Name: 살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 Trypanosoma brucei 당염색체의 pH 변화 측정 방법을. pH 감응 바이오센서와 유세포 분석을 활용하여 살아있는 기생충의 영양소 반응을 실시간으로 모니터링하고 대사 조절 메커니즘을 규명합니다.

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pHluorin2-PTS1은 고-카피 클로닝 벡터에서 작제물을 제공한 Twist Bioscience에 의해 pLEW100v5로 클로닝되었습니다. pLEW100v5는 조지 크로스 박사의 선물이었습니다. T. brucei aldolase에 대해 제기된 항혈청은 요청 시 Clemson University의 Meredith T. Morris 박사로부터 구할 수 있습니다. JCM과 KAC 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01AI156382)의 상에 의해 부분적으로 지원되었습니다. SSP는 NIH 3R01AI156382에 의해 지원되었습니다.

트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 글리코솜 pH를 위한 pHluorin2 기반 센서 개발

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

아프리카 트리파노솜의 환경 인식과 반응 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 영양소 가용성의 변화는 글리코솜의 산성화를 포함하여 기생충의 다양한 반응을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 유전성 단백질 센서, pHluorin2 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포의 환경 섭동에 대한 글리코솜 pH 반응을 연구하는 방법을 설명했습니다.
센서 사용에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 전이유전자를 발현하는 형질주입된 기생충의 특성 분석이 중요한데, 이는 발현에 세포 간 변이가 있을 수 있기 때문입니다. 일부 전이유전자의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 떨어질 수 있습니다. 현재까지 pHluorin2 함유 세포에서는 관찰되지 않았지만 센서 반응성이 매우 가변적인 경우(예: 유도 후 센서 신호가 견고하지 않은 경우) 집단의 일부 구성원이 다른 구성원보다 더 높은 수준에서 단백질을 발현할 수 있으므로 배양을 복제해야 할 수 있습니다. 대안적으로, 재형질전환 및 선택은 ...

대부분의 살아있는 유기체와 마찬가지로 기생 키네토플라스티드는 중앙 탄소 대사의 기본 구성 요소로 포도당에 의존합니다. 이 그룹에는 아프리카 트리파노솜, Trypanosoma brucei와 같은 의학적으로 중요한 유기체가 포함됩니다.미국 트리파노솜, T. cruzi; 그리고 Leishmania 속의 기생충. 포도당 대사는 병원성 수명 주기 단계에서 기생충 성장에 매우 중요합니다. 예를 들어, 포도당이 결핍되면 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태(BSF)가 빠르게 죽습니다. 특히, 해당과정(glycolysis)은 이 감염 단계에서 ATP의 유일한 공급원 역할을 한다1. 리슈마니아 기생충도 마찬가지로 인간 숙주의 포도당에 의존하며, 숙주 대식세포에 상주하는 아마스티고테 수명 주기 단계는 성장을 위해 이 탄소원에 의존한다2.
이 기생충은 다양한 곤충 매개체와 관련된 독특한 생활 방식을 가지고 있지만 포도당에 반응하고 섭취하는 방식에서 많은 공통점을 공유합니다. 예를 들어, 이러한 기생충은 대부분의 해당작용 효소를 글리코솜이라고 하는 변형된 과산화소체로 국소화합니다. 이 키네토플라스티드 특이적 세포소기관은 보존된 생합성 메커니즘 및 형태 3,4,5,6을 기반으로 하는 포유류 과산화소체와 관련이 있습니다.
대부분의 해당과정 효소를 당염색체로 구획화하면 기생충 특이적 경로 조절 수단이 제공됩니다. 화학적 pH 프로브를 사용하여 영양 결핍이 프로사이클릭 형태(PF) 기생충 글리코좀의 급격한 산성화를 유발하여 주요 해당효소 헥소키나제 7,8에 대한 알로스테릭 조절자 결합 부위의 노출을 통해 해당효소 활성을 변화시킨다는 것을 확인했습니다. 이전 연구에서 화학 프로브는 사용을 위해 지속적인 전달이 필요했기 때문에 다른 응용 분야에서의 유용성이 제한되었습니다. 또한 BSF의 당체에서 프로브 분포를 유지하는 데 어려움이 있어 해당 수명 단계에서 당체 pH를 조사하기 위한 접근 방식의 유용성이 제한되었습니다.
이 연구에서는 형광 단백질 바이오센서 pHluorin2를 사용하여 포도당 결핍을 포함한 환경적 단서에 대한 반응으로 BSF T. brucei 의 당염색체 pH 변화를 모니터링했습니다9 (그림 1). 이 연구의 결과는 BSF T. brucei 가 PF 기생충에서 관찰된 반응과 유사한 가역적 방식으로 기아에 대한 반응으로 글리코솜을 빠르게 산성화한다는 것을 시사합니다. 우리는 이 바이오센서가 T. brucei 및 관련 기생충의 해당작용 조절에 대한 이해를 향상시킬 것으로 기대합니다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 조직 배양 플라스크 (미처리, 멸균)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크 (비처리, 멸균)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &micro; L 평면 바닥 384웰 플레이트</td><td>BrandTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa 인간 T 세포 핵세포&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>FlowJo 소프트웨어</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, 플랫 바닥 플레이트</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 플러그인, ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 유세포 분석기</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경 과학 16% 파라포름알데히드 수용액, EM 등급, 10mL 앰플</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>Nigericin(나트륨염)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>단종 제품</td><td></td></tr><tr><td>OP2 Liquid Handler</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O</td><td>Sigma Life Science</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>HTS 분석용 피펫팅 로봇</td></tr><tr><td>Thiazole Red (TO-PRO-3)</td><td>biotium</td><td>#40087</td><td>우리는 이 브랜드의 플레이트를 감지하고 CytKick Max Auto에서 사용할 수 있도록 맞춤형 아크릴 플레이트 스탠드를 가공했습니다. 샘플러</td></tr><tr><td>valinomycin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>HTS 분석용 피펫팅 로봇</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>pH 교정용</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>pH 교정용</td></tr></tbody></table>

살아있는 트리파노소마 브루세이(trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 ph 변화 측정

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

포도당 대사는 아프리카 트리파노솜인 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에 중요한 역할을 하며, 이는 기생충 발달의 필수 대사 과정이자 조절자입니다. 환경 포도당 수치가 변할 때 생성되는 세포 반응에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 혈류와 순환 형태(곤충 단계) 기생충 모두에서 글리코솜은 해당과정의 대부분을 수용합니다. 이러한 세포 기관은 포도당 결핍에 대한 반응으로 빠르게 산성화되며, 이는 헥소키나아제(hexokinase)와 같은 해당효소(glycolytic enzyme)의 알로스테릭 조절(allosteric regulation)을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 pH 측정에 사용되는 화학 프로브의 위치를 파악하는 것이 어려웠기 때문에 다른 Application에서의 유용성이 제한되었습니다.
이 논문은 유전성 단백질 pH 바이오센서인 글리코솜 국소화 pHluorin2를 발현하는 기생충의 개발 및 사용에 대해 설명합니다. pHluorin2는 395nm에서 pH(산)에 따른 여기(excitation) 감소를 나타내는 동시에 475nm에서 여기(excitation)를 증가시키는 비율계량 pHluorin 변형체입니다. 형질전환 기생충은 pHluorin2 open reading frame을 트리파노솜 발현 벡터 pLEW100v5로 클로닝하여 생성되었으며, 두 수명 주기 단계에서 유도 가능한 단백질 발현을 가능하게 했습니다. 면역형광을 사용하여 pHluorin2 바이오센서의 글리코솜 국소화를 확인하고, 바이오센서의 국소화를 글리코솜 상주 단백질 알돌라아제와 비교하였다. 센서 응답성은 pH 4에서 8 사이의 일련의 완충액에서 세포를 배양하여 다양한 pH 수준에서 보정되었으며, 이는 이전에 플루오레세인 기반 pH 센서를 보정하는 데 사용한 접근 방식입니다. 그런 다음 글리코솜 pH를 측정하기 위해 유세포 분석을 사용하여 405nm 및 488nm에서 pHluorin2 형광을 측정했습니다. 우리는 PF 기생충에서 글리코솜 산성화의 알려진 원인인 포도당 결핍에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 pH를 모니터링하여 살아있는 형질전환 pHluorin2 발현 기생충의 성능을 검증했습니다. 이 도구는 고처리량 약물 스크리닝에 잠재적으로 사용되는 것을 포함하여 다양한 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 글리코솜 pH 외에도 센서를 다른 소기관에 적용하거나 다른 트리파노소마티드에 사용하여 살아있는 세포 환경에서 pH 역학을 이해할 수 있습니다.

BSF T. brucei의 당체에 대한 pHLuorin2-PTS1 국소화 pHluorin2-PTS1의 세포 내 국소화를 평가하기 위해 기생충을 면역형광 분석으로 실시했습니다. 글리코솜 상주 단백질인 알돌라아제(TbAldolase)에 대해 제기된 항혈청과 함께 국소화된 전이유전자의 신호(그림 2A). 항-TbAldolase와 pHluorin2-PTS1 사이의 평균 Pearson's colocalization 상관계수는 0.895였으며, 이는 pHluorin2-PTS1이 주로 글리코솜에 국한되었음을 나타냅니다. pHluorin2-PTS1이 글리코솜에 국한되어 BF 글리코솜 pH를 조사했습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/662...

우리는 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태의 글리코솜에서 pH가 환경 신호에 어떻게 반응하는지 연구하는 방법을 설명합니다. 이 접근법에는 pH 민감성 유전성 단백질 센서와 유세포 분석이 결합되어 시간 경과 분석 및 고처리량 스크리닝 형식으로 pH 역학을 측정하는 것이 포함됩니다.

살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

포도당 대사는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에 매우 중요하지만, 세포가 환경의 포도당 수치 변화를 어떻게 감지하고 반응하는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 우리는 살아있는 기생충의 당염색체 pH를 모니터링할 수 있는 pH 바이오센서를 발현하는 기생충을 개발했으며, 이는 영양소 변동에 대한 기생충의 동적 반응을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 실험의 과제는 마이크로타이터 플레이트 리더가 장착된 유세포 분석기와 바이오센서 형광을 측정하기 위한 적절한 필터 세트를 사용할 수 있다는 것입니다.또한 T.brucei는 위험군 2 유기체이므로 세포분석기는 생물안전 2등급 시설에 보관해야 합니다. 글리코솜의 pH 수준은 헥소키나아제와 포스포프룩토키나아제가 pH에 민감하기 때문에 해당과정에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 그러나 이전에 사용된 pH 프로브는 혈류 형태의 당(glycosome)을 정확하게 표적으로 삼지 않았습니다.이 기생충 생활 단계에서 글리코솜 pH와 해당과정 사이의 관계를 연구하기 위해서는 더 나은 도구가 필요했습니다. pHluorin2-PTS1 센서는 이 수명 단계에서 화학적 pH 프로브보다 당체에 대한 국소화가 더 뛰어난 도구입니다. 하룻밤 사이에 pH 센서의 발현을 유도하기만 하면 세포가 pHluorin2를 만들어 당염색체에 국한시키기 때문에 사용자 친화적입니다.유세포 분석을 사용하여 pHluorin2를 측정하면 현미경 검사에 비해 처리량이 증가하고 통계적 측정이 개선됩니다.

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

아프리카 트리파노좀의 글리코솜 역학은 전자 및 형광 현미경과 같은 전통적인 세포 생물학 기술로는 연구하기 어렵습니다.  동적 소기관 거동을 관찰하는 수단으로, 형광 소기관 리포터 시스템이 유세포 분석법과 함께 사용되어 살아있는 기생충의 실시간 배당체 역학을 모니터링했습니다.

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

이 원고는 말기 감염을 추적하기 위해 아프리카 트리파노좀의 생물 발광 균주를 사용하는 방법을 설명하고 in vivo 라이브 이미징을 사용하여 중추 신경계 내의 감염을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

단백질에 태그를 추가하는 것은 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻는 강력한 방법입니다. 여기에서는 게놈 규모 태깅이 가능하도록 수백 개의 Trypanosoma brucei 단백질을 병렬로 내인성으로 라벨링하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

in vitro에서 성장한 아프리카 트리파노좀은 낮은 비율로 항원 변이를 겪으며, 개체군은 우성 변이 표면 당단백질(VSG) 유형을 발현하는 기생충과 "전환된" 변이체의 작은 집단으로 구성됩니다.  이 프로토콜은 이러한 개체군을 검출하고 정량화하는 빠른 방법을 설명합니다.

검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

우리는 Chagas 질병의 원인 인자 인 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 β-galactosidase 활성을 측정하는 고처리량 비색 분석을 설명합니다. 이 분석은 트립파노시달 화합물을 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

Telomeres는 염색체의 안정성을 위해 필수이며 telomere G - 오버행 구조는 telomerase - 중재 telomere의 유지 보수를 위해 필수적입니다. 우리는 최근 telomere G - 오버행 구조의 검출을위한 두 가지 방법을...

Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei</em

이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중...

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를...

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

배우세요 Trypanosoma brucei 당염색체의 pH 변화 측정 방법을. pH 감응 바이오센서와 유세포 분석을 활용하여 살아있는 기생충의 영양소 반응을 실시간으로 모니터링하고 대사 조절 메커니즘을 규명합니다.

살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정

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