Name: Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 배우세요 생쥐 뇌에서 스테레오택식 주사 좌표를 염료로 빠르게 검증하는 방법입니다. 이 기술은 바이러스 추적 연구의 효율성을 높이며 탈수 시간을 단축합니다.

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중국 국립 자연 과학 재단(XY Sun에 보조금 번호 82101249), 중국 박사후 연구 재단(XY Sun에 보조금 번호 2022M722125). 상하이 세일링 프로그램(SH Chen에 보조금 번호 21YF1425100). 상하이시 위생건강위원회 임상 연구를 위한 특별 프로젝트(J Zhou에게 보조금 NO. 202340088). 중국 국립 자연 과학 재단 (X Zhang에게 보조금 NO. 82101262, SH Chen에게 보조금 NO. 82101287).

모든 동물실험은 ARRIVE(Animal Research Reporting In Vivo Experiments) 가이드라인 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 상하이 교통대학교 의과대학 렌지 병원(Renji Hospital)의 동물 보호 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스가 사용되었다. 동물은 상업적으로 획득되었고( 재료 표 참조) 표준 케이지(22°C ± 2°C, 12시간/12시간 명암주기, 음식 및 물)에 수용되었습니다.
1. 표적 뇌 영역의 선택
알림: 이것은 멸균 절차입니다. 모든 수술 기구가 멸균되었는지 확인하십시오. 수술 기구에 닿기 전에 장갑에 알코올을 뿌립니다. 기구의 끝부분이나 수술 부위를 장갑으로 만지지 마십시오. 시술을 시작하기 전에 오른쪽 반사 신경의 손실과 피부 자극에 대한 반응이 없는지 확인하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 드릴링 및 주입 전에 호흡수(분당 60-220회 호흡, 분당 평균 100-150회 호흡)와 호흡 진폭(일관성이 있어야 하며 과도하게 얕거나 깊지 않아야 함)을 면밀히 모니터링하십시오. 호흡수 또는 진폭의 중요한 변화를 기록해야 합니다.
<ol><li>29G 바늘을 사용하여 1.25% 트리브로모에탄올(250mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 오른쪽 반사가 사라지면 두개골의 머리카락을 면도하십시오. 노즈 cl로 위쪽 앞니를 고정하여 마우스를 입체 프레임( 재료 표 참조)에 고정합니다.amp 두 개의 이어 바를 사용하여 머리를 고정합니다.</li>
	<li>안구 건조증을 예방하기 위해 안과 연고를 바르십시오. Anerdian(소독액, 재료 표 참조)으로 두피를 세 번 닦아 소독합니다. 29G의 인슐린 바늘을 사용하여 1% 리도카인 0.2mL를 피하에 주사하여 국소 진통을 제공합니다.</li>
	<li>눈 가위로 0.5cm를 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 3 % H2O2 를 적신 면봉을 사용하여 노출 된 두개골을 문질러 골막을 제거합니다. 두개골을 말리십시오.</li>
	<li>드릴을 입체 악기에 부착합니다. 돋보기를 사용하여 드릴 팁을 브레그마에 정확하게 배치하도록 입체 암의 손잡이를 조정하고 LCD 디지털 디스플레이를 사용하여 z축 값을 기록합니다.<ol><li>손잡이를 조정하고 드릴 팁을 람다에 놓고 z축의 값을 기록합니다. 노즈 클램프와 이어 바를 조정하여 두 개의 z 값을 더 가깝게 만들고 두 z 값 간의 차이가 0.1mm 미만이 될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 참고: LCD 디지털 디스플레이의 x, y 및 z축은 각각 내측(ML), 전후(AP) 및 배측(DV)에 해당합니다. bregma와 lambda는 두 z 값의 차이가 0.1mm 미만이면 동일한 수평면에 있는 것으로 간주할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>뇌의 좌우 수평을 보장합니다. 스테레오택시 프레임에 부착된 이어 바를 동일한 스케일로 조정합니다. 예를 들어 laterodorsal tegmental nucleus, ventral part (LDTgV)를 사용하십시오. Paxinos와 Franklin의 쥐 뇌 아틀라스16에 따르면 입체 좌표는 x의 경우 -5.2, y의 경우 +0.8, z의 경우 -4.0입니다.<ol><li>이어 바를 조정하여 드릴을 (-5.2, +0.8)으로 하여 등쪽-복부 방향의 z 값을 측정하고 드릴을 (-5.2, -0.8)으로 이동하여 z 값을 측정합니다. 참고: 왼쪽-오른쪽은 두 z 값의 차이가 0.2mm 미만일 때 동일한 수준으로 간주됩니다. 외이도(external eary meatus)는 대칭을 이루기 때문에 귓바퀴를 올바른 위치에 삽입해야 합니다. 두 z 값의 차이가 0.5mm 이상이면 이어바가 잘못된 위치에 삽입되었을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>드릴을 다시 브레그마에 놓고 LCD 디지털 디스플레이의 세 좌표를 0으로 설정합니다. 참조 좌표를 사용하여 관심 영역 위에 드릴을 배치합니다. 훈련을 시작합니다.<ol><li>두개골을 관통할 때까지 수직 암을 사용하여 드릴을 점차적으로 내립니다. 면봉을 사용하여 부스러기와 피를 제거합니다. 알림: 뇌 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 염료 용액 및 뇌 미세 주입 준비
<ol><li>브로모페놀 블루( 재료 표 참조)를 함유한 25μL의 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 200μL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 50 μL의 ddH2O를 튜브에 첨가하여 염료 용액을 준비합니다.</li>
	<li>식염수를 적신 면봉으로 두개골 창을 덮습니다. 식염수를 반복적으로 흡입하고 배출하여 마이크로 주사기 개통을 보장합니다. 0.3μL의 염료를 마이크로 주사기에 넣습니다. 주사기와 전동식 스테레오택스 마이크로인젝터를 스테레오택스 암에 부착합니다.</li>
	<li>주사기 팁을 브레그마에 놓고 LCD 디지털 디스플레이에서 좌표를 0으로 설정합니다. 참조 좌표에 따라 바늘을 관심 영역으로 조정합니다. 사출 속도를 0.1μL/min으로 설정하고 전동식 미세주입기를 시작하여 0.3μL의 파란색 염료를 대상 영역에 전달합니다. 주입기를 천천히 빼내기 전에 주사기를 최소 10분 동안 제자리에 두십시오. 참고: 밀접하게 위치한 영역을 구별하기 위해 동일한 마우스에 다른 색상의 염료를 사용할 수 있습니다. 물리적 특성에 따라 적절한 농도에 대해 다른 염료를 테스트합니다. 브로모페놀 블루 포뮬러를 사용하고 막힘을 방지하기 위해 사용 전후에 주사기를 철저히 헹구는 것이 좋습니다. 염료 확산에 따라 주입량을 조정합니다.</li>
</ol>3. 뇌 조직 채취 및 냉동 절개
<ol><li>스테레오택시 프레임에서 마우스를 놓습니다. 29G 바늘을 사용하여 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 테이프로 폼 보드에 마우스를 고정합니다.</li>
	<li>흉부의 양쪽을 열어 빠른 질식을 유도합니다. 우측 심방 부속기를 1-2mm 절개합니다. 좌심실에 주입 바늘을 삽입합니다. 20mL의 예냉식 식염수와 20mL의 아이스 4% 파라포름알데히드 용액을 주입합니다.</li>
	<li>조직 해부 가위로 쥐의 목을 베십시오(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 목에서 코까지 정중선을 따라 절개하여 피부를 제거한 다음 두개골을 노출시킵니다. 집게나 가위로 두개골에 남아 있는 근육을 제거합니다.</li>
	<li>가는 가위의 한쪽 날 끝을 구멍과 뇌 사이에 놓고 날카로운 모서리가 뼈를 향하도록 하여 시상 중간 봉합사의 끝에 놓습니다. 중시상 봉합사를 따라 두개골을 밀어 절단합니다. 집게를 사용하여 두개골을 제거하면 노출된 뇌가 드러납니다. 알림: 수술 중 뇌에 손상을 입히지 않도록 주의하십시오. 뼛조각을 제거하기 전에 두개골에 붙어 있을 수 있는 수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 이 예방 조치는 그 과정에서 뇌 조직이 부주의하게 절단되는 것을 방지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>회전식 마이크로톰 cryostat( 재료 표 참조)의 전원을 켜고 챔버 온도를 -20°C로 설정합니다. 시편 디스크의 표면을 고르게 덮기 위해 약간의 OCT 화합물을 붓습니다. 그것을 cryo 챔버에 넣고 OCT가 응고되도록 합니다.</li>
	<li>디스크를 시편 헤드에 부착합니다. 블레이드를 블록에 더 가깝게 가져오고 OCT 블록을 잘라 디스크와 평행한 평평한 평면을 만듭니다.</li>
	<li>주사 부위에서 멀리 떨어진 관상 방향으로 뇌를 면도날로 뇌 절편 금형에 절릅니다. 주사 부위가 들어있는 뇌 조직을 절단면이 아래로 향하게 하여 OCT 평면에 놓습니다.<ol><li>OCT를 뇌에 붓고 디스크를 냉동 챔버에 넣어 표본 블록이 응고되도록 합니다. 뇌에 OCT가 완전히 포함될 때까지 OCT를 뇌에 반복적으로 붓습니다. 참고: OCT 화합물을 층별로 추가합니다. OCT의 이전 층이 얼면 OCT 화합물의 다음 층을 뇌에 붓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대상 영역이 접근할 때까지 시편 블록을 자릅니다. 주입 부위 수준에서 여러 섹션을 만듭니다. -20 °C에서 유지되는 작은 필기 브러시를 사용하여 실온 PBS가 들어 있는 6웰 플레이트에 관상 뇌 절편을 수집합니다. 참고: 절단 두께를 더 큰 것으로 설정하여 블록을 자른 다음 블레이드가 사출 부위에 접근함에 따라 절단 두께를 40μm로 설정합니다. 신경 회로 추적자를 사용하면 마우스가 즉시 희생되지 않습니다. 마취 회복을 위해 가열 담요 위에 무균 수술 후 회복 케이지에 마우스를 놓습니다. 생쥐를 원래 케이지로 돌려보내거나 깨어난 후 새 케이지로 되돌려 놓습니다.</li>
</ol>4. 이미징
<ol><li>실온 PBS로 OCT를 세척하십시오. 브러시를 사용하여 뇌 부분을 집어 슬라이드에 놓습니다. 섹션을 실온에서 공기 건조시킵니다.</li>
	<li>주입된 부위를 육안으로 관찰하거나 표적 핵이 미세할 때 현미경을 사용합니다. 주입된 염료의 위치를 뇌 아틀라스의 해당 영역과 비교합니다. 참고: 주입 지점 편차의 방향과 거리에 따라 x, y, z축의 값을 조정합니다. 좌표를 정확하게 결정하기 위해 이 프로토콜의 모든 단계를 여러 번 반복해야 할 수도 있습니다.</li>
</ol>

마우스의 입체탁스 미세주입 정확도 최적화

<ol><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175(2018).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li>
<li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li>
<li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li>
<li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li>
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<li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77(2023).</li>
<li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).</li>
<li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211(2021).</li>
<li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+2nd+ed%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed</a>. , Academic Press. (2001).</li>
</ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문은 바이러스 추적 전에 입체적 뇌 주입 5,6의 정확성을 더 빠르고 간단하게 검증할 수 있는 안정적인 전략을 설명했지만, 뇌 영역에서 리포터 유전자 발현의 대체 불가능한 측면은 뇌 영역 라벨링에 매우 중요합니다. 우리가 사용한 파란색 염료는 주입 부위를 즉시 시각화할 수 있었습니다.
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 주입 부위의 정확도를 향상시키는 데 기여합니다. 첫째, 1.5 단계의 입체 도구에서 뇌의 좌우 수평을 보장합니다. 이 단계에서는 작업자가 두개골 해부학적 구조에 익숙해야 하며 이어 바가 올바른 위치에 배치되었는지 확인해야 합니다. 이어 바의 눈금과 입체 프레임도 참조 역할을합니다. 둘째, 1.6 단계와 2.3 단계에서 정확한 영점 인 브레그마를 찾습니다. 경우에 따라 1.6 및 2.3 단계에서 발견된 좌표의 상당한 불일치는 영점 위치의 상당한 차이로 인해 발생합니다. 이로 인해 미세주사기 바늘이 두개골 창을 관통할 수 없게 될 수 있습니다. 이러한 경우 영점을 재배치해야 하며 필요한 경우 새 두개골 창을 만들어야 합니다. 그럼에도 불구하고 2.3단계에서 영점을 다시 설정하고 좌표를 새로 찾는 것이 여전히 중요합니다. 이전에 만든 두개골 창에서 마이크로 주사기를 직접 삽입할 수 없습니다.
쥐의 뇌 절편 주형에서 얼지 않은 뇌를 절단하는 것과 비교했을 때, 이 전략은 단단한 표본 블록이 칼날이 뇌를 압박하여 염료가 주입 지점에서 옮겨지는 것을 방지하기 때문에 더 정확한 결과를 제공합니다. 더욱이, 뇌 절편 주형에 의해 절단된 뇌 부분은 상대적으로 더 두꺼워서 작은 대뇌핵을 국소화하는 것이 불가능하다. 그러나 표준 뇌 조직 냉동 절개 과정 11,12,13,14,15와 비교했을 때, 탈수 단계를 건너뛰어 처리 시간을 최소 72시간 단축했으며, 그 결과 뇌 절편이 더 약해지고 유리 슬라이드에서 집기가 더 어려워졌으며, 이는 이 프로토콜의 주요 약점을 나타냅니다.
염료 주입을 위한 두개골 창을 만들 때 치과 드릴을 손으로 잡는 것이 아니라 입체 암에 단단히 부착하면 미세 조정 손잡이를 사용하여 드릴 깊이를 제어하기 쉬워 뇌 조직의 손상 가능성을 줄일 수 있습니다.
결론적으로, 이 연구는 바이러스 추적 전에 정확한 입체택시 좌표를 예비 검증할 수 있는 유망한 방법을 제공하여 후속 뉴런 라벨링 및 추적 프로세스를 보다 신뢰할 수 있게 만들었습니다.

생체 내 칼슘 기록, 광유전학 및 화학유전학 도구를 포함한 거의 모든 현대 신경 조절 도구는 신경 조작의 기초를 형성하는 뇌 관심 영역 1,2,3을 표적으로 하기 위해 입체 좌표를 사용해야 합니다. 쥐의 뇌 영역에 대한 입체 좌표는 두개골의 뼈 랜드 마크인 브레그마 (bregma)와 람다 (lambda)와 관련하여 정의되며, 소위 두개골 유래 입체 좌표계를 형성합니다. bregma 또는 lambda는 3차원 좌표의 영점 역할을 할 수 있습니다. 3개의 축은 전후(AP), 내측(ML) 및 등쪽(DV)으로, 입체 기기의 디지털 디스플레이에서 y, x 및 z축을 나타냅니다. 잘 알려진 뇌 영역의 경우, 특정 영역의 입체 좌표 매개변수는 마우스 뇌 아틀라스(mouse brain atlases)4(예: 입체 좌표에서의 팍시노스(Paxinos) 및 프랭클린의 마우스 뇌) 및/또는 발표된 문헌 5,6으로부터 얻어질 수 있다. 그러나 입체 택시 장비의 다양성과 다른 연구자가 사용하는 마우스의 연령/개체군으로 인해 추가 검증이 필요합니다.
구조는 기능의 기초입니다. 신경 회로는 인지 활동, 감정, 기억, 감각 및 운동 기능과 같은 많은 뇌 기능의 기초를 형성합니다1. 구조를 분류하고 신경 회로의 활동을 조작하는 것은 특정 신경 회로의 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 지난 수십 년 동안 신경 추적자는 여러 세대에 걸쳐 진화해 왔습니다. 초기 연구에서는 밀 배아 응집체(WGA) 및 위상 올루스 불가리스 응집체(PHA)를 전행 추적자로, 플루오로골드(FG), 콜레라 독소 소단위 B(CTB), 카보시아닌을 역행 추적자로 채택했습니다. 그러나 바이러스 추적자와 달리 이러한 전통적인 신경 추적자는 외인성 유전자를 숙주에 통합할 수 없으며 세포 유형 선택성도 없습니다. 오늘날 바이러스 전략은 기초 신경 과학 연구에서 중요한 제안이 되었습니다. 다양한 연구 목적을 위해 다양한 바이러스 도구를 선택할 수 있습니다 7,8. non-trans-transsynaptic virus, trans-multisynaptic virus(역행 및 전행성) 및 trans-monosynaptic virus(역행 및 전행성 바이러스)가 있습니다. 각 범주에는 각각의 특성을 가진 여러 유형이 포함되어 있습니다.
바이러스 투여 및 발현 과정은 시간과 자원이 많이 소요되며 종종 몇 주 또는 그 이상이 걸립니다. 다양한 바이러스 벡터 중에서, 아데노 관련 바이러스는 유전자 전달을 위한 유망한 수단으로 확인되었으며, 실험 절차 7,8에서 주입 후 3주에서 8주에 이르는 넓은 기간을 제공합니다. AAV가 발전함에 따라, 분석은 투여 후 2-3주 후에 수행할 수 있다 9,10. 가성 광견병 바이러스(PRV) 및 광견병 바이러스(RV)와 같은 다른 신경 회로 추적자도 최소 2-7일의 추적 기간을 필요로 합니다 11,12,13,14,15. 따라서 형광 신호를 관찰하기 전에 주입 부위를 미리 검증하는 것은 시간적으로나 비용 효율적입니다.
입체적 주입의 간단하고 신속한 검증을 용이하게 하기 위해 이 연구에서는 바이러스 벡터 전에 염료를 투여하고 동결 절개를 통해 연구원은 주입 부위를 관찰하고 주입 후 30분 이내에 추적할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.0 & 마이크로; L, 신경 주사기, 모델 7001 KH, 32G, 포인트 스타일 3</td><td>해밀턴</td><td>65458-01</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫 팁</td><td>biosharp</td><td>BS-200-T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 주사기</td><td>친절하게 그룹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 % H2O2 솔루션</td><td>Lircon Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Shengyou Biotech</td><td>20006</td><td></td></tr><tr><td>Anerdian</td><td>Likang 하이테크</td><td>31001002</td><td></td></tr><tr><td>안티 롤 플레이트</td><td>Leica</td><td>14047742497</td><td></td></tr><tr><td>BD 인슐린 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>벤드 톱니 해부 겸</td>자 <td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Cellsens 치수 소프트웨어</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-Fluoromount-G</td><td>Southernbiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>Longxiang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파인 브러쉬</td><td>HWAHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 올</td><td>림푸스</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰</td><td>라이카</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>지혈 겸자 스트레이트 치아</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>주입 바늘 0.7 mm</td><td>친절하게 그룹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리도카인 염산염 주입</td><td>Harvest Pharmaceutical Company</td><td>71230803</td><td></td></tr><tr><td>돋보기</td><td>M & G Chenguang 문구류</td><td></td><td></td></tr><tr><td>남성 C57/BL 마우스</td><td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&ndash; BK 실험실</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쥐 코로나 뇌 슬라이스 금형</td><td>RWD 생명 과학</td><td>68713</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>biosharp</td><td>BS-02-P</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 톰 블레이드</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Cisen Pharmaceutical Company</td><td>G23HDM9M4S5</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Piette 2-200 &mu; L</td><td>thermofisher</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루를 포함하는 SDS-PAGE 샘플 로딩</td><td>Beyotime</td><td>P0015A</td><td></td></tr><tr><td>면도 블레이드</td><td>BFYING</td><td>91560618</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>입체 장치</td><td>RWD 생명 과학</td><td>68807</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 톱니 해부 겸자</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>주사기 홀더</td><td>RWD 생명 과학</td><td>68206</td><td></td></tr><tr><td>조직 가위</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T 화합물</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>트리 브로 모에탄올</td><td>Aibei 생명 공학</td><td>M2910</td><td></td></tr></tbody></table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

특정 뇌 부위에 대한 입체적 주입은 기초 신경과학의 기본적인 실험 기법입니다. 연구자들은 일반적으로 마우스의 다양한 개체군/연령 및 다양한 입체 장비를 사용한 마우스 뇌 아틀라스 또는 발표된 자료에 따라 입체탁스 주입 매개변수를 선택하므로 입체 좌표 매개변수에 대한 추가 검증이 필요합니다. 칼슘 이미징, 화학유전학 및 광유전학 조작의 효능은 관심 영역 내 리포터 유전자의 정확한 발현에 달려 있으며, 종종 몇 주간의 노력이 필요합니다. 따라서 대상 뇌 영역의 좌표를 미리 확인하지 않으면 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 바이러스 대신 적절한 염료를 사용하고 동결 절제를 구현하면 연구원은 염료 투여 직후 주입 부위를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 실제 사출 부위와 이론적 위치 사이에 불일치가 있는 경우 좌표 매개변수를 적시에 조정할 수 있습니다. 이러한 조정은 후속 실험에서 표적 영역 내에서 바이러스 발현의 정확도를 크게 향상시킵니다.

이 연구는 입증된 방법을 사용하여 30분 이내에 주입 부위를 성공적으로 식별했습니다. 처음에는 브로모페놀 블루를 함유한 SDS-PAGE 샘플 로딩 용액을 C57/BL 마우스의 LDTgV에 주입했습니다. 그림 1A 는 염료 용액 주입의 개략도를 보여줍니다. LDTgV에서 청색 염료의 분포는 그림 1B에 나와 있습니다.
브로모페놀 블루는 또한 이 프로토콜의 보편성을 평가하기 위해 mPFC 전변연계 피질, mPFC 뇌변연계 피질 및 수암암편도체(BMA)에 주입되었습니다. 그림 1C-E 및 그림 2A에서 볼 수 있듯이 청색 염료는 mPFC 전변연계 피질, mPFC 변연계 피질 및 BMA에 분포되어 있습니다.
또한, 형광 mCherry 단백질을 운반하는 아데노 관련 바이러스를 LDTgV에 주입했습니다(염료 용액을 사용하여 좌표를 확인함). 바이러스가 발현되는 데는 4주가 걸렸다. LDTgV에서 mCherry+ 뉴런의 분포는 그림 2B에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig01.jpg"> 그림 1: 염료 용액 주입. (A) 염료 용액 주입의 개략도. (B) LDTgV의 청색 염료 분포. (C) mPFC 전변연계 피질의 청색 염료 분포. (D) mPFC 대뇌엽 피질에서의 청색 염료의 분포. (E) BMA의 청색 염료 분포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig02.jpg"> 그림 2: 현미경으로 본 청색 염료 분포 및 mCherry 분포. (A) mPFC prelimbic cortex의 청색 염료 분포(10배 확대, 눈금 막대 = 500μm). (B) 형광 현미경으로 획득한 LDTgV 영역의 mCherry 분포를 대표하는 이미지(10배 확대, 눈금 막대 = 500μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 염료 및 동결 절편을 사용하여 바이러스 추적을 수행하기 전에 입체탁 주입 좌표의 검증 단계를 신속하게 처리하기 위한 실용적인 전략을 설명합니다.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

우리의 연구는 주로 생쥐의 인지 장애의 기저에 있는 신경 회로 메커니즘을 조사하는 데 중점을 둡니다. 그리고 우리는 이러한 연구에서 뇌 입체적 기법을 자주 사용합니다. 우리의 목표는 염료를 사용하는 입체 주입 부위에 대한 검증 프로세스를 최적화하고 가속화하여 간단하고 신속한 절차가 되도록 하는 것입니다.신경과학 연구에서 바이러스의 입체적 주입을 통한 다양한 전략이 중요해지고 있습니다. 그런 다음 주입 부위를 확인하기 위해 조직 절편에서 형광 마커를 관찰하며, 이 과정을 완료하는 데 몇 주가 걸립니다. 당사의 프로토콜은 최소 3일의 탈수 시간을 절약하고 주입 부위를 더 빠르게 식별할 수 있도록 비용 효율적인 염료를 사용함으로써 다른 기술에 비해 이점을 제공합니다.예비 검증이 없는 것에 비해 몇 주를 절약할 수 있습니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

설치류에 Stereotaxic 수술은 약물이나 동물을 행동 깨어 전기 자극과 녹음의 타겟 관리를위한 수 있습니다. 이 비디오 프레 젠 테이션에서 우리는이 오랜 절차를 성공적으로 향상되는 생존율 감소 수술 후 체중 감소 최근 절차 개선을 설명합니다.

행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

stereotaxic 좌표를 사용하여 excitotoxin의 주입에 의한 특정 뇌 영역의 타겟으로 절제 (들)은 설명되어 있습니다. 이 기술은 또한 쥐의 두뇌로 다른 화학 물질의 주입을 위해 적응 수 있습니다.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

출처: Joshi, K., et al. 생쥐의 Cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 경추 척수에 미세 주입하기 위한 정위 수술 접근법. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 뇌간과 상부 척수로의 표적 전달을 위한 수조 마그나 정위 접근법을 보여줍니다. 뇌척수액으로 채워진 수조 마그나에 접근함으로써 이 접근법은 표준 정위 고정 방법을 사용하여 도달하기 어려운 부위에 정밀하게 주사할 수 있습니다.

마우스 모델에서 치료 전달을 위한 정위 수조 마그나 접근법

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

정위 뇌파 (SEEG)은 발작 초점을 현지화하기 위해 간질 수술에 사용되는 수술 방법이다. 또한 뇌 기능을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공한다. 여기에서 우리는 SEEG 인간을 대상으로인지 과정을 조사하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

정위 뇌파를 사용하여 깊은 피질의 기능 및 피질 하 구조 조사 : 전방에 cingulate 피질 수업

여기에서는 비가역적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제(L-Nio)의 국소 주입에 의해 쥐 백질에서 초점 스트로크를 생성하는 방법론을 제시합니다. 제시된 것은 두 가지 정위 변형, 역행 신경 세포 추적, 그리고 이 기술의 잠재적 응용을 확장하는 새로운 조직 라벨링 및 해부입니다.

축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.

여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

여기에 설명된 것은 각진 관상 접근 법을 사용하여 도전적이고 도달하기 어려운 뇌 영역(공간 제한으로 인해)을 표적으로 할 수 있는 입체적 절차입니다. 이 프로토콜은 마우스와 쥐 모델에 모두 적응할 수 있으며, 바이러스 구조의 캐뉼라 이식 및 미세 주입을 포함하여 다양한 신경 과학 응용 분야에 적용 될 수있다.

다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 뼈를 통한 접근을 포함하며 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 여기서 우리는 뇌간 랜드 마크의 직접적인 시각화에 의존하는 cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부 척수를 목표로하는 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다.

마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

배우세요 생쥐 뇌에서 스테레오택식 주사 좌표를 염료로 빠르게 검증하는 방법입니다. 이 기술은 바이러스 추적 연구의 효율성을 높이며 탈수 시간을 단축합니다.

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

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