Name: 적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 형광 마이크로피펫 흡인 기법을 활용한 적혈구 메카노센싱 분석 방법입니다. 기계적 자극에 따른 세포 내 칼슘 이온 유입 변화를 측정하여 적혈구의 기계생물학적 반응 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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추가 기증자 모집, 혈액 수집 및 정맥 절개술 지원에 대해 Nurul Aisha Zainal Abidin과 Laura Moldovan에게 감사드립니다. 장비와 시약을 정리해 주신 Tomas Anderson과 Arian Nasser에게 감사드립니다. 이 연구는 호주 연구 위원회(ARC) 디스커버리 프로젝트(DP200101970-L. A.J.); 호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회(NHMRC) 아이디어 보조금(APP2003904-L. A.J.); NHMRC 장비 보조금-LAJ; NSW 심혈관 역량 강화 프로그램(초중기 경력 연구원 보조금-LAJ); NSW CVRN-VCCRI 연구 혁신 보조금; 글로벌 및 연구 참여 사무국(시드니-글래스고 파트너십 협력상-LAJ); L.A.J.는 National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2(105863)이자 Snow Medical Research Foundation Fellow(2022SF176)입니다.

이 프로토콜은 시드니 대학교의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르며 승인을 받았습니다. 이 연구를 위해 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 인간 적혈구 분리
참고: 1.1단계는 Institutional Review Board에서 승인한 프로토콜을 사용하여 훈련된 정맥 전문의가 수행해야 합니다.
<ol><li>19G 나비 바늘을 사용하여 정중 입방 정맥에서 5mL의 혈액을 채취합니다.</li>
	<li>채취한 혈액을 1:200 에녹사파린이 들어 있는 15mL 튜브에 넣어 응고를 방지합니다.</li>
	<li>에녹사파린 항응고 혈액 5μL를 탄산염/중탄산염 완충액 1mL에 희석합니다(C-완충액, pH = 8.5-9; 재료 목차).</li>
	<li>희석된 혈액 샘플을 900× g 에서 1분 동안 원심분리하여 적혈구를 침전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다.</li>
	<li>1mL의 C-완충액(재료 표)으로 RBC 펠릿을 2회 세척하고 매번 900× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>그 후, 동일한 원심분리 조건을 사용하여 Tyrode 완충액 1mL로 RBC 펠릿을 2배 세척한 다음 최종 펠릿을 Tyrode 완충액 1mL에 재현탁시켜 세척된 스톡 RBC 현탁액을 얻습니다.</li>
</ol>2. 칼슘 지시약 로딩
<ol><li>자동 세포 계수기를 사용하여 얻은 세포 수를 기준으로 Tyrode의 완충액에서 세척된 원액 RBC 용액의 농도를 10 × 106 cells/mL로 조정합니다(재료 표).</li>
	<li>칼슘에 민감한 염료인 16.67μM Cal-520 AM으로 배양하고 회전식 튜브 믹서에서 1시간 동안 교반하여 적혈구 내부의 칼슘을 라벨링합니다.</li>
	<li>0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 Tyrode의 완충액에 적혈구를 1:50 비율로 희석합니다. 이제 세포를 실험적으로 사용할 준비가 되었습니다.</li>
</ol>3. 마이크로피펫 제작
<ol><li>붕규산 유리 모세관(외경 1mm x 내경 0.6mm)을 P-1000 마이크로피펫 풀러에 장착하면 사전 설정된 당김 프로그램을 사용하여 당김 부위에 팁이 닫힌 두 개의 해당 마이크로피펫을 생성합니다. 이 설정에서는 열 516, 당기기 150, 속도 75, 시간 250 및 압력 500과 같은 당기기 프로그램 값을 사용합니다. 알림: 풀링 프로그램에 설정된 가열 및 풀링 매개변수는 사용자 정의할 수 있으며 실험 설계12의 원하는 설정에 따라 다릅니다. CHECKPOINT ( 보충 표 S1 참조).</li>
	<li>마이크로피펫 커터에 당긴 후 조달한 폐쇄형 마이크로피펫 중 하나를 장착하여 닫힌 팁을 엽니다. 가열 온도를 약 50-60 °C로 조정하십시오.</li>
	<li>10x 접안렌즈를 사용하여 마이크로피펫을 찾습니다. 조절을 위해 손잡이를 사용하여 마이크로피펫을 붕규산 유리 비드 가까이로 이동합니다.</li>
	<li>피펫 팁을 구부리지 않고 마이크로피펫을 붕규산 유리 비드에 최대한 가깝게 배치하기 전에 접안렌즈를 30배로 변경합니다.</li>
	<li>가열 페달을 밟아 열을 사용하여 붕규산 유리 구슬을 부드럽게합니다. 원하는 종말점인 개방 직경에 도달할 때까지 원시 폐쇄형 마이크로피펫 팁을 연화된 비드에 부드럽게 삽입합니다.</li>
	<li>풋 페달에서 손을 떼고 유리 구슬을 식히십시오. 마이크로피펫의 팁이 항상 비드 내부에 남아 있는지 확인하십시오. 알림: 팁을 더 삽입하면 개구부 직경이 커집니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 부드럽게 빼내어 닫힌 마이크로피펫을 선명하게 직선으로 절단합니다. 모세관의 최종 직경이 1μm인지 확인합니다. 참고: 체크포인트 ( 보충 표 S1 참조)</li>
</ol>4. 세포실 준비
<ol><li>다이아몬드 연필을 사용하여 표준 40mm x 22mm x 0.17mm 유리 커버슬립을 세 개의 동일한 스트립으로 나눕니다.</li>
	<li>절단된 유리 커버슬립 한 조각을 진공 그리스로 수제 챔버 홀더 바닥에 부착합니다. 알림: 챔버 홀더는 구부러진 손잡이로 연결된 두 개의 금속(구리/알루미늄) 사각형으로 구성됩니다. 금속 블록 사이의 거리는 절단된 커버슬립이 홀더에 부착되어 평행 챔버를 형성하기 위해 40mm 미만이어야 합니다.</li>
	<li>절단된 유리 커버슬립의 두 번째 조각을 진공 그리스로 수제 챔버 홀더 상단에 부착합니다. 참고: 체크포인트 ( 보충 표 S1 참조)</li>
	<li>200μL 피펫 건을 사용하여 라벨링된 RBC 현탁액 200μL를 두 개의 커버슬립 사이에 주입합니다(그림 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg"> 그림 1: 감방 그림. 40 mm x 22 mm x 0.17 mm 유리 커버 슬립의 두 절단 조각은 그리스를 사용하여 챔버 홀더에 부착됩니다. 두 개의 절단된 유리 커버슬립 사이에 Tyrode's Buffer의 약 200μL의 세포 용액이 파종됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 마이크로피펫 흡인 조립
<ol><li>세포 챔버를 홀더 스테이지에 장착합니다.tage 현미경 플랫폼에 있습니다. 셀 챔버가 대물렌즈 바로 위에 오도록 위치를 조정합니다(그림 2B).</li>
	<li>마이크로피펫 홀더를 연결된 물통의 유체 레벨 아래로 내립니다.</li>
	<li>탈염수 또는 Tyrode의 완충액을 제조된 마이크로피펫에 주입하고 34G 바늘과 결합된 주사기를 사용하여 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다(재료 표 참조).</li>
	<li>마이크로피펫 홀더의 끝을 반쯤 풀고 마이크로피펫 홀더에서 물이 몇 초 동안 떨어지도록 합니다. 참고: 체크포인트 ( 보충 표 S1 참조)</li>
	<li>마이크로피펫을 홀더 팁에 삽입합니다. 홀더 나사를 조여 마이크로피펫이 고정되었는지 확인합니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 세포 챔버에 삽입하고 현미경으로 마이크로피펫과 적혈구를 찾습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 위치를 조정하십시오.</li>
	<li>마이크로피펫 팁을 더 내려 팁이 있는 RBC와 수평이 되도록 합니다. 참고: 체크포인트 ( 보충 표 S1 참조)</li>
	<li>물통의 높이를 조정하여 마이크로피펫 팁의 유압을 영점으로 조정합니다. 그런 다음 물통을 약간 들어 올려 팁에 미묘한 양압을 생성합니다.</li>
</ol>6. 형광 결합 마이크로피펫 흡인 분석 수행
<ol><li>488nm 형광 여기 광원을 켭니다. 이 단계에서 형광 셔터를 켜지 마십시오.tage 광표백을 방지하기 위해(그림 2C). 형광 카메라와 전송된 카메라를 켭니다. 알림: 두 카메라 모두 적절한 소프트웨어를 사용하여 작동됩니다( 자료표 참조).</li>
	<li>소프트웨어에서 두 카메라에 대해 원하는 노출 시간 (이 연구의 두 카메라에 대해 100ms ), 관심 영역(ROI), 비닝 크기(이 연구에서는 없음)를 설정합니다. 다차원 획득 패널 을 열어 획득 프레임 번호, 이 연구를 위한 2,000 및 저장 디렉토리를 설정합니다. 참고: 획득 프레임 번호는 기록할 원하는 흡인 이벤트 수에 따라 다릅니다. 1개의 흡인 이벤트의 경우 획득 번호의 범위는 약 10-50초인 100-500 이내로 설정해야 합니다.</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 시야 아래에서 마이크로피펫을 찾으십시오.</li>
	<li>제어 상자와 cl을 포함한 공압 압력 cl을 켭니다.amp 시스템(그림 2A). 컨트롤 박스 가 EXTRNL 모드인지 확인하십시오. 손잡이를 천천히 돌려 시스템 내부의 오프셋 압력을 보상합니다.</li>
	<li>공압 클램프를 제어하는 별도의 소프트웨어를 켭니다. 이 소프트웨어에는 클램프 시스템에 대한 개별 아날로그 입력을 제어하는 전기 제어 패널이 있습니다. 압력은 20mV/mmHg 변환 계수로 제어됩니다.</li>
	<li>시스템 내부의 압력을 제로화합니다. 마이크로피펫을 적혈구 가까이에 조심스럽게 재배치합니다. 마이크로피펫 팁에 미묘한 양압이 감지될 때까지 물통 위치를 조정합니다.</li>
	<li>카메라 작동 소프트웨어에서 수집을 시작합니다. 형광 셔터를 켭니다.</li>
	<li>계산된 전압 크기를 제어판에 입력하여 RBC를 흡입하여 원하는 압력에 도달합니다. 참고: 적혈구 흡입 압력은 일반적으로 Δp = -5 - -40mmHg 범위입니다. 마이크로피펫 팁 내에 눈에 띄는 텅 신장이 있어야 합니다(그림 2D).</li>
	<li>미리 설정된 기간 동안 압력을 유지하십시오. 그런 다음 압력을 해제하십시오.</li>
	<li>마이크로피펫을 움직여 다음 세포를 집어 들고 실험을 반복합니다.</li>
</ol>7. 형광 강도 분석
<ol><li>저장된 형광 이미지를 분석 소프트웨어에 로드합니다.</li>
	<li>디스플레이 조정 탭을 사용하여 강도 임계값을 조정합니다. 값을 수동으로 입력하거나 슬라이더를 사용하여 형광 이미지가 분석 소프트웨어에서 세포의 명확한 대비를 표시하도록 하여 이를 수행합니다(보충 파일 1-보충 그림 S1 참조).</li>
	<li>소프트웨어 하단의 타임라인으로 스크롤합니다. 지정된 흡인 이벤트를 찾습니다.</li>
	<li>Add new surfaces(새 표면 추가)를 클릭합니다. 분석 ROI를 정의합니다. 참고: 소프트웨어는 세그멘테이션을 조정하고 완료하기 위한 안내식 5단계 프로세스를 제공합니다( 보충 파일 1-보충 그림 S2 및 보충 그림 S3 참조). 참고: 계산 리소스를 절약하기 위해 ROI를 가능한 한 작게 유지합니다.</li>
	<li>배경 빼기 슬라이더를 사용하고 슬라이더를 사용하여 분할 임계값을 조정하면 최상의 분할 결과를 얻을 수 있습니다. 알림: 이는 흡인 이벤트와는 별도로 배경을 가능한 한 정확하게 분할해야 함을 의미합니다( 보충 파일 1-보충 그림 S4 및 보충 그림 S5 참조).</li>
	<li>배경 소음을 제외하기 위해 영역 필터를 추가합니다( 보충 파일 1-보충 그림 S6 참조). 참고: 이 작업은 포스트 프로세스 단계에서 완료됩니다.</li>
	<li>통계 탭 | 상세 탭 | 평균값 탭을 클릭합니다. 스크롤하여 강도 평균을 찾아 선택합니다(보충 파일 1-보충 그림 S7 참조).</li>
	<li>시간 경과에 따른 형광 신호 트레이스를 .csv 파일로 내보낼 수 있습니다.</li>
	<li>내보낸 csv 파일을 엽니다. 모든 측정값에서 배경 신호 Fb를 뺍니다.</li>
	<li>방정식 (1)을 사용하여 칼슘 강도 변화 ΔFmax를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 여기서 ΔFmax 는 최대 칼슘 강도 변화, Fb는 배경 강도, F0 는 휴식 강도입니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg"> 그림 2: 형광 결합 마이크로피펫 흡인 어셈블리. (A) 명시야 및 형광 카메라와 결합된 도립 현미경을 통합한 fMPA 하드웨어 시스템의 개요. 이미지의 왼쪽은 수제 수압계와 공압 압력 펌프의 압력을 정밀하게 조정할 수 있는 컨트롤 박스를 보여줍니다. (B) 단일 마이크로피펫이 있는 실험 세포 챔버 및 미세 조작기 시스템을 묘사한 현미경 단계. (C) fMPA 시스템 설정의 개략도. 두 개의 dichroic mirror를 사용하여 brightfield(노란색) 및 형광(청색 방출, 녹색 여기) 신호의 동시 이미징을 통해 형광 광원(파란색)에서 대상으로, 그리고 이미징을 위해 카메라(녹색)로 광 경로를 지정합니다. (D) 맨 윗줄은 명시야 이미지를 나타내고 맨 아래 줄은 형광 이미지를 보여줍니다. 왼쪽은 적혈구가 정지해 있을 때 흡인 전 마이크로피펫의 위치를 나타냅니다. 중간 컬럼은 적혈구가 -40mmHg의 음압을 경험하는 흡인 과정을 보여줍니다. 오른쪽은 음의 흡인 압력을 경험한 후의 세포 형태를 나타냅니다. 눈금 막대 = 5μm. 약어: fMPA = 형광 결합 마이크로피펫 흡인; DM = 이색성 거울; RBC = 적혈구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Single-Cell Mechanobiology Using Fluorescence Micropipette 흡인(Aspiration)

<ol><li>González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micropipette+aspiration%3A+applications+in+cell+biomechanics%2C+models%2C+and+extended+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies.</a> Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).</li>
<li>Mierke, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMierke%2C+CT+%22Physics+of+Cancer%2C+Volume+3+%28Second+Edition%29%3A+Experimental+biophysical+techniques+in+cancer+research%22">Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research</a>. , IOP Publishing. (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+F-BAR+protein+CIP4+reduces+platelet+production+by+impairing+membrane-cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling.</a> Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).</li>
<li>Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-II+inhibition+and+soft+2D+matrix+maximize+multinucleation+and+cellular+projections+typical+of+platelet-producing+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).</li>
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<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-coupled+micropipette+aspiration+assay+to+examine+calcium+mobilization+caused+by+red+blood+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing.</a> European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).</li>
<li>Danielczok, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+passage+of+small+capillaries+is+associated+with+transient+Ca2%2B-mediated+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations.</a> Frontiers in Physiology. 8, 979(2017).</li>
<li>Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+biomechanical+characteristics+of+human+red+blood+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease.</a> MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).</li>
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<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Pu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+single+cells+for+both+mechanical+and+electrical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).</li>
<li>Guevorkian, K., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10+-+Micropipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+exploring+cell+and+tissue+mechanics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo.</a> Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).</li>
<li>Biro, M., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Dual+pipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+studying+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion.</a> Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).</li>
</ol>

저자들은 본 연구와 관련하여 보고할 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

마이크로피펫 흡인 분석은 세포 생체 역학의 심오한 복잡성을 조사하기 위해 상당한 압력 조절, 정확한 공간 오케스트레이션 및 신뢰할 수 있는 시간적 식별을 배치하는 정교한 방법론을 구현합니다. 이 연구는 다양한 자극 하에서 적혈구가 나타내는 미묘한 기계적 민감성 반응을 밝히기 위한 중요한 도구로서 fMPA의 적용에 특히 중점을 둡니다. 명시야 신호와 형광 신호를 동시에 사용하면 세포 현상을 다각적으로 탐구할 수 있어 세포 내 칼슘 유입을 실시간으로 모니터링하고 검출할 수 있습니다. 이 접근법은 적혈구의 복잡한 기계 감지 반응에 대한 통합적인 통찰력을 제공합니다.
중요한 것은, fMPA 기법의 적용 가능성은 혈소판 및 뉴런과 같이 높은 기계적 민감도를 적용하지 않는 다른 세포 유형에도 사용될 수 있기 때문에 적혈구를 넘어 확장된다는 점이다9. 또한 fMPA는 실험 처리 중 세포 무결성에 미치는 영향을 최소화하기 때문에 세포의 자연 상태 보존을 보장하므로 일차 세포와 함께 사용하기에 매우 적합합니다1. 또한 fMPA 분석법은 마이크로피펫의 조정 가능한 형상을 통해 다목적성을 제공하여 특정 연구 질문에 맞는 광범위한 실험 설계와 다양한 기계적 조건을 효과적으로 탐색할 수 있습니다.
또한 다중 형광 이미징의 동시 사용을 향상시키는 광학 경로의 개선으로 fMPA 시스템을 통해 흡인 시 세포 내 칼슘 농도를 실시간으로 감지할 수 있습니다. 이 기능은 외부 환경으로부터 기계적 신호를 중재하고 인식하는 것으로 밝혀진 기계감응성 이온 채널인 PIEZO1과 같은 칼슘 관련 분자를 탐색할 수 있는 기회를 열어줍니다 7,14. 최근 문헌에서는 PIEZO1 채널 활성을 자극하는 중요한 요인으로 막 장력의 증가를 강조하고 있으며, 그 결과 Ca2+ 유입을 촉진합니다6. 이는 막 장력, PIEZO1 및 칼슘 유입 사이의 상호 작용을 조사하여 세포 내의 복잡한 기계 감지 과정을 밝히는 fMPA의 중요한 응용 분야를 강조합니다.
기술적인 관점에서 흡인력(기계적 자극)을 생성하고 실시간 형광 이미징을 수행하는 fMPA 시스템의 두 가지 주요 구성 요소는 각각 공압 압력 펌프와 형광 카메라라는 점을 언급할 가치가 있습니다. 시스템에 적합한 펌프와 카메라의 선택은 연구 중인 특정 세포 유형 및 생물학적 과정을 기반으로 해야 합니다. 당사 시스템에 사용되는 펌프는 ± 200mmHg의 정상 상태 압력 범위 내에서 작동하며 ± 200mmHg의 중요한 압력 변화에 대한 명령에 응답할 수 있습니다. 압력 상승 시간 및 하강 시간은 20mmHg 단계의 경우 6-8ms, 200mmHg 단계의 경우 15-20ms를 초과해서는 안 됩니다. 힘 분해능을 보장하려면 HSPC 시스템의 소음 수준이 피크 투 피크에서 ± 0.5mmHg 미만이어야 합니다. 이러한 요구 사항은 이 설정에 적용됩니다. 그러나, ± 40mmHg의 범위는 실험 프로토콜(15)에 대한 반응을 달성하기에 충분하다. 형광 카메라와 관련하여 95% 양자 효율과 11μm x 11μm 픽셀 크기 칩을 선택했습니다. 이 민감한 센서 구성은 형광 신호를 고속으로 효율적으로 캡처합니다. 또한, 이미징16 동안 적절한 신호 대 잡음비를 위해 1.6e-의 중간 판독 잡음을 유지하는 것이 중요합니다.
절차적 관점에서 fMPA를 실행하려면 일련의 고급 기술이 필요합니다. 예를 들어, 마이크로피펫 절단기를 사용하여 마이크로피펫을 제작하려면 온도 및 위치 지정에 대한 세심한 제어와 함께 정밀도와 손재주가 필요합니다. 현미경의 시야 내에 마이크로피펫을 배치하려면 마이크로피펫 팁과 세포 챔버의 손상을 방지하기 위해 세심한 노력이 필요합니다. 또한 형광 이미징과 관련된 일반적인 과제 중 하나는 광표백입니다. 이 문제를 완화하려면 조명 시스템에 대한 샘플의 노출 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. '형광 결합 마이크로피펫 흡인 분석' 프로토콜과 관련하여, 여기 광원의 형광 셔터는 카메라 작동 소프트웨어를 통해 모든 파라미터가 입력되고 흡인 시스템이 실험할 준비가 될 때까지 꺼진 상태로 유지됩니다. 그런 다음에야 형광 셔터가 켜져 이미징을 시작합니다. 광표백을 더욱 줄이려면 샘플에서 적절한 형광 발현을 생성하는 최소 광원 강도를 사용하는 것이 좋습니다.
또한 fMPA 분석에 필요한 현재 수동 작업으로 인해 이 기술은 노동 집약적입니다. 결과적으로, 이 분석에서 발생할 수 있는 불일치는 주로 작업자 종속 변수뿐만 아니라 필라멘트 예열 및 모세관 유리 특성의 변화와 관련된 요인에서 비롯됩니다. 앞으로 이 기술의 성능을 최적화하려면 잠재적인 탠덤 구현을 고려해야 합니다. 예를 들어, 미세유체 장치와 결합하면 마이크로피펫 흡입을 고처리량 플랫폼으로 변환하여 실험 속도를 시간당 약 20개 세포에서 약 1,000개 세포/h로 크게 증가시킬 수있습니다 17,18. 이러한 통합은 데이터의 재현성도 향상시킵니다. 더욱이, 자동화 및 이미지 분석 시스템(19)을 통합함으로써 특정 방안이 성공적으로 탐색되었다. 특히, 유한 요소 분석(FEA)은 마이크로피펫 흡인 분석을 모델링하는 데 일반적으로 사용되는 계산 도구입니다. FEA는 기계적 자극에 대한 세포 반응을 예측하고 기계적 특성을 특성화할 수 있습니다. 마이크로피펫 설계를 최적화하고 실험 결과를 추가로 검증할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다19.
결론적으로, fMPA 접근법은 기계적 자극에 반응하는 적혈구의 기계적 민감성 행동에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이 연구는 적혈구 내 및 더 광범위한 생물학적 시스템 전반에 걸친 기계적 형질도입의 복잡한 메커니즘에 대한 향후 연구를 위한 기초 프레임워크를 설정합니다. 이러한 연구는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진시키고 다양한 생리학적 맥락에서 광범위한 의미를 밝히는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다.

세포 행동의 세계에서 펼쳐지는 발견은 접착, 이동 및 분화와 같은 동적 세포 활동을 지시하는 데 있어 장력, 유체 전단 응력, 압축 및 기판 강성과 같은 기계적 자극의 역할을 강조했습니다. 이러한 기계생물학적 측면은 세포가 생리적 환경과 상호 작용하고 반응하여 다양한 생물학적 과정에 영향을 미치는 방식을 설명하는 데 가장 중요합니다 1,2.
지난 10년 동안 마이크로피펫 기반 흡인 분석은 기계적 자극에 대한 다양한 세포 반응을 연구하는 다목적 도구로 두각을 나타냈습니다. 이 기술은 세포 탄성 계수, 강성 및 피질 장력을 포함하여 단일 세포 수준에서 살아있는 세포의 고유한 기계적 특성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이러한 분석을 통해 세포막 장력, 세포막에 가해지는 압력 및 피질 장력과 같은 다양한 기계적 매개변수를 측정할 수 있습니다(표 1에 요약됨). 열망하는 힘을 연구하는 것은 특히 단편화, 신장 및 발아를 포함한 막 역학 영역에서 세포 기능과 과정에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했습니다 3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>기계적 매개 변수</td>
			<td>묘사</td>
			<td>중요한 접근법</td>
		</tr><tr><td>셀 강성</td>
			<td>셀의 기계적 강성 및 탄성 측정.</td>
			<td>세포막의 흡인 및 음압에 대한 변형 반응 분석20,21.</td>
		</tr><tr><td>접착 강도</td>
			<td>세포가 표면에 얼마나 강하게 부착되는지에 대한 평가.</td>
			<td>기판2,22에서 부착된 세포를 분리하기 위한 제어된 흡입의 적용.</td>
		</tr><tr><td>멤브레인 장력</td>
			<td>세포막 내의 장력 또는 응력 평가.</td>
			<td>적용된 압력에 대한 멤브레인 변형 측정23,24.</td>
		</tr><tr><td>점탄성 특성</td>
			<td>세포의 결합된 점성 및 탄성 거동의 특성화.</td>
			<td>흡인에 대한 시간 의존적 변형 반응 분석23,25.</td>
		</tr><tr><td>변형성</td>
			<td>세포가 얼마나 쉽게 모양을 바꿀 수 있는지에 대한 결정.</td>
			<td>제어된 흡입 하에서의 변형 정도 평가20,24.</td>
		</tr><tr><td>표면 장력</td>
			<td>셀 표면의 장력 측정.</td>
			<td>마이크로피펫 멤브레인 돌출부를 형성하는 데 필요한 압력 평가26.</td>
		</tr><tr><td>세포-물질 상호작용</td>
			<td>세포와 재료 또는 기질 간의 상호 작용에 대한 연구.</td>
			<td>다른 물질과 접촉하는 세포의 흡인 및 상호 작용 관찰2,24.</td>
		</tr><tr><td>세포-세포 상호작용</td>
			<td>인접 세포 간의 상호 작용 검사.</td>
			<td>세포 그룹의 흡인 및 세포 간 힘 분석27.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 마이크로피펫 흡인 분석으로 특징지어지는 기계적 파라미터.
마이크로피펫 기반 흡인 기법은 적혈구(RBC)를 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 순환계에서 적혈구의 기능을 이해하는 데 필수적인 적혈구의 변형성과 다양한 기계적 특성을 평가합니다. 적혈구는 놀라운 적응성을 나타내며, 복잡한 모세혈관 네트워크와 내피 간 틈새를 통과할 때 변형에 대한 기계적 다양성을 보존합니다 5,6. 이 여정 동안 적혈구는 0.5-1.0 μm의 좁은 통로를 통과해야 하며 장력 및 압축을 포함한 다양한 기계적 힘을 받아야 합니다 7,8,9. 또한 순환 중 혈류에 의해 발생하는 전단 응력에 대한 민감도가 높다10. 이러한 과정은 기계적 자극에 대한 세포 반응에서 잘 확립된 역할을 하는 중요한 신호 이벤트인 칼슘 유입과 관련된 조절 메커니즘의 활성화를 촉진합니다11,12. 칼슘 매개 메카노센싱을 지배하는 복잡한 메커니즘은 여전히 지속적인 연구의 강력한 주제로 남아 있습니다.
이러한 맥락에서 fMPA는 정밀하게 제어되는 기계적 힘 하에서 칼슘 동원의 정도를 밝히는 효과적인 접근 방식으로, 기계적 조절(마이크로피펫 흡입 시스템 사용)과 칼슘 강도 시각화(형광 표시기 사용)를 동시에 적용할 수 있습니다. 특히 적혈구가 좁아지는 혈관을 통과할 때의 생리학적 시나리오를 모방합니다. 우리가 개발한 fMPA 시스템은 1mmHg의 분해능으로 압력을 생성할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 구현된 고속 카메라는 100ms의 시간 해상도와 서브미크론 미터 수준의 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이러한 구성은 살아있는 세포에 기계적 힘을 정밀하게 적용하고 동시에 그 결과로 발생하는 세포 신호를 포착합니다. 또한, 이 설정의 통합적 엔지니어링 특성으로 인해 마이크로피펫 흡인 분석은 다른 장비나 기술을 보완하기 위해 쉽게 조정할 수 있어 세포 역학의 복잡성을 더 깊이 탐구할 수 있습니다. 이러한 다양성은 이 접근 방식의 또 다른 장점입니다.

<table><tbody><tr><td>&마이크로; Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>버전 2.0.0</td></tr><tr><td>1mL 주사기&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>210320D</td><td>는 Microfil&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 피펫&nbsp;</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td>3123000055</td><td>레드 클루드 셀 준비</td></tr><tr><td>22 x 40 mm 커버 슬립</td><td>니트텔 유리&nbsp;</td><td>MS0014</td><td>셀 챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>50 mL 주사기&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>220617E</td><td>급수탑에 연결</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Tryode's&nbsp; 완충제 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM Hepes, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 그리고 1 mM CaCl<>sub2로 보충된 5.5 mM D-포도당. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>원심분리기 5425</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5405000280</td><td>레드 클루드 세포 제제</td></tr><tr><td>Clexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>수집된 혈액의 응고를 방지합니다. 10,000 U/mL</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>부지런한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 광원</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td><td>마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td>마이크로피펫 제조</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tryode의 완충액 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충됨. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Tryode의 완충액 준비 - 12mM NaHCO3, 10mM Hepes, 0.137M NaCl, 2.7mM KCl 및 5.5mM D-포도당에 1mM CaCl<>sub2이 보충됨. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>고속 GigE 카메라</td><td>Manta</td><td>G-040B</td><td>마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템</td></tr><tr><td>고속 압력 클램프</td><td>과학 기기</td><td>HSPC-2-SB</td><td>압력 펌프와 협력</td></tr><tr><td>고속 압력 클램프 헤드 스테이지&nbsp;</td><td>Scientific Instrument</td><td>HSPC-2-SB</td><td>는 압력 펌프</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscopy</td>와 협력합니다.<td>올림푸스&nbsp;</td><td>Olympus IX83</td><td>마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템</td></tr><tr><td>Microfil&nbsp;</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G (67 mm Long) 컷 마이크로피펫에 Revome 공기 방울을 넣고 피펫 팁의 개구부를 테스트합니다.</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>셔터 기기</td><td>P1000</td><td>마이크로피펫 제조&nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 초순수 정화 시스템</td><td>Merck Millipore</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 및 Tryode의 완충제</td></tr><tr><td>피펫 마이크로포지&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>마이크로피펫 제조</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tryode's; 완충제 - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충되었습니다. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>압력 펌프&nbsp;</td><td>과학 기기</td><td>PV-PUMP</td><td>실험 중 제어 압력 유도</td></tr><tr><td>Prime 95B 카메라&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>Flourscent 이미징</td></tr><tr><td>로터리 휠 원격 장치&nbsp;</td><td>센스 에이펙스&nbsp;</td><td>마이크로피펫 위치 조정을 위한</td> <td>uM-RM3</td> 제어판&nbsp;</tr><tr><td>Scepter 3.0 휴대용 세포 계수기</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC340KIT</td><td>자동 세포 계수기</td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 준비 - 250mL의 Mili Q 물 중 Na<>2><CO3 2.65g - 최종 pH = 8-9.</td></tr><tr><td>탄산나트륨 (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 준비 - 250 mL의 Mili Q 물 2.1 g에 NaHCO3 2.65 g과 Na2CO3 - 최종 pH = 8-9.</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tryode의 완충액 준비 - 12mM NaHCO3, 10mM Hepes, 0.137M NaCl, 2.7mM KCl 및 5.5mM D-포도당에 1mM CaCl2이 보충되었습니다. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기 일수화물(NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Tryode's; 완충액 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM Hepes, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충됨. 최종 pH = 7.2</td></tr><tr><td>터치 스크린 제어 장치&nbsp;</td><td>센스 에이펙스&nbsp;</td><td>마이크로피펫 위치 조정을 위한</td> <td>uM-TSC</td> 제어판&nbsp;</tr><tr><td>X 드라이 목표&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL</td><td>마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템</td></tr></tbody></table>

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

마이크로피펫 흡인 분석은 오랫동안 살아있는 세포 역학 연구의 초석이 되어 왔으며, 기계적 스트레스에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 백서는 형광 결합 마이크로피펫 흡인(fMPA) 분석의 혁신적인 적응에 대해 자세히 설명합니다. fMPA 분석은 이온 채널에 의해 매개되는 살아있는 세포 기계적 전달 과정을 동시에 모니터링하면서 정밀한 기계적 힘을 투여할 수 있는 기능을 도입합니다. 정교한 설정에는 정밀하게 설계된 붕규산 유리 마이크로피펫이 미세하게 조절되는 물 저장조와 공압 흡입 시스템에 연결되어 있어 ± 1mmHg까지 정제된 증분으로 제어된 압력 적용이 용이합니다. 중요한 개선 사항은 epi-fluorescence 이미징의 통합으로, 흡인 중 세포 형태학적 변화와 세포 내 칼슘 플럭스를 동시에 관찰하고 정량화할 수 있습니다. fMPA 분석은 epi-fluorescence 이미징과 마이크로피펫 흡인의 시너지 효과를 통해 기계적으로 까다로운 환경에서 세포 메카노센싱 연구를 위한 새로운 표준을 제시합니다. 이 다면적 접근 방식은 다양한 실험 설정에 적용할 수 있어 단일 세포 메카노센싱 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

마이크로피펫 흡인 분석을 확립하기 위해 먼저 손잡이로 연결된 두 개의 금속 사각형(구리/알루미늄)으로 구성된 맞춤형 셀 챔버를 구성했습니다. 두 개의 3차 절단 유리 커버슬립(40mm × 7mm × 0.17mm)을 부착하여 Tyrode의 완충액에 부유하는 200μL의 적혈구로 채워진 챔버를 만들었습니다. 적혈구를 챔버에 도입한 후 맞춤형 붕규산 마이크로피펫을 홀더에 고정하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 챔버 내에 조심스럽게 배치했습니다. 이어서, 마이크로피펫을 더 가까이 가져와 표적 적혈구를 포획하였다.
세포 흡인의 경우, 이 방법은 공압식 고속 압력 클램프를 사용하여 음의 흡인 압력을 미세 조정했습니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행하여 적용된 다양한 음의 흡인 압력에서 칼슘 동원을 조사했습니다.
fMPA를 사용하여 적혈구가 다양한 음압 흡인압에 어떻게 반응하는지 조사한 결과, 적용된 음압과 흡인된 적혈구에 존재하는 칼슘 유입 사이에 명확한 비례 관계가 있음을 알 수 있었습니다. 칼슘 강도 변화를 결정하기 위해, 단일 흡인 셀의 최대 강도(Fmax)에서 배경 강도(Fb)를 뺀 값을 휴지 강도(F0)에서 Fb를 뺀 값으로 나누었습니다. 압력이 -10mmHg(그림 3A)에서 -40mmHg(그림 3D) 사이에서 점진적으로 증가했을 때 적혈구로의 칼슘 이온 유입이 증가했습니다. 이는 적혈구가 기계적 변화를 감지하고 빠른 칼슘 특이적 채널 활동에 의해 반응하는 능력을 가지고 있음을 시사한다14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg"> 그림 3: 시간에 따른 정규화된 강도 변화를 그래픽으로 표현한 형광 이미징. 가로로 가로지르는 것은 정지 상태의 적혈구(왼쪽)와 마이크로피펫에 의해 흡인되는 인간 적혈구(가운데)의 형광 스냅샷을 보여줍니다. 다중 음의 흡인 압력(Δp)에서 흡인되는 적혈구의 대표적인 흔적은 오른쪽에서 볼 수 있습니다. 음의 흡인 압력은 (A) Δp = -10mmHg, (B) Δp = -20mmHg, (C) Δp = -30mmHg, (D) Δp = -40mmHg에서 시작하여 점진적으로 증가합니다. 흡인 중에 적혈구의 혀가 길어지면 Cal-520 AM 접힘 변화가 증가하여 상당한 칼슘 동원이 관찰될 수 있습니다. F/F0 는 흡인된 적혈구 내부의 칼슘 동원을 조사하는 데 사용되었습니다. 위의 곡선에서 관찰된 추세는 Cal-520 AM 신호가 적용된 음의 흡인 압력의 증가에 비례하여 증가한다는 것을 보여주었습니다. 눈금 막대 = 5μm. 약어: RBCs = 적혈구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S1: fMPA 준비 프로토콜의 중요한 단계에 대한 체크포인트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 세그멘테이션을 조정하고 수행하기 위한 안내 프로세스입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

기계적 스트레스 하에서의 세포 거동에 대한 탐구는 세포 역학 및 기계생물학의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 당사는 단일 세포에서 세포 내 신호의 포괄적인 분석과 제어된 기계적 자극을 결합하는 새로운 방법인 형광 마이크로피펫 흡인(fMPA) 기법을 소개합니다. 이 기술은 살아있는 세포 기계생물학에 대한 새로운 심층 연구를 조사합니다.

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

우리 연구의 범위는 생활 방식 기계생물학, 특히 기계적 스트레스가 가해지는 세포의 행동에 관한 것입니다. 우리는 단일 세포의 세포 내 신호 전달을 조사하고 있습니다. 제안된 FMPA 시스템은 기계적 자극과 결합된 형광 이미징을 활용합니다.즉, 흡인 압력입니다. 현재 미세유체역학 또는 이미지 분석 소프트웨어와 같은 미세흡인 설정과 두 가지 이상의 기술을 결합하려고 시도한 추가 발전이 있습니다. 현재 실험 과제는 설정이 상당히 노동 집약적이고 작업자에 의존한다는 사실에 있습니다.시스템이 수동으로 작동되기 때문에 특정 단계에서 발생하는 불일치가 있습니다. 예를 들어, 필라멘트 예열. 연구 결과에 따르면 압력이 음의 10mm 수은에서 음의 40mm 수은 사이에서 점진적으로 증가할 때 적혈구로의 칼슘 이온 유입이 증가한다는 것이 입증되었습니다.이는 적혈구가 기계적 환경의 변화를 감지하고 빠른 칼슘 관련 채널 활동으로 반응하는 능력을 가지고 있음을 시사합니다. 이 연구는 다양한 자극 하에서 적혈구가 보여주는 미묘한 기계적 민감성 반응을 밝히기 위한 중요한 도구로서 FMPA의 적용에 특히 중점을 둡니다.

fluorescence-micropipette-aspiration-assay-to-investigate-red-blood

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 비디오에서는 BFP(biomembrane force probe)를 사용하여 수용체와 리간드 사이의 힘을 측정합니다. 이 기술은 프로브 비드에 접합된 pMHC와 표적 세포의 TCR 사이의 결합을 끊는 데 필요한 압력을 모니터링하여 상호 작용을 감지할 수 있습니다.

수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

배우세요 형광 마이크로피펫 흡인 기법을 활용한 적혈구 메카노센싱 분석 방법입니다. 기계적 자극에 따른 세포 내 칼슘 이온 유입 변화를 측정하여 적혈구의 기계생물학적 반응 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

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