작은 조각을 접시에 넣어 해부 중에 눈을 안정시키는 데 도움이 됩니다. 눈을 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작합니다. 알림: 실험실 등급의 조직을 사용하면 액체가 채워진 접시(완전한 미디어)에서 눈의 움직임을 용이하게 하여 정확한 절개를 보장합니다.</li>
	<li>Vannas 가위와 M5S 스타일 핀셋을 사용하여 결합 조직, 외안근 및 시신경을 제거합니다.<ol><li>M5S 스타일 핀셋으로 눈을 잡고 Vannas 가위 또는 주사기 바늘로 ora serrata 부분을 절개합니다. 참고: 눈의 앞쪽과 뒤쪽 부분 사이에는 오라 세라타(ora serrata)라고 하는 연한 파란색 원형 선이 있으며, 이는 절개 중 정확한 방향을 위한 랜드마크로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>M5S 스타일의 핀셋으로 절개 부위를 잡고 눈의 뒤쪽에서 각막을 당기거나 찢습니다. 망막의 무결성이 손상되지 않도록 조금씩 당깁니다. 참고: 이 단계는 안구의 뒤쪽 부분(신경 및 색소 망막)에서 눈의 앞부분(각막, 홍채 및 수정체)을 제거하는 것입니다.</li>
		<li>망막층의 온전함을 유지하려면 신경 망막에서 망막 색소 상피를 부드럽게 당겨 제거합니다. 신경 망막은 가능한 한 격리의 순도를 보장하기 위해 검은 반점이 없어야 하는데, RPE 층은 일반적으로 끈적거리고 신경 망막에 붙어 있기 때문입니다.</li>
		<li>절개된 신경 망막을 작은 조각으로 잘라 접시에 모아 접시에 세포가 균일하게 퍼지도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 신경 망막을 플레이트합니다.</li>
	<li>마지막으로 플라스크를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO2 에서 배양합니다.</li>
</ol>5. primary Müller glial cell의 배양
<ol><li>세포 성장을 촉진하기 위해 3-5일 동안 플라스크를 움직이지 마십시오.</li>
	<li>5일째 되는 날과 그 이후에는 세포가 90% 합류할 때까지 격일로 매체를 교체합니다.</li>
</ol>6. 일차 Müller 신경교세포(primary Müller glial cells)의 passaging
<ol><li>Müller 세포 배양 배지를 흡인한 다음 PBS에서 2mL의 세척을 하고 PBS를 흡인합니다. 0.25% 트립신-EDTA(1x) 2mL 또는 플레이트를 덮을 만큼의 첨가합니다.</li>
	<li>실온에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>현미경 아래의 플레이트에서 셀이 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 4mL의 사전 따뜻한(37°C) 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지(1.2단계에서 준비)를 수집 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>300 x g에서 7분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인한 후 펠릿을 10mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지에 재현탁시킵니다. 세포 수는 절개된 눈의 수에 따라 달라질 수 있기 때문에 파종 및 배양 전에 세포를 세는 것이 좋습니다. 권장되는 파종 밀도는 T75 플라스크에서 3.0 x 106 셀입니다. 알림: 세포는 최대 4-5회까지 통과할 수 있습니다. 그러나 가장 일관된 실험 결과는 1-2 구절 후에 발견됩니다.</li>
</ol>7. 면역형광(Immunofluorescence)
참고: 면역형광 프로토콜을 사용하여 Müller 세포 특이성을 염색하고 검증하십시오. 다음은 immunofluorescent protocol에 대한 간략한 개요입니다. 이 단계는 첫 번째 구절12 이후에 수행됩니다.
<ol><li>세포를 Cell Culture Chamber Slide(8웰 챔버 슬라이드의 경우 웰당 30,000개의 세포)에 파종합니다.</li>
	<li>37 ° C 및 5 % CO2 에서 완전한 Müller 세포 배양 배지 (단계 1.2에서 준비)에서 24-48 시간 동안 분리 된 세포를 배양합니다.</li>
	<li>매체를 흡인하고 셀이 250-300% 합류할 때 각 웰에 1x PBS의 250-90μL로 챔버 슬라이드를 세척합니다.</li>
	<li>각 웰의 250-300 μL에 4% 파라포름알데히드를 넣고 10-15분 동안 슬라이드를 고정한 다음 PBS/TX-100(각 5분/3회)으로 세척합니다.</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 차단 버퍼를 추가합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>차단 용액을 흡인한 다음 Müller 세포에 특이적인 1차 항체를 추가하여 글루타민 합성효소 및 비멘틴 5,12를 사용하여 분리된 세포의 순도를 확인합니다. 37 °C에서 3 시간 동안 배양합니다 (150-200 μL/slide 부피의 차단 완충액에서 1:100-1:200의 항체 농도 사용). PBS/TX-100 세척(각 5분 및 10분)으로 슬라이드를 세척합니다. 참고: 이러한 항체는 Müller 세포를 식별하고 Müller 세포 배양의 성공과 순도를 보장하기 위한 특징이기 때문에 선택되었습니다.</li>
	<li>2차 항체(150-200 μL/슬라이드의 차단 완충액에서 1:1000 범위의 항체 농도)를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS/Triton X-100으로 3회(각 5-10분) 세척합니다.</li>
	<li>커버슬립으로 슬라이드를 덮기 전에 DAPI 장착 매체 한 방울을 적용하여 핵에 라벨을 붙입니다. 커버슬립을 놓을 때 기포를 피하십시오.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인하고 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조). 참고: 셀은 10x 배율에서 359/461 (예: 10x 배율)에서 DAPI로 위치합니다. 더 높은 배율은 세포를 캡처할 수 있습니다. 다른 파장은 선택한 색상에 따라 다릅니다. 녹색(GFP)- 예: 488/510. 붉은 색 (Cy3) - 예 / em 555/569.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이 문서의 내용과 관련이 있다고 선언할 이해 상충이 없습니다.

생쥐에서 원발성 망막 색소 상피(RPE)를 분리하는 것은 이전에 우리 연구실에서 문서화되었습니다. 이 원고는 1차 Müller 세포 분리를 위한 자세한 시연 프로토콜을 설명합니다. 이 절차에는 쥐의 눈에서 분리한 Müller 세포의 적출, 치료, 절개, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다. 이는 이전 간행물에서 발견된 이전에 성공한 프로토콜과 최근 간행물1 2,13에서 사용한 수정된 프로토콜을 기반으로 합니다. 단계는 간단하지만 성공적인 Müller 세포 분리를 위해서는 특정 제한 사항 및 필수 요구 사항을 준수해야 합니다. 이 프로토콜을 최적화하기 위한 수많은 시행착오 시도 끝에 성공에 영향을 미치는 여러 요인이 확인되었습니다.
우리의 실험에서 관찰된 이상적인 마우스 나이는 분리된 세포를 최대 4개의 통로까지 성장시키기 위해 5-11일 사이인 것으로 밝혀졌습니다. 문화는 또한 얼마나 많은 눈이 고립되고 배양되는지에 따라 영향을 받습니다. 단일 분리의 경우, 성장하고 증식할 수 있는 충분한 수의 세포를 얻기 위해 최소 두 개의 눈이 필요합니다. 또 다른 중요한 측면은 적리와 도금 사이의 지속 시간입니다. 따라서 이 단계는 비교적 빠르게 수행해야 합니다. 눈 조직을 장기간 조작하면 세포가 플라스크에 부착하고 증식하는 능력에 해로운 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다. 분리된 세포의 근접성이 증식을 촉진할 수 있을 만큼 충분히 가까운지 확인하려면 T25 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다. 첫 번째 통로가 만들어지면 셀을 T75에 도금할 수 있습니다. 또한 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크를 제거하거나 배지를 전환하여 분리 및 파종 후 세포를 방해해서는 안 됩니다. 마지막으로, 세포는 부착을 멈추기 전에 약 4번만 통과할 수 있습니다. 이 절차는 간단하고 수행하기 쉽지만 마우스의 나이, 제한된 수의 세포 통로 등을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
Müller 세포 분리를 위한 프로토콜은 많지 않지만 이 프로토콜과 사용 가능한 프로토콜 5,14에서 사용할 수 있는 몇 가지 눈에 띄는 차이점이 있습니다. 첫째, 적출과 분리 사이의 시간이 크게 다릅니다. 다른 프로토콜은 적출 직후, 일반적으로 10분 이내에 절개를 제안합니다. 현재 프로토콜은 이 프로토콜에서 격리에 대한 최상의 결과를 제공하기 때문에 최소 18시간의 휴식 기간을 제안합니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 또 다른 중요한 차이점은 눈이 효소로 치료되는 지점입니다. 이 프로토콜에서는 결합 조직과 외안근을 제거하기 전에도 해부를 수행하기 전에 눈을 치료합니다. 다른 프로토콜은 효소 치료 전에 눈에서 망막을 분리합니다. 또한 효소 제조법도 다릅니다. 이 프로토콜에서 효소 용액은 트립신과 콜라겐 분해 효소 유형 IV로 구성됩니다. 유사한 프로토콜에서 파파인과 DNase는 조직 분해에 사용됩니다. 또한, 배양 용기는 다르며, 이 프로토콜은 첫 번째 통과 후 T25에서 배양한 다음 T75에서 배양할 것을 제안합니다. 다른 프로토콜은 페트리 접시 또는 멀티 웰 플레이트를 사용합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 세포 성장을 촉진하기 위해 플라스크를 방해해서는 안 된다는 것을 제안합니다(5-7일 동안). 다른 프로토콜에서는 미디어 변경이 하루 후에 수행됩니다.

뮐러 세포(Müller cell, MC)는 망막 조직에서 발견되는 가장 풍부하고 주요한 신경교세포(glial cell)입니다. 그들은 망막 내에서 구조적 무결성과 대사 기능을 제공하는 데 핵심적인 역할을 합니다1. MC의 전략적 구조는 망막 두께 전체에 퍼져 있어 망막을 지지합니다. 스캐폴드와 같은 특성 외에도 망막 뉴런의 대사 기능을 가지고 있어 포도당과 젖산을 포함한 에너지 기질을 공급합니다. 이러한 기능은 건강한 신경 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다. 손상된 MC는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 녹내장을 포함한 다양한 망막 질환에 기여하는 것으로 보고되었습니다 2,3. MC는 망막의 재생 치료를 위한 내인성 세포 공급원이 될 수 있다1. 이들은 또한 망막의 상당 부분을 구성하며, 강력한 증거에 따르면 여러 종에서 이러한 세포가 누락된 뉴런을 대체하도록 자극될 수 있습니다2. 망막은 뉴런과 유익하게 협력하며, 원뿔 모양으로 분지된 뮐러 세포의 끝 부분은 혈관을 조밀하게 풀어내고 망막의 신경 구성 요소를 연결합니다. 뉴런 발달과 뉴런 가소성을 유지하기 위해 뮐러 세포는 뉴런의 부드러운 기질로 작용하여 기계적 외상으로부터 뉴런을 보호한다3. 또한 병리학적 상황에서 Müller 세포는 손실된 광수용체와 뉴런을 복제하거나 재생하는 신경 전구 세포 또는 줄기 세포로 분화할 수있습니다 2,3,4. 뮐러 세포(Müller cell)는 자기 재생 및 분화(self-renewal and differentiation)를 위한 다양한 수준의 잠재력을 포함하여 망막 줄기 세포의 특성을 유지합니다 5,6. 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)는 신경영양인자(neurotrophic factor)를 생성하고, 신경전달물질을 흡수 및 재활용하며, 이온을 공간적으로 완충하고, 망막의 항상성을 유지하기 위해 혈액-망막 장벽을 유지하는 중요한 망막 계통을 가지고 있습니다 7,8,9. 이는 망막 변성과 관련된 질병을 치료하기 위한 세포 기반 치료에서 유망한 도구로서 Müller 세포의 잠재력을 강조합니다. 뮐러 세포(Müller cell)는 망막 전체에 분포되어 있는 주요 신경교세포(glia)로, 뉴런과 혈관에 연결되어 있습니다. 망막 세포는 망막 세포의 생존력과 안정성을 유지하기 위해 필수적인 구조적 및 대사적 지원을 제공하는 중요한 보호 역할을 합니다. 불행히도, 문헌에서 망막10,11로부터의 일차 뮐러 세포 분리에 대한 프로토콜은 거의 발견되지 않는다.
당사는 mouse primary Müller 세포를 신뢰성 있게 분리하고 배양하기 위한 향상된 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 야생형 C57BL/6 마우스 및 형질전환 마우스12,13에서 Müller 세포를 분리하기 위해 우리 그룹에서 사용되었습니다. 성별 선호도가 없는 5일에서 11일 사이의 생쥐가 이 프로토콜에 사용됩니다. 세포는 최대 4 번 통과되었습니다. 그러나 P4가 되면 플라스크에 더 이상 붙지 않게 되고, 건강한 문화를 성장시키기가 어려워집니다. 배양액은 종종 RPE(Retinal Pigmented Epithelial) 세포로 오염되므로 세포주에 대한 추가 실험을 수행하기 전에 세포를 한 번 이상 통과시켜야 합니다. Passaging을 통해 오염 물질로부터 추가로 격리할 수 있습니다. 따라서 제시된 프로토콜은 마우스 뮐러 세포를 분리하는 빠르고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 치료 표적을 연구하고 망막 질환에 대한 잠재적 치료법을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼으로 사용될 수 있습니다14.

<table><tbody><tr><td>비커 : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>콜라게나제 IV&nbsp;</td><td>워딩턴&nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>일회용 눈금 이송 피펫: 3.2mL 멸균</td><td>13-711-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM(1X)&nbsp;</td>M&uuml을 성장시키기 위한 <td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media; LLER 세포&NBSP;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>완전한 뮬러 세포 배양 배지용</td></tr><tr><td>글루타민 합성효소</td><td>세포 신호 전달</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>바늘 부착 Luer-Lok 주사기 21 G x 1 1/2 in., 멸균, 일회용, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브: 2mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>펜 연쇄상구균</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>완전한 M&uuml용; ller 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851. AP</td><td></td></tr><tr><td>포지티브 액션 핀셋, 스타일 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr> 가<tr><td>위 홍채 표준 스트레이트 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 원심분리기</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 현미경</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>수술용 블레이드, #11, 스테인리스 스틸</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>현탁 배양 접시 60mm x 15mm 스타일</td><td>코닝</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 : 100x20mm 스타일</td><td>코닝</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>토네이도 튜브: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>토네이도 튜브: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 5MS, 8.2cm, 스트레이트, 0.09x0.05mm 팁</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 포지티브 액션 스타일 5, 생물학적, Dumostar, 광택 마감, 110mm OAL</td><td>전자 현미경 Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>언더패드, 보통: 23" X 36"</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위 - 2.5mm 절삭날</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>해당 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

primary mouse retinal glial müller 세포의 분리

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

망막의 주요 지지 세포는 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)입니다. 그들은 전체 망막 표면을 덮고 있으며 망막 혈관과 망막 뉴런 모두에 매우 근접해 있습니다. 뮐러 세포는 성장하기 때문에 건강한 망막에서 신경전달물질, 레티노산 화합물 및 이온(예: 칼륨 K+)의 흡수 및 재활용을 포함하여 여러 가지 중요한 작업을 수행합니다. 혈류를 조절하고 혈액-망막 장벽을 유지하는 것 외에도 신진대사와 망막에 영양분 공급을 조절합니다. 이 원고에는 1차 마우스 Müller 세포를 분리하기 위한 확립된 절차가 제시되어 있습니다. 안구 질환의 다양한 마우스 모델과 관련된 기본 분자 과정을 더 잘 이해하기 위해 Müller 세포 분리는 탁월한 접근 방식입니다. 이 원고는 마우스에서 Müller 세포를 분리하기 위한 자세한 절차를 간략하게 설명합니다. 적출에서 파종에 이르기까지 전체 과정은 약 몇 시간 동안 지속됩니다. 파종 후 5-7일 동안은 분리된 세포가 방해받지 않고 자랄 수 있도록 배지를 변경해서는 안 됩니다. 형태학과 뚜렷한 면역형광 마커를 사용한 세포 특성 분석은 프로세스의 다음 단계입니다. 세포의 최대 통로는 3-4회입니다.

분리된 Müller 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능 검증 분리된 Müller 세포의 생존력, 형태 및 독특한 특성을 확인하기 위해 세포를 광학 현미경으로 검사했습니다. P0 및 P1 이미지가 기록되었습니다(그림 1A). RPE 세포로 분리된 Müller 세포의 오염을 확인하고 순도를 확인하기 위해 RPE 세포 마커인 RPE65에 특이적인 항체를 사용하여 면역형광 염색(IF)을 수행했습니다. 인간 망막 색소 세포(ARPE -19)를 양성 대조군으로 사용했습니다. RPE65 염색된 RPE 세포(핵 염색의 경우 빨간색 및 파란색)는 그림 1B (하단 패널)에 나와 있습니다. RPE65 특이 항체는 분리된 Müller 세포를 염색하지 않았습니다(그림 1B, 상단 패널). RPE65가 ARPE-19 세포(빨간색)를 염색하고 분리된 세포를 염색하지 않았다는 사실은 분리된 세포가 RPE 세포가 아님을 나타냅니다. 매체에 피루브산과 낮은 포도당의 존재는 RPE 세포의 성장에 불리한 조건을 설정합니다. 결과적으로, RPE 세포 오염의 경우에도 결국 플라스크에서 분리됩니다.
또한, 분리된 세포의 동일성을 확인하기 위해 Müller 세포 특이 마커에 대한 Müller 세포 면역형광 염색을 사용하여 Müller 세포의 성공적인 분리를 확인했습니다. 비멘틴(vimentin)이라고 불리는 세포골격 중간 필라멘트 단백질을 사용하였다12,13. 또한, 글루타메이트와 암모니아의 축합 반응을 촉매하여 글루타민을 형성하는 글루타민 합성효소(GS)도 망막 신경교세포의 핵심 기능으로 사용되었다5.
총체적으로 분리된 세포는 RPE65(빨간색, 그림 1B)에 대해 음성으로 염색되고 vimentin(녹색, 그림 1C) 및 GS(녹색, 그림 1D)에 대해 양성으로 염색되었습니다. IF 염색은 분리된 Müller 세포의 성공적인 분리(순도 및 특이성)를 확인합니다. 그림 1E는 vimentin(상부 패널) 및 GS(하부 패널)에 대한 음성 대조군으로 항체의 특이성을 확인합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> 그림 1: Müller 세포 분리(순도 및 특이성) 검증. (A) 통로에 대한 광학 현미경 이미지: 통로 0(P0) 및 (P1) 형태. (B) DAPI 핵 염색과 결합된 RPE65 면역염색. (C) 고배율에서 DAPI 핵 염색을 사용한 Vimentin 면역염색. (D) 동일한 고배율에서 GS 면역염색. (E) 비멘틴 및 GS 항체 염색의 특이성을 확인하기 위한 음성 대조군. 스케일 바 = 각각 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

이 비디오는 쥐의 망막에서 분리된 Müller glial (MG) 세포의 배양을 보여줍니다. 망막은 소화 효소를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 세포는 MG 세포 증식과 신경 세포 사멸을 촉진하는 성장 인자를 가진 배지에서 성장합니다. 파시에이징(passaging) 과정에서 죽은 신경세포를 제거하고 MG 세포를 성장시켜 추가 분석을 진행합니다.

마우스 망막에서 얻은 Müller Glial 세포 배양 확립

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.

Sprague-Dawley (SD) 쥐에서 일차 망막 뮐러 세포의 분리 및 배양

배우세요 생쥐 눈에서 Müller 신경교세포를 분리하는 세포생물학 기법입니다. 이 방법은 망막 질환 연구와 치료 표적 개발에 활용됩니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

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