Name: 인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 줄기세포 기술과 오가노이드를 활용한 약물-질병 상호작용 연구 방법입니다. 무혈청 하이드로겔 시스템에서 장 오가노이드를 생성하고 유지하는 최적화 프로토콜을 통해 생리적 충실도를 높이는 첨단 인체외 모델을 탐색하세요.

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저자는 Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano 및 Russell D'Souza 박사로부터 hiPSC 및 오가노이드 작업 시작에 대한 이전 교육 및 일반적인 권장 사항을 인정합니다. 그들은 체외 세포 배양 작업을 위해 하이드로겔 시스템을 사용하는 방법에 대한 Chelsey Simmons 박사의 지도에 감사드립니다. 또한 저자들은 hiPSC 배양에 대한 지도를 해준 STEMCELL Technologies의 Christine Rodriguez와 Thomas Allison 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 또한 출판 비용을 부담해 준 TheWell Bioscience에 감사를 표합니다.

iPSC에서 효율적인 인간 장 오가노이드 생성을 위한 매트릭스 비교

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<li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li>
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<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li>
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<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
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<li>biotechne R&D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22biotechne+R%26D+Systems%22%5BJournal%5D)">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&D Systems. , (2024).</li>
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<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
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</ol>

John Huang 박사는 TheWell Bioscience의 설립자 겸 CEO입니다.

줄기 세포 및 오가노이드 작업을 위한 최적의 미세환경을 선택하는 것은 광범위한 응용 분야에서 이러한 플랫폼을 사용할 때 중요한 초기 단계입니다. 당사의 대표적인 결과는 Matrix 4-XFO3가 더 높은 농도의 성장 인자와 결합하여 더 큰 오가노이드로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 무계 하이드로겔의 물리적 특성을 활용하여 이러한 시스템을 사용하여 오가노이드 생성을 최적화할 수 있음을 시사합니다. 세포외 기질(ECM)의 독특한 특성이 장기 내의 세포의 정체성과 밀접하게 얽혀 있다는 것이 이전에 밝혀졌다(12). 세포는 인테그린(integrin)과 다른 수용체(receptor)를 통해 외부의 힘을 감지하기 때문에, ECM의 기계적 특성은 줄기세포에 지대한 영향을 미치며, 이에 대한 반응으로 줄기세포는 내부력을 생성할 수 있다12. 줄기세포와 줄기세포의 미세환경 사이의 상호작용은 다양한 신호전달 경로를 시작하는 데 핵심적이다12. 또한 ECM은 세포 행동에 영향을 미치는 성장 인자 및 기타 신호 분자를 저장하고 방출하기 위한 저장소 역할을 할 수 있는 것으로 나타났습니다. 따라서 우리의 대표적인 결과와 수십 년간의 연구는 체외 조사를 위한 매트릭스 시스템을 선택할 때 네이티브 셀 미세환경 및 조직 특성의 생화학적 및 물리적 측면을 고려하는 것의 중요성을 강조합니다29,30.
사용자에게 잠재적인 문제와 이를 방지하는 방법을 조언하기 위해 프로토콜을 통해 몇 가지 중요한 단계와 권장 사항이 설명되었습니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 중추적인 두 가지 중요한 단계가 이러한 방법에서 제시됩니다. 첫째, 줄기 세포 집단과 관련된 특정 마커를 확인하는 것은 줄기 세포 집단이 효율적으로 제어된 분화를 준비할 수 있도록 최적의 코팅 시스템을 결정하는 데 중요합니다. 마찬가지로, 각 분화 단계와 관련된 마커의 발현을 확인하는 것은 다음 단계로 진행할 시기를 결정하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 각 단계에서 필요한 최소 시간에 대한 일반적인 지침을 제공합니다. 그럼에도 불구하고 각 단계에서 최적의 시간은 세포주와 실험 조건(예: 유전자형, 강성)에 따라 다릅니다. 따라서 여러 스테이지 특이적 마커를 특성화하는 것이 hIO 생성의 효율성을 개선하는 가장 좋은 방법입니다.
두 번째 중요한 단계는 가장 중요한 이종 없는 Matrix 4-XF 시스템을 사용할 때 더 높은 농도의 성장 인자를 통합하는 것이었습니다. 무이물질 생체재료 시스템의 자주 강조되는 한계 중 하나는 성장 인자의 부족이다31. 그러나 이러한 약점은 강점이 될 수 있습니다: 재현성을 향상시키기 위해 시스템의 성장 요인을 완전히 제어해야 합니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 배지 및 성장 인자 보충 키트를 사용하는 방법을 설명하지만, 개별 구성 요소를 사용하여 사내에서 완전한 배지를 만들 때도 동일한 이론적 근거를 사용할 수 있습니다. 특정 비율 하이드로겔/매체는 성장 인자의 농도가 얼마나 더 높아야 하는지 안내합니다. 예를 들어, 2:1 비율은 사용된 표준 전체 매체를 대표하는 농도가 되기 위해 성장 인자의 3배 농도가 필요할 수 있습니다. 시스템에 존재하는 성장 요인을 완전히 제어하면 기계론적 질문에 답하고 많은 응용 분야에 대한 규제 문제를 피할 수 있습니다.
3단계에서 설명한 이미지 처리 단계는 이미지의 품질과 촬영된 이미지 유형에 따라 제한됩니다. 각 이미지 유형 및 품질의 특정 요구 사항에 맞게 조정이 필요할 수 있습니다. 그러나 프로세스의 전체 단계와 명시야 이미지의 오가노이드 크기 분석을 위한 기본 프레임워크의 MATLAB 코드 샘플은 더욱 최적화하고 확장할 수 있는 워크플로우를 정의하는 데 도움이 됩니다. 또한 명시야 현미경에 대한 접근은 다른 유형의 현미경보다 더 일반적입니다. MATLAB에 대한 액세스 권한과 친숙함이 부족하면 이 코드의 사용이 제한될 수 있지만, 프로세스의 일반적인 단계는 Fiji by Image J와 같은 오픈 소스 소프트웨어와 호환됩니다. 오가노이드 크기만으로는 성숙도를 평가하는 데 권장되는 지표가 아닙니다. 표적 기관을 대표하는 특정 마커에 대한 평가를 따르는 것이 좋습니다. 장 조직에 대한 이러한 마커 중 일부는 표 4에 포함되어 있습니다. 그림 6 은 오가노이드의 외부 표면(기저측)에 국한된 상피 세포 접착 분자(EpCAM)를 사용한 전체 오가노이드의 면역형광 염색의 예를 보여줍니다. EpCAM은 모든 ECM 시스템에서 배양된 오가노이드에서 시각화되었지만 이러한 오가노이드의 크기에는 차이가 있었습니다. 따라서 오가노이드 크기에 대한 정보는 배양 조건을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 또한, 약물 반응 연구에서 오가노이드 크기는 테스트된 화합물에 대한 반응의 척도 역할을 합니다. 크기의 변화는 테스트된 화합물의 효과 또는 독성을 반영할 수 있습니다. 중요한 것은 표준화된 크기의 오가노이드를 여러 배치를 생성하는 것이 현재 이 분야의 과제이지만, 이는 실험 재현성의 중요한 지표이므로 다른 실험 또는 실험실에서 결과를 비교할 수 있습니다. 전체적으로 명시야 이미지에서 오가노이드에 대한 중요한 정보를 추출할 수 있는 자동화된 워크플로우는 많은 연구자에게 유용한 도구입니다.
동물 유래 매트릭스와 무이종 하이드로겔 두 시스템 모두 장점과 단점이 있습니다. 매트릭스 2-AB는 다른 동물 유래 매트릭스보다 MH 단계에서 더 적은 스페로이드 방출을 초래하며, 이는 상업적으로 이용 가능한 동물 유래 매트릭스의 널리 알려진 특성인 로트 간 변이로 인해 발생할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 ECM 시스템의 농도가 다양하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 제품 사양 시트의 희석 계수는 코팅 용액을 준비하는 데 사용되었으며, 이는 동물 유래 매트릭스의 경우 약간 다른 농도로 이어질 수 있습니다. 이러한 단백질 농도의 차이는 분화에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 이는 서로 다른 로트의 동일한 제품을 사용할 때 분화 효율에 변동을 초래할 수 있습니다. 이러한 시스템 중에서 선택하려면 특정 실험 목표, 윤리적 고려 사항 및 규제 요구 사항과 같은 요소를 고려하십시오. 예를 들어, 종양 및 암 생물학 질문에 답하기 위해 체외 실험 결과를 마우스 동물 모델과 비교하는 경우 Engelbreth-Holm Swarm EHS 마우스에서 파생된 매트릭스를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 Matrigel과 같은 제품은 수십 년 동안 사용되어 왔기 때문에 많은 프로토콜, 데이터 및 참조가 있습니다. 그러나 물리적 및 화학적 특성을 사용자 정의할 수 있는 잘 정의된 무이종 매트릭스를 사용하는 것은 연구 질문이 인간의 질병 또는 치료법과 관련된 경우 더 적합한 옵션일 수 있습니다. 또한 대부분의 무이종 하이드로겔 시스템은 규제 표준을 충족하도록 설계되었으므로 GMP(Good Manufacturing Practices) 또는 기타 규제 지침을 준수해야 하는 연구에 적합합니다.
요약하면, 동물 유래 매트릭스는 생체 적합성으로 인해 iPSC 유지 관리 및 오가노이드 생성에 널리 사용되어 왔지만, 무생물 하이드로겔 시스템은 재현성, 비용 효율성, 규정 준수 및 윤리적 고려 사항 측면에서 이점을 제공합니다. 둘 사이의 선택은 연구 또는 임상 적용의 특정 요구 사항에 따라 다릅니다. 무이종 하이드로겔 시스템은 전임상 치료 후보 목록에 대한 오가노이드 및 미세생리학적 시스템의 활용을 지원할 수 있는 보다 다재다능하고 지속 가능한 대안으로 인기를 얻고 있습니다. 이 응용 프로그램은 초기 약물 개발을 크게 개선하고 제약 산업의 현재 임상 번역 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

세포외 기질(ECM)은 세포의 행동과 발달을 조절하는 데 중심적인 역할을 하는 조직의 역동적이고 다기능적인 구성 요소입니다. 복잡한 네트워크로서 구조적 지지, 세포 접착 리간드(cell adhesive ligands)1, 세포 신호 전달을 조절하는 성장 인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine)의 저장을 제공합니다. 예를 들어, 상처 치유 중에 ECM은 세포의 이동을 위한 골격체이자 조직 복구에 관여하는 성장 인자의 저장소 역할을 한다2. 마찬가지로, ECM의 조절 장애는 섬유증 및 암과 같은 다양한 질병의 중증도를 증가시킬 수 있습니다 3,4. 배아 발달 동안 ECM은 조직 형태 형성을 안내합니다. 예를 들어, 심장의 발달에서 ECM 구성 요소는 심장 조직의 올바른 구조와 기능을 만드는 데 중요한 역할을 한다5. 10년 이상의 연구에 따르면 미세환경의 강성만으로도 줄기세포 계통 사양을 제어할 수 있습니다 6,7. 따라서 in vitro cell differentiation에서 ECM이 분화를 위한 신호를 제공하여 줄기세포의 운명에 영향을 미치는 것은 놀라운 일이 아닙니다.
오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 오가노이드를 성공적으로 생성하려면 적절하게 특성화된 iPSC 라인으로 시작해야 합니다. 그러나 기존 세포 배양 물질에는 생리학적 단서가 없기 때문에 효율적인 iPSC 분화와 오가노이드 생성을 방해합니다. 더욱이, 최근의 연구는 세포외 기질(ECM)의 구성, 세포와 ECM사이의 상호 작용8, 오가노이드 확장 및 분화의 맥락에서 기계적 및 기하학적 단서(9,10,11)의 중요성을 강조하고 있다12. 재현성을 개선하여 오가노이드 기술을 발전시키려면 조직 특이적인 물리적, 화학적 단서를 통합해야 합니다.
오가노이드는 생리학적으로 유사한 미세환경 내에서 네이티브 조직을 재현하는 것을 목표로 합니다. 본래 조직 ECM을 밀접하게 모방하는 ECM 시스템을 선택하는 것은 세포의 행동, 기능 및 자극에 대한 반응에 관한 생리학적 타당성을 달성하는 데 매우 중요하다13. ECM 구성 요소의 선택은 줄기 세포가 오가노이드 내의 특정 세포 유형으로 분화하는 데 영향을 미칠 수 있습니다. 다양한 ECM 단백질과 그 조합은 세포의 운명을 안내하는 단서를 제공할 수 있다14. 예를 들어, 연구에 따르면 특정 ECM 구성 요소를 사용하면 장 줄기 세포가 성숙한 장 세포 유형으로 분화하는 것을 촉진하여 생리학적으로 관련된 장 오가노이드를 생성할 수 있습니다15. 오가노이드는 질병 모델링 및 약물 테스트 중에 유용한 도구이지만, 적절한 ECM 시스템을 선택하는 것이 이 응용 분야에서 매우 중요합니다. 적절한 ECM 시스템은 영향을 받은 조직(16)과 유사한 미세환경을 생성함으로써 질병 모델링의 정확도를 향상시킬 수 있다. 또한 조직 특이적 ECM은 질병 관련 표현형 및 약물 반응을 더 잘 요약하는 오가노이드를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다17. 오가노이드 분화에 사용되는 ECM 시스템을 최적화하는 것은 원하는 분화 결과를 달성하는 데 매우 중요합니다.
동물 ECM 소스(예: Matrigel, Cultrex) 및 무이종 하이드로겔(예: VitroGel)에서 파생된 상업적으로 이용 가능한 기저막 시스템은 iPSC 및 오가노이드 연구에 널리 사용됩니다. 이를 상용화하는 회사와 이를 사용하는 연구자들은 수년에 걸쳐 특정 제품과 응용 분야에 대한 많은 지침을 제시했습니다. 이러한 지침의 대부분은 이 프로토콜의 생성을 위한 가이드 역할을 했습니다. 더욱이, 그들의 내재적 특성과 관련된 이점과 단점은 많은 사람들에 의해 개별적으로 언급되어 왔다 18,19,20,21. 그러나 iPSC 및 오가노이드 작업을 위한 최적의 시스템 선택을 안내하는 체계적인 워크플로우는 없습니다. 여기에서는 iPSC 및 오가노이드 작업을 위해 다양한 소스의 ECM 시스템 동등성을 체계적으로 평가할 수 있는 워크플로우를 제공합니다. 이것은 Matrigel(Matrix 1-AB), Geltrex(Matrix 2-AB), Cultrex(Matrix 3-AB) 및 VitroGel(Matrix 4-XF)의 네 가지 다른 매트릭스에서 두 가지 다른 인간 iPSC 라인(hiPSC) 및 인간 장 오가노이드(hIO) 생성의 유지에 대한 비교 연구입니다. 오가노이드 배양의 경우 이전에 오가노이드 배양에 최적화된 이종이 없는 matrix VitroGel의 4가지 버전인 ORGANOID 1(매트릭스 4-O1), ORGANOID 2(매트릭스 4-O2), ORGANOID 3(매트릭스 4-O3), ORGANOID 4(매트릭스 4-O4)가 사용되었습니다. 또한 오가노이드에 최적화된 동물 유래 매트릭스인 Matrigel High Concentration(Matrix 1-ABO) 및 Cultrex Type 2(Matrix 3-ABO)가 사용되었습니다. 시판되는 줄기세포 배양 배지(mTeSR Plus)와 오가노이드 분화 키트(STEMdiff intestinal organoid kit)를 사용하였다. 이 프로토콜은 제품 제조업체의 개별 지침과 실험실 경험을 결합하여 판독기가 특정 iPSC 및 오가노이드 작업을 위해 ECM을 성공적으로 최적화할 수 있도록 안내합니다. 이 프로토콜과 대표적인 결과는 줄기세포 작업과 오가노이드 분화를 위한 최적의 미세환경 선택의 중요성을 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>24-웰 플레이트(배양 처리, 멸균)</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>항접착 헹굼 Solutio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 (BSC)</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>로직</td><td></td></tr><tr><td>브라이트필드 현미경</td><td>Echo Rebel</td><td>REB-01-E2</td><td></td></tr><tr><td>BXS0116</td><td>ATCC</td><td>ACS-1030</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 온도 조절 (4 &deg; C capabilities)</td><td>ThermoScientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes, 15 mL, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes, 50 mL, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, Type 2</td><td>Bio-techne</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>3434-010-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca++ 및 Mg++ 없음)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexLDEV-Free, hESC 인증 성장 인자 감소</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A14133-02</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Guava Muse 세포 분석기 또는 기타 유세포 분석 장비(옵션)</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Heralcell Vios 세포 배양 인큐베이터(37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51033775</tr><tr><td>JMP 소프트웨어</td><td>SAS 연구소</td><td>JMP 16</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소 (GFR) 기저층 막 매트릭스 LDEV 무료</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel Matrix 고농도 (HC), 성장 인자 감소 (GFR) LDEV-free</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>354263</tr><tr><td>mTeSR Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 표면 처리 24-웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 Anti-human CD326 (EpCAM)</td><td>BD Pharmingen 566841</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human CDX2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>563428</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 안티-휴먼 FOXA2</td><td>BD Pharmingen</td><td>561589</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 마우스 안티-휴먼 SSEA4&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561565</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>SCTi003-A</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0510</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 (10 mL)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(5mL)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 장 오가노이드 성장 매체</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5145</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 장 오가노이드 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5140</td><td></td></tr><tr><td>비트로겔 하이드로겔 매트릭스</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM01</td><td></td></tr><tr><td>VitroGel ORGANOID 디스커버리 키트</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM04-K</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

세포외 기질(ECM)은 세포의 행동과 발달에 중요한 역할을 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 생성된 오가노이드는 많은 연구 분야에서 주목을 받고 있습니다. 그러나 기존 세포 배양 물질에는 생리학적 단서가 부족하여 효율적인 iPSC 분화를 방해합니다. 상업적으로 이용 가능한 ECM을 줄기 세포 배양에 통합하면 세포 유지 관리에 유용한 물리적, 화학적 단서를 얻을 수 있습니다. 동물 유래 상업적으로 이용 가능한 기저막 제품은 세포 유지를 지원하는 ECM 단백질과 성장 인자로 구성되어 있습니다. ECM은 세포의 운명을 조절할 수 있는 조직 특이적 특성을 가지고 있기 때문에 이종이 없는 매트릭스는 임상 연구로의 번역을 스트리밍하는 데 사용됩니다. 상업적으로 이용 가능한 매트릭스는 hiPSC 및 오가노이드 작업에 널리 사용되지만 이러한 매트릭스의 동등성은 아직 평가되지 않았습니다. 여기에서는 Matrigel(Matrix 1-AB), Geltrex(Matrix 2-AB), Cultrex(Matrix 3-AB) 및 VitroGel(Matrix 4-XF)의 4가지 매트릭스에서 hiPSC 유지 및 인간 장 오가노이드(hIO) 생성에 대한 비교 연구를 수행했습니다. 콜로니는 완벽하게 둥근 모양은 아니었지만 세포의 85% 이상이 줄기세포 마커 SSEA-4를 발현하는 등 자발적 분화가 최소화되었습니다. 매트릭스 4-XF는 3D 원형 덩어리를 형성했습니다. 또한, Matrix 4-XF 하이드로겔 용액을 만드는 데 사용된 배지에서 보충제 및 성장 인자의 농도를 증가시킴으로써 SSEA-4의 hiPSC 발현이 1.3배 개선되었습니다. Matrix 2-AB 유지 hiPSC의 분화는 다른 동물 유래 기저막에 비해 중기/후장 단계에서 스페로이드 방출이 더 적었습니다. 다른 것과 비교하여 무이물질 오가노이드 매트릭스(매트릭스 4-O3)는 더 크고 성숙한 hIO로 이어지며, 이는 무이물질 하이드로겔의 물리적 특성을 활용하여 오가노이드 생성을 최적화할 수 있음을 시사합니다. 전체적으로, 결과는 서로 다른 매트릭스의 구성 변화가 IO 분화 단계에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 이 연구는 상업적으로 이용 가능한 매트릭스의 차이점에 대한 인식을 높이고 iPSC 및 IO 작업 중 매트릭스 최적화를 위한 가이드를 제공합니다.

이 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 기저막과 무이종 하이드로겔 시스템을 사용하여 hiPSC 세포를 배양하고 hIO로 분화시키는 데 성공했습니다. 이 실험의 주요 목적은 hiPSC 및 hIO 작업을 위해 다양한 소스의 매트릭스 동등성을 체계적으로 평가하는 것이었습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 효율적인 장 오가노이드 생성을 생성하는 건강한 iPSC 배양의 유지 및 특성 분석에 초점을 맞췄습니다. 동물 유래 매트릭스 Matrix 1-AB, Matrix 2-AB 및 Matrix 3-AB로 배양기를 코팅하는 과정을 설명하고 무이종 하이드로겔 시스템 Matrix 4-XF와 비교했습니다.
그림 3A에서 볼 수 있듯이, hiPSC BXS 0116(CD34+ 유도)은 3개의 동물 유래 매트릭스에서 배양할 때 유사한 형태를 보여줍니다. 그럼에도 불구하고 Matrix 1-AB 코팅 웰에서 배양된 SCTi003-A(PBMC 유래)와 BXS 0116 세포주를 비교하면 세포주 간의 내재적 차이(표 6 참조)가 세포 증식, 분화 및 형태와 관련된 변동으로 이어질 수 있음을 강조합니다. 예를 들어, SCTi003-A 세포주에 대한 DE를 생성하는 데 3일이 걸렸지만 BXS0116 세포주에 대해서는 5일이 걸렸습니다. 또한, 그림 3B-C에서 볼 수 있듯이 Matrix 4-XF 하이드로겔 시스템에서 hiPSC를 배양하면 Matrix 1-AB 또는 이와 동등한 시스템으로 코팅된 플레이트에서 hiPSC 배양의 평면 형태와 크게 다른 부분적으로 내장된 3D 콜로니에 콜로니가 형성됩니다. 또한 이러한 실험에서 주목해야 할 주요 측면 중 하나는 3x 성장 인자를 사용하여 이종 없는 하이드로겔 시스템을 만드는 것이 세포 생존력과 줄기 세포 마커의 발현을 상당히 향상시킬 수 있다는 것입니다. 전체적으로, 동물 유래 매트릭스에 대한 hiPSC 배양 및 3x 성장 인자 농도로 만들어진 이종이 없는 매트릭스 4-XF는 SSEA-4(줄기 세포 마커)의 동등한 발현으로 이어졌습니다22; 그러나 하이드로겔 시스템은 부분적으로 내장된 3D 콜로니의 형성을 촉진합니다.
이 프로토콜의 두 번째 섹션에서는 hIO를 생성하기 위한 hiPSC의 차별화에 중점을 둡니다. 여기에서는 Spence et al.23 을 기반으로 개발된 상용 키트를 사용하여 명확한 내배엽(DE), 중창자/후배엽(MH)으로 분화하고 마지막으로 스페로이드를 수집하여 IO로 성숙시켰습니다(그림 4C). 효율적인 IO 생성을 위해서는 분화 프로토콜을 시작하기 전에 hiPSC 문화가 자발적 분화가 최소화되어 있는지 검사하는 것이 중요합니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이 DE 분화를 시작할 때 SSEA-4와 같은 줄기세포 마커의 발현이 낮을수록 모든 단계에서 공정의 효율성이 떨어지고(즉, MH 마커의 발현이 낮음) 그에 따른 hIO 생성이 저하됩니다. 소형 벤치탑 유세포 분석 장치를 사용하면 유세포 분석 결과에 빠르게 액세스하고 다음 단계로 이동하기 전에 분화 품질을 결정할 수 있습니다. 특이한 관찰은 Matrix 2-AB가 유지한 hiPSC가 다른 동물 유래 시스템에 비해 중장/후장 단계에서 스페로이드 방출이 적다는 것이었습니다. 주목해야 할 또 다른 주요 측면은 Matrix 4-XF에서 유지되는 hiPSC 콜로니가 분화 초기에 이미 3D 구조를 가지고 있었기 때문에 이러한 시스템이 더 큰 스페로이드로 이어졌다는 것입니다.
스페로이드를 매트릭스 1-ABO, 매트릭스 3-ABO 및 매트릭스 4-XFO1-, 매트릭스 4-XFO4에 내장하고 키트를 사용하여 hIO로 성숙시켰습니다. 스페로이드를 7일 동안 숙성시킨 후, 스페로이드를 통과시켜 각각의 매트릭스 시스템에 삽입했습니다. 각 시스템에서 오가노이드의 성장은 명시야 이미지에서 7일 동안 추적되었습니다. 배양은 비교적 비슷한 크기의 오가노이드로 시작했지만 5일 후에는 hIO 크기가 오가노이드가 내장된 매트릭스의 함수에 따라 달라졌습니다(그림 5). 4개의 Matrix 4-XFO 중 더 큰 오가노이드를 생성한 제형은 Matrix 4-XFO3였습니다. Matrix 4-XFO 시스템은 다양한 응용 분야에 적합하도록 다양한 리간드 및 기계적 특성으로 제조됩니다24. 특히, 매트릭스 4-XFO3 강성(25)은 다른 매트릭스 4-XFO 제형보다 인간의 장 강성(26)에 더 가까우며, 이는 오가노이드 팽창에 대한 ECM 기계적 특성의 역할에 대한 최근의 발견을 뒷받침한다(12,27,28). 당사의 대표적인 결과는 Matrix 1-ABO와 Matrix 3-ABO가 장 오가노이드의 성장과 확장을 동등하게 촉진한다는 것을 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig03.jpg"> 그림 3: iPSC 유지 보수를 위한 매트릭스 시스템 선택. (A) 세 가지 다른 동물 유래 매트릭스 시스템으로 코팅된 배양 도자기에서 성장한 두 세포주의 대표 이미지. (B) Matrix 4-XF와 1x 대 3x 성장 인자 보충제의 사용을 비교한 대표 이미지는 성장 인자 보충제를 늘리면 Matrix 4-XF 하이드로겔에서 hiPSC의 생존력이 향상됨을 보여줍니다. (C) Matrix 1-AB, Matrix 3-AB, Matrix 4-XF(3X)의 SSEA-4 발현에 대한 유세포 분석 비교는 동일한 발현을 보인 반면 Matrix 4-XF(1X)는 SSEA-4의 발현을 낮췄습니다. 막대는 n = 5의 평균 ± SD를 나타냅니다. 유의성 검정에는 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 및 비모수 Wilcoxon 방법을 사용한 사후 검정(post-hoc testing)이 사용되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig04.jpg"> 그림 4: iPSC를 명확한 내배엽(DE) 및 중창자/후배엽(MH)으로 분화 . (A) 다양한 수준의 SSEA4 마커로 시작하여 iPSC가 DE로 분화하는 대표적인 이미지는 줄기세포 마커의 발현이 높은 hiPSC 집단으로 분화를 시작하는 것의 중요성을 강조합니다. 빨간색 화살표는 DE를 시작하기 전에 자발적으로 분화되는 영역을 가리킵니다. (B) 분화 시작 전 줄기세포 마커 SSEA4 발현과 DE 분화 3일 후 DE 마커 FOXA2의 DE 분화 불량(왼쪽)과 양호한 분화(오른쪽)에 대한 유세포 분석의 예. 각 그래프는 1에서 추출된 세포의 분석을 나타냅니다. 통계적 분석을 위해서는 최소 3회의 유세포 분석 실행의 결과를 평균화하는 것이 좋습니다. (C) 연구된 모든 매트릭스에서 hIO로의 iPSC 분화의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig05.jpg"> 그림 5: 스페로이드 임베딩 및 hIO 성숙을 위한 매트릭스 시스템 선택. (A) Matrix 4-XFO 1-4에 포함된 hIO의 성숙 샘플 이미지. 매트릭스 4-XFO 시스템의 탄성 계수는 약 50-300 Pa이며, 매트릭스 4-XFO3 &gt; 매트릭스 4-XFO4 &gt; 매트릭스 4-XFO2 &gt; 매트릭스 4-XFO1이 가장 높습니다. 매트릭스 1-ABO 및 매트릭스 3-ABO 강성 범위는 배치에 따라 440-800Pa입니다. (B) hIO의 성숙에 대한 샘플 이미지는 임베딩 당일(0일) 및 배양 1주일(7일) 후에 매트릭스 1-ABO, 매트릭스 3-ABO 및 매트릭스 4-XFO3에 삽입되었습니다. (C) 서로 다른 매트릭스 시스템에서 성숙한 hIO의 크기 비교를 보여주는 데이터. 막대는 n = 7의 평균 ± SD를 나타냅니다. 유의성 검정에는 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 및 비모수 Wilcoxon 방법을 사용한 사후 검정(post-hoc testing)이 사용되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig06.jpg"> 그림 6: 서로 다른 매트릭스에서 성장한 장 오가노이드의 대표적인 면역형광 이미지는 상피 세포 집단을 확인합니다. 서로 다른 매트릭스에서 성장한 전체 장 오가노이드를 상피 세포 접착 분자(EpCAM)(녹색)로 고정 및 염색하고 세포핵 DAPI(파란색)에 대해 대조염색했습니다. 모든 오가노이드는 EpCAM 양성 세포를 보여주며, 이는 오가노이드의 외부 표면에 국한된 상피 세포 집단을 확인합니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: iPSC에 사용되는 배양기를 코팅하는 데 사용되는 매트릭스의 부분 표본 준비, 보관 및 희석에 대한 요약. * 정확한 희석 계수를 위해 각 로트의 분석 증명서에서 권장 희석 계수 및/또는 단백질 농도를 확인하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%201_Summary%20of%20aliquot%20preparation_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 배양 도자기 및 mTeSR Plus Medium의 표면적당 코팅 용액의 부피에 대한 참조 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%202_Volume%20of%20coating%20solutions_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: Matrix 4-XF 전구체 용액의 부피, 배양기 및 완전한 줄기 세포 배지의 표면적별 부피에 대한 참조 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%203_Reference%20table%20of%20the%20volume%20of%20Matrix4-XF_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 4: 공정 중 hiPSC 및 hIO를 특성화하는 데 권장되는 일반적인 마커 목록입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%204_List%20of%20common%20markers_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 5: 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)로 hiPSC를 분화하는 동안 필요한 매체 요약. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%205_Summary%20of%20media%20needed%20during%20hiPSC_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 6: 이 연구에서 사용된 두 개의 hiPSC 라인에 대한 구체적인 세부 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%206_iPSC%20lines%20information_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 특정 이미지 유형에 따라 수정할 수 있는 일반 MATLAB 코드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Code%20image%20Processing_RE.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

오가노이드는 질병 모델링을 위한 유용한 도구가 되었습니다. 세포외 기질(ECM)은 오가노이드 생성 중 세포의 운명을 안내하며, 자연 조직과 유사한 시스템을 사용하면 모델 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 이 연구는 동물 유래 ECM과 무이종 하이드로겔에서 유도만능줄기세포 유래 인간 장 오가노이드의 생성을 비교합니다.

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

우리의 연구는 개발 초기 단계에서 약물 발견 및 개발에 정보를 제공하기 위해 시험관 및 인실리코 모델을 통합하는 것을 목표로 합니다. 간단히 말해서 줄기 세포 기술, 오가노이드 및 미세유체역학을 결합하여 약물 질환 상호 작용, 막 무결성을 조사하고 약물 흡수 및 약물 대사를 예측합니다. 이 분야에서 최첨단 기술에는 장기 칩 및 오가노이드와 같은 미세 생리학 시스템과 같은 고급 체외 시스템과 결합된 실리콘 기반 생리학적 시스템이 포함됩니다.이 외에도 더 복잡한 체외 모델의 확장성을 극대화하기 위해 3D 바이오프린팅이 현재 연구되고 있습니다. 현재의 실험적 과제에는 조직 미세환경 및 이러한 체외 모델의 생리학적 충실도 향상, 실험 변동성 최소화 및 고처리량 기능 최적화가 포함됩니다. 또한 약물 개발에 대한 규제 표준을 준수하는 표준화된 프로토콜을 수립합니다.실험 변동성을 줄이고, 조직 미세환경을 더 잘 모방하며, 인간 약물 개발에 대한 규제 지침을 준수하는 것을 목표로 하는 이 프로토콜은 제어 조성 및 제어 기계적 특성을 가진 cell-free 하이드로겔 시스템을 사용하여 오가노이드 생성의 최적화와 이 오가노이드 시스템의 유지 관리를 설명합니다. 우리는 예를 들어 다운 증후군을 앓고 있는 사람들과 같이 임상 시험에서 잘 나타나지 않는 특수 인구 집단을 모델링하기 위해 미시 생리학적 시스템을 개발하는 데 관심이 있습니다. 우리 연구실은 또한 위암 및 폐암 전반에 걸쳐 새로운 환경에 새로운 면역 항암학 기반 치료 접근법을 도입하기 위해 노력하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 프로토콜은 면역염색에 의한 세포 접착, 오가노이드 형태 및 유전자 발현을 위한 생체 기능성 자기 조립 펩타이드를 평가하는 것을 목표로 합니다. 우리는 결장직장암 세포주를 사용하여 집중적인 테스트를 위한 오가노이드를 얻는 비용 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

초단파 자기조립 펩타이드 매트릭스에서 SW1222 세포주의 대장암 오가노이드 제조 및 특성화

이 프로토콜은 통제된 3차원 배양 시스템에서 유선의 형태형성의 주요 특징을 재현하는 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법을 설명합니다.

유방 형태 형성을 재현하는 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

배우세요 줄기세포 기술과 오가노이드를 활용한 약물-질병 상호작용 연구 방법입니다. 무혈청 하이드로겔 시스템에서 장 오가노이드를 생성하고 유지하는 최적화 프로토콜을 통해 생리적 충실도를 높이는 첨단 인체외 모델을 탐색하세요.

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

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