Name: Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 단일입자 전자극저온현미경을 활용하여 고분자 복합체의 리간드를 모델링하는 방법을. 이 기술은 막단백질 구조 분석과 신약 개발 연구에 필수적인 고해상도 구조 정보를 제공합니다.

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SJ는 DAE-TIFR로부터 박사 과정 학생을 받았으며 자금 지원이 인정됩니다. KRV는 DBT B-Life 보조금 DBT/PR12422/MED/31/287/2014 및 프로젝트 식별 번호에 따라 인도 정부 원자력부의 지원을 인정합니다. RTI4006.

저분자 리간드(Small Molecule Ligands)의 CryoEM 맵 모델링

저자는 밝힐 것이 없습니다.

현미경 하드웨어 및 소프트웨어의 개선으로 최근 몇 년 동안 CryoEM 구조의 수가 증가했습니다. 단일 입자 cryoEM에서 현재 달성된 최고 분해능은 1.2 Å 57,58,59이지만 대부분의 구조는 약 3-4 Å 분해능으로 결정되고 있습니다. 중해상도에서 저해상도 맵의 리간드를 모델링하는 것은 까다로울 수 있으며 종종 모호성이 발생할 수 있습니다. 중개 연구 및 약물 발견을 위해 학계와 제약 산업 모두에서 CryoEM이 널리 사용됨에 따라 리간드가 모호성 없이 올바르게 모델링되도록 하는 것이 필수적입니다. 따라서 Q-점수60을 계산하여 리간드 원자의 분해 가능성을 정량화하는 것이 현명하며, 이는 현재 EMDB에서 맵의 품질과 모델의 적합성을 평가하기 위한 메트릭으로 사용할 수 있으며 Chimera에서도 사용할 수 있습니다.
첫 번째 예에서 ChimeraX는 M. tuberculosis enolase 효소의 apo와 리간드 결합 맵 사이의 실제 공간에서의 차이 맵을 계산하는 데 사용되었습니다. 높은 임계값에서의 추가 밀도는 활성 부위에 리간드인 phosphoenolpyruvate가 존재하고 리간드에 결합된 Mg2+가 있음을 시사합니다. 이 경우 맵은 중간 해상도(3.2 Å)이며 물 분자는 자신 있게 모델링할 수 없다는 점에 유의해야 합니다(그림 1). 이 방법과 관련된 제한 사항은 리간드 결합이 단백질에서 중요한 구조적 변화를 유도하지 않는 경우에만 적용될 수 있다는 것입니다. 이 경우 apo 및 리간드 바운드 데이터 세트가 모두 동일한 픽셀 크기로 획득되고 Relion에서 동일한 매개변수로 처리되었기 때문에 맵 정규화가 수행되지 않았습니다. 그러나 Relion 46,47 및 CryoSparc61과 같은 다른 재구성 프로그램에 의해 생성된 지도 또는 다른 품질로 생성된 지도를 비교할 때 의미 있는 비교를 하기 전에 지도의 정규화가 필수적이라는 점에 유의할 가치가 있습니다.
다음 예는 mGlu5이며, 이는 cryoEM 구조51,62에서 알 수 있듯이 작용제 결합 시 큰 분자 재구성을 겪습니다(그림 2). 이 시나리오에서는 unbound(apo)와 ligand-bound receptor 간의 상당한 차이로 인해 간단한 difference map을 계산할 수 없습니다. 여기에서는 역수 공간에서의 미세 조정을 위한 입력으로 선명하지 않고 가중치가 없는 하프맵을 사용하고 이후 실험 맵과 모델에서 파생된 맵 간의 차이 맵을 계산하는 Servalcat이 활용되었습니다. 높은 임계값에서는 차이점을 시각화하고 모델의 수정 및 개선을 위한 가이드 역할을 할 수 있습니다. 세포외 및 mGlu5의 막관통 도메인 근처에서 모델링되지 않은 여러 블롭이 관찰되어 리간드 모델링을 위한 가이드로 사용되었습니다(그림 2).
세 번째 예는 분해능(2.3 Å)이 β-갈락토시다아제에서 단편 크기 억제제의 지도 해석 및 모델링에서 어떻게 중요한 역할을 하는지 보여줍니다. 여기서 과제는 데이터에 내재된 노이즈 속에서 Servalcat 차이 맵에서 매우 작은 리간드(<200 Da)를 식별하고 정확하게 모델링하는 것이었습니다. 푸리에 쉘 상관관계(FSC)를 사용하여 측정된 높은 전체 분해능 외에도 리간드에 특이적인 국소 분해능도 리간드의 키랄 중심을 정확하게 배치할 수 있을 만큼 충분히 높았습니다(그림 3). 용매 분자에 대한 밀도는 효소 전체와 특히 리간드를 둘러싼 차이 맵에서 관찰되었습니다. 리간드와 용매 원자 모델링에 대한 분리능의 효과도 입증되었습니다(그림 4). 물 또는 용매 분자를 모델링할 때 주의하는 것이 중요한데, 때때로 낮은 임계값에서의 노이즈가 물 또는 용매 분자와 유사하여 잠재적인 오해로 이어질 수 있기 때문입니다.
또 다른 중요한 고려 사항은 CryoEM 맵만으로는 금속 이온을 정확하게 식별하기에 충분하지 않을 수 있다는 것입니다. 금속 이온의 존재와 정체를 확인하기 위해 EXAFS(Extended X-ray Absorption Fine Structure) 또는 EDX(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy)와 같은 추가적인 생물물리학적 방법이 필요한 경우가 많습니다. 에놀라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 모두에서 Mg2+ 는 이러한 단백질에 대해 이미 사용 가능한 풍부한 정보로 인해 모델링되어 금속 이온의 정체성을 확인했습니다. 또한, 고전적인 팔면체 기하학적 구조와 Mg2+의 거의 이상적인 배위 거리로 예시된 이러한 경우 금속 이온의 배위는 이들의 정체에 대한 실질적인 증거를 제공했습니다.
일반적으로 CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 동안 몇 가지 중요한 고려 사항을 고려해야 합니다. 우선, 리간드 식별 및 모델링을 위한 올바른 맵을 선택하는 것이 중요합니다. 모든 경우에, 리간드 밀도를 시각화하기 위해 선명하게 작성되지 않고 가중치가 부여되지 않은 맵 또는 하프 맵을 사용하는 것이 좋으며, 이는 선명화 및 가중치로 인해 맵에서 덜 선명하거나 과도하게 선명하게 된 (시리즈 종료로 인한 노이즈) 영역이 발생할 수 있기 때문입니다. 이로 인해 최적이 아닌 리간드 밀도가 발생할 수 있으며 Coot에서 모델을 구축하는 동안 밀도를 평가하기 위해 다른 B 인자 샤프닝을 사용할 수 있습니다. CryoEM 맵에서 리간드를 식별하기 위해 선명하게 된 맵을 사용하는 데는 위험이 있지만, 선명하지 않은 맵은 리간드 밀도의 전체 세부 정보를 보여주지 않을 수 있지만 그림 1B, C와 같이 시연 목적으로 사용할 수 있습니다.
모델링된 리간드의 자세는 특히 데이터가 약한 경우에 검증해야 합니다. mGlu5에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 국소 분리능은 CryoEM 맵에 따라 다르며 리간드의 편향되지 않은 모델링이 어려울 수 있습니다. Servalcat은 단백질 및 리간드 모델링에서 잠재적인 부정확성을 감지하기 위한 유용한 도구로 사용할 수 있습니다22.
조성 이질성은 특정 집단만이 리간드를 가질 수 있는 단백질-리간드 복합체에 존재할 수 있습니다(리간드의 분자량이 낮은 경우 분류 단계에서 이질성이 제거되지 않을 수 있음). 그럼에도 불구하고 리간드 모델링 전에 이미지 처리 중에 3D 분류63 단계를 반복적으로 수행하고 리간드의 밀도가 향상되는지 확인하는 것이 중요합니다. 단백질의 여러 복사본이 존재하는 경우, 초기 모델 생성 및 정제 중에 맵 전체에 대칭을 적용할 때 주의를 기울여야 하며, 이는 모든 대칭 관련 분자의 리간드 밀도를 평균화할 수 있습니다. 대칭성은 모든 단백질 사슬에서 리간드 밀도의 존재를 확인하기 위해 맵을 철저히 검사한 후에만 적용해야 합니다.
상태(결정 또는 용액)와 위치(매립 또는 표면)에 따라 원자는 동적일 수 있으며 모델 미세화에서는 이를 원자 변위 매개변수(ADP)라고 합니다. 모델에서 가능한 부정확성에 대한 시각적 단서를 제공하는 차이 맵과 함께 ADP 값을 사용하여 64,65,66,67 정제 후 리간드의 정확도를 평가할 수 있습니다. 일반적으로 리간드는 주변 잔기와 유사한 ADP 값을 가져야 합니다(즉, 안정적으로 결합되고 정확하게 모델링되는 경우). 그러나 거대분자에서 멀리 떨어진 리간드의 주변부 또는 리간드 원자(예: 지질)는 더 높은 ADP 값을 가질 수 있습니다. 좌표를 미세 화하는 것 외에도 Refmac33,34와 Phoenix 모두 ADP 값28,68을 미세 조정할 수 있습니다. Refmac에서 Mott-Bethe 근사는 맵 계산 중에 개별 원자의 전자 산란 계수를 계산하는 데 사용됩니다. Phoenix 최신 버전에서는 원자 무질서를 설명하기 위해 결정학과 유사한 개별 B-factor 미세화가 도입되었습니다. 매우 자주, cryoEM에서 파생된 정제된 모델에서는 광범위한 ADP 값(때로는 0에 가까운 값)이 관찰되며, 맵과 모델의 적합성을 평가하기 위해 EMDB에서 사용되는 Q-점수조차도 증착된 기본 맵과 B-팩터 샤프닝(60)의 특성에 따라 달라집니다. cryoEM 모델 구축에서는 여러 맵이 자주 사용되며, 따라서 많은 거대분자의 이방성 분해능으로 인해 하나의 맵만으로는 모든 세부 사항을 설명하기에 충분하지 않을 수 있으므로 모델링 및 개선에 사용되는 맵을 방법에서 명확하게 언급해야 합니다. 
거대분자의 리간드 모델링에서 CryoEM 맵(예: 결정학)의 주요 한계 중 하나는 리간드 결합 부위의 해상도가 낮거나 결합된 리간드가 동적인 경우 올바른 형태를 확인하기 어려울 수 있다는 것입니다. 또한 대부분의 CryoEM 구조는 분해능이 3Å 미만이고 맵에서 물 분자의 표현이 제한되어 리간드 또는 약물 결합에서 수화의 역할을 평가하기 어렵습니다(여기에 에놀라아제 및 mGluR의 예가 표시됨). 계산 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위해 CryoEM 데이터와 함께 사용할 수 있습니다69. 결정학(crystallography)과 달리, 맵이 아닌 모델만 미세 조정됩니다. 현재 리간드의 존재를 표시하거나 정확한 모델링을 보장하는 유일한 방법은 생략 맵을 생성하는 것입니다(Servalcat과 같은 도구 사용). 따라서 연구자가 모델을 구축하고 평가하는 데 도움이 되는 여러 도구가 있지만, 가까운 장래에 새로운 접근 방식이나 현재 접근 방식의 수정을 기대할 수 있는 모델 개선 영역이 여러 개 있습니다.
이 기사에서는 리간드 밀도의 수동 검사, 리간드 기하학 파일 생성, CryoEM 맵에서 리간드 모델링을 포함하는 리간드 모델링을 위한 현재 접근 방식에 중점을 두었습니다. 이 시기는 구조 생물학 및 약물 발견에 있어 흥미로운 시기로, 프레임 속도가 더 빠른 직접 전자 검출기와 더 빠른 데이터 수집(70 )을 통해 비교적 짧은 시간에 종종 소분자 리간드로 결합된 여러 거대분자의 고해상도 지도(<2.8 Å)를 얻을 수 있게 되었습니다. 최근 도입된 Schrodinger 제품군의 GEMspot69 및 Rosetta 제품군의 EMERALD17 과 같은 자동화된 리간드 모델링 도구는 실험용 cryoEM 데이터를 고려하면서 리간드의 가장 가능성 있는 결합 자세를 찾으려고 시도하며, 이 프로세스를 간소화하고 자동화할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. X선 결정학과 유사하게, cryoEM으로 저분자 리간드의 결합 모드를 식별하는 것이 하루에 두 개 이상 가능할 것으로 예상됩니다.

세포는 무수한 화학 반응을 동시에 독립적으로 수행함으로써 기능을 수행하며, 각 화학 반응은 환경 신호에 대한 반응으로 생존과 적응성을 보장하기 위해 세심하게 조절됩니다. 이는 생체 분자, 특히 단백질이 다른 거대분자 및 소분자 또는 리간드와 함께 일시적이거나 안정적인 복합체를 형성할 수 있도록 하는 분자 인식에 의해 달성됩니다1. 따라서 단백질-리간드 상호 작용은 단백질 발현 및 활성의 조절, 효소에 의한 기질 및 보조 인자의 인식, 세포가 신호를 인식하고 전달하는 방법을 포함하는 생물학의 모든 과정에 기본이 됩니다 1,2. 단백질-리간드 복합체의 동역학적, 열역학적, 구조적 특성을 더 잘 이해하면 리간드 상호작용의 분자적 기초를 밝히고 약물 상호작용 및 특이성을 최적화하여 합리적인 약물 설계를 촉진할 수 있습니다. 단백질-리간드 상호 작용을 연구하는 경제적이고 빠른 접근 방식은 다양한 범위의 작은 분자를 가상으로 스크리닝하고 이러한 리간드의 결합 모드와 친화도를 예측하여 표적 단백질에 대한 친화도를 예측하는 계산 방법인 분자 도킹을 사용하는 것입니다3. 그러나 X선 회절(XRD), 핵 자기 공명(NMR) 또는 전자 초저온 현미경(cryoEM)으로 측정된 고해상도 구조의 실험적 증거는 이러한 예측에 대한 필수 증거를 제공하고 주어진 표적에 대한 새롭고 더 효과적인 활성제 또는 억제제의 개발을 지원합니다. 이 기사에서는 일반적으로 언급되는 기술인 'cryoEM'이라는 약어를 사용합니다. 그러나 올바른 명명법을 선택하는 것에 대한 논쟁이 진행 중이며, 최근에는 샘플이 극저온 온도에 있고 전자로 이미징되었음을 나타내기 위해 cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)라는 용어가 제안되었습니다4. 마찬가지로 CryoEM에서 파생된 맵은 전자 전위, 정전기 전위 또는 쿨롱 전위라고 하며 단순화를 위해 여기서는 CryoEM 맵 5,6,7,8,9,10을 사용합니다.
XRD는 단백질-리간드 복합체의 고분해능 구조 측정에서 황금 표준 기술이었지만, 지난 몇 년 동안 전자 현미경 데이터베이스(EMDB)12,13에 기탁된 쿨롱 전위 맵 또는 cryoEM 맵의 급증에서 알 수 있듯이 분해능 혁명이후 11 cryoEM이 추진력을 얻었습니다 14. 시료 전처리, 이미징 및 데이터 처리 방법의 발전으로 인해 2010년에서 2020년 사이에 CryoEM을 사용하는 PDB(Protein Data Bank)14 증착의 수가 0.7%에서 17%로 증가했으며, 2020년에 보고된 구조의 약 50%가 3.5 Å 해상도 또는 그 이상의 해상도에서 측정되었습니다15,16. CryoEM은 유연하고 비결정성 생물학적 거대분자, 특히 막 단백질 및 다중 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 연구할 수 있게 해주어 결정화 과정을 극복하고 XRD에 의한 고해상도 구조 측정에 필요한 회절이 잘 되는 결정을 얻을 수 있기 때문에 제약 산업을 포함한 구조 생물학 커뮤니티에서 빠르게 채택되고 있습니다.
CryoEM 맵에서 리간드를 정확하게 모델링하는 것은 분자 수준에서 단백질-리간드 복합체의 청사진 역할을 하기 때문에 매우 중요합니다. 리간드를 전자 밀도17,18,19,20에 맞추거나 구축하기 위해 리간드 밀도의 모양과 토폴로지에 의존하는 X선 결정학에 사용되는 몇 가지 자동화된 리간드 구축 도구가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 해상도가 3 Å보다 낮으면, 이러한 접근법은 인식 및 구축을 위해 의존하는 위상학적 특징이 덜 정의되기 때문에 바람직하지 않은 결과를 생성하는 경향이 있습니다. 많은 경우에, 이러한 방법은 리간드를 CryoEM 맵으로 정확하게 모델링하는 데 효과적이지 않은 것으로 입증되었는데, 이는 이러한 맵이 일반적으로 3.5 Å-5 Å17 사이의 중저 분해능 범위에서 결정되었기 때문입니다.
CryoEM에 의한 단백질-리간드 복합체의 3D 구조 측정의 첫 번째 단계는 리간드를 단백질과 함께 공동 정제하거나(리간드가 단백질에 대한 결합 친화도가 높은 경우) 그리드 준비 전에 특정 기간 동안 단백질 용액을 리간드로 배양하는 것입니다. 그 후, 소량의 시료를 플라즈마로 세척된 구멍이 있는 TEM 그리드에 배치한 다음 액체 에탄에서 급속 동결하고 최종적으로 cryo-TEM으로 이미징합니다. 수십만 개에서 수백만 개의 개별 입자에서 얻은 2D 투영 이미지를 평균화하여 거대분자의 3차원(3D) 쿨롱 전위 맵을 재구성합니다. 이러한 맵에서 리간드와 용매 분자를 식별하고 모델링하는 것은 맵 전체의 이방성 분해능(즉, 분리능이 거대분자 전체에서 균일하지 않음), 리간드가 결합된 영역의 유연성 및 데이터의 노이즈로 인해 많은 경우에 심각한 문제를 제기합니다. XRD를 위해 개발된 많은 모델링, 개선 및 시각화 도구는 현재 동일한 목적으로 CryoEM에서 사용하도록 조정되고 있습니다 18,19,20,21. 이 기사에서는 현재 리간드를 식별하고, 모델을 구축하고, CryoEM에서 파생된 좌표를 미세 조정하는 데 사용되는 다양한 방법과 소프트웨어에 대한 개요를 제공합니다. 다양한 해상도와 복잡성을 가진 특정 단백질-리간드 복합체를 사용하여 리간드를 모델링하는 데 관련된 프로세스를 설명하기 위해 단계별 프로토콜이 제공되었습니다.
CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 첫 번째 단계에는 맵에서 리간드 밀도(비단백질)를 식별하는 것이 포함됩니다. 리간드 결합이 단백질의 구조적 변화를 유발하지 않는 경우, 단백질-리간드 복합체와 apo-단백질 사이의 간단한 차이 맵을 계산하면 기본적으로 추가 밀도 영역이 강조되어 리간드의 존재를 암시합니다. 이러한 차이는 두 개의 맵만 필요하기 때문에 즉시 관찰할 수 있으며, 3D 정제 과정에서 중간 맵도 사용하여 리간드가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 분해능이 충분히 높으면(<3.0 Å) 차이 맵은 물 분자의 위치뿐만 아니라 리간드 및 단백질 잔류물과 상호 작용하는 이온에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다.
apo-protein map이 없는 경우, 이제 독립형 도구로 사용할 수 있고 Refmac 개선의 일부로 CCP-EM 소프트웨어 제품군23,24에 통합되었으며 CCP4 8.0 릴리스 25,26에서도 Servalcat22를 사용할 수 있습니다. Servalcat을 사용하면 날카롭지 않은 half-map과 apoprotein 모델을 입력으로 사용하여 FSC 가중 차이(Fo-Fc) 맵을 계산할 수 있습니다. Fo-Fc 생략 맵은 실험 맵(Fo)과 모델에서 파생된 맵(Fc) 간의 차이를 나타냅니다. 모델에 리간드가 없는 경우, 실험적 EM 맵과 겹치는 Fo-Fc 맵의 양성 밀도는 일반적으로 리간드의 존재를 암시합니다. 여기서 가정은 단백질 사슬이 맵에 잘 맞고 나머지 양의 밀도가 리간드의 위치를 나타낸다는 것입니다. 그러나 양의 밀도가 단백질 곁사슬의 잘못된 로타머와 같은 모델링 부정확성에서 비롯된 것인지 여부를 꼼꼼하게 조사하는 것이 중요합니다.
두 번째 단계는 사용 가능한 화학 정보에서 잘 정의된 형상을 가진 리간드의 데카르트 좌표 파일을 얻거나 만드는 것입니다. CCP4 단량체 라이브러리에서 이미 사용할 수 있는 표준 리간드(예: ATP 및 NADP+)는 단량체 접근 코드를 통해 좌표 및 형상 파일을 검색하여 미세화에 사용할 수 있습니다. 그러나 알려지지 않았거나 비표준 리간드의 경우 다양한 도구를 사용하여 형상 파일을 생성할 수 있습니다. 일부 예로는 Phenix28의 eLBOW27 - (전자 리간드 빌더 및 최적화 워크벤치), Lidia - Coot29의 내장 도구, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Schrodinger 제품군 내 Glide의 Ligprep32-a 모듈이 있습니다. 그런 다음 리간드 좌표 파일은 실험용 cryoEM 맵과 Coot의 차이 맵에 의해 안내되는 밀도에 맞춰집니다. 그 다음에는 Phoenix28의 실제 공간 미세 조정 또는 Refmac33의 상호 미세 조정이 이어집니다. 좋은 그래픽 카드와 위에서 언급한 소프트웨어가 장착된 Linux 워크스테이션 또는 랩톱이 필요합니다. 이러한 프로그램의 대부분은 다양한 제품군에 포함되어 있습니다. CCP-EM24 및 Phoenix28은 교육용 사용자가 무료로 사용할 수 있으며 Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine 등 이 기사에서 사용되는 다양한 도구가 포함되어 있습니다. 마찬가지로 Chimera37 및 ChimeraX38은 교육용 사용자에게 무료 라이선스를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>여러 기관의 컨소시엄</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>학술 사용자에게 무료이며 Coot 및 X-ray 결정학을 위해 개발된 도구 목록을 포함합니다</td></tr>. <tr><td>CCP-EM</td><td>컨소시엄은 여러 기관의</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>학계 사용자에게 무료이며 Coot, Relion 및 기타 많은 Coot를 포함합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>모델 구축을 위한 일반 소프트웨어이지만 위에서 설명한 다른 제품군에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>여러 연구소의 컨소시엄</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>모델을 cryoEM 맵에 도킹하기 위한 Phoenix 제품군 내부의 소프트웨어</td></tr><tr><td>전자 현미경 데이터 뱅크&nbsp;</td><td>여러 기관의 컨소시엄</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Public Repository for Electron Microscopy maps</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>광고, Thermo Fisher의 카메라&nbsp;</td></tr><tr><td>피닉스&nbsp;</td><td>여러 기관의 컨소시엄</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>학계 사용자에게 무료이며 여러 기관의 Coot</td></tr><tr><td>Protein Data Bank</td><td>컨소시엄</td><td>https://rcsb.org</td><td>거대 분자 구조의 공개 데이터베이스</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Molecular viusalization 도구를 포함합니다. 교육용 버전은 무료이지만 제한이 있습니다. 정식 버전은 약간의 비용으로 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>소프트웨어는 cryoEM 이미지 처리용이며, CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>에서도 사용 가능합니다.<td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Thermo Fisher의 상업용, cryoTEM</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>디스플레이, 분석 등을 위한 범용 소프트웨어</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/디스플레이, 분석 등을 위한 범용 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

modeling ligands into maps derived from electron cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

고분자 복합체에서 단백질-리간드 상호 작용을 해독하는 것은 분자 메커니즘, 근본적인 생물학적 과정 및 약물 개발을 이해하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 극저온 시료 전자 현미경(cryoEM)은 거대분자의 구조를 측정하고 원자 분해능에 가까운 리간드 결합 모드를 조사하는 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM 맵에서 비단백질 분자를 식별하고 모델링하는 것은 관심 분자 전체의 이방성 분해능과 데이터에 내재된 노이즈로 인해 종종 어렵습니다. 이 기사에서 독자들은 현재 리간드 식별, 모델 구축 및 선택된 거대분자를 사용한 원자 좌표 미세화에 사용되는 다양한 소프트웨어와 방법을 소개합니다. 에놀라아제 효소로 예시된 바와 같이 리간드의 존재를 식별하는 가장 간단한 방법 중 하나는 리간드가 있는 경우와 없는 상태에서 얻어진 두 개의 맵을 빼는 것입니다. 리간드의 추가 밀도는 더 높은 임계값에서도 차이 맵에서 두드러질 수 있습니다. 대사성 글루타메이트 수용체 mGlu5의 경우에서 볼 수 있듯이 이러한 간단한 차이 맵을 생성할 수 없는 경우가 있습니다. 최근에 도입된 Fo-Fc 생략 맵을 유도하는 방법은 리간드의 존재를 검증하고 입증하기 위한 도구 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 연구된 β-갈락토시다아제를 예로 들어 CryoEM 맵의 리간드 및 용매 분자 모델링에 대한 분리능의 효과를 분석하고 CryoEM이 약물 발견에 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 전망을 제시합니다.

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

우리는 세포 전체, 특히 막 계면에서 발생하는 생리적 과정을 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 Cryo-EM을 주요 기술로 사용하며 여러 고분자 복합체를 연구하는 다양하고 흥미롭고 도전적인 생물학적 문제를 연구합니다. 막 단백질 및 기타 불안정한 복합체의 구조를 결정하는 것은 수십 년 전만 해도 어려운 일이었습니다.그러나 새로운 세제 및 지질 모방제인 Cryo-EM의 기술 발전과 기부금은 이러한 복합체의 신속한 구조 측정을 위한 길을 열었습니다. 이러한 구조는 이제 고해상도로 얻을 수 있으며 잠재적으로 약물 발견에 사용할 수 있습니다. 단일 입자 Cryo-EM에서는 안정적이고 균일한 시료를 획득하고, 얇은 얼음에 무작위 방향으로 시료를 매립하고, 신호 대 노이즈 비율이 낮은 다수의 이미지를 처리하고, 3D 재구성 중 각도 방향 및 분류를 정확하게 결정하는 등의 과제가 있습니다.리간드 단백질 복합체의 Cryo-EM 맵에서 소분자를 식별하고 모델링하는 것은 데이터에 내재된 노이즈와 등방성 및 낮은 맵 해상도, 시료 이질성 및 리간드 유연성으로 인해 까다롭습니다. 이 프로토콜은 중저 분해능의 Cryo-EM에서 리간드 및 용매 분자를 식별하고 모델링하기 위한 단계별 가이드입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

생체 분자 모델링의 핵심 기술은 단백질에 활성 부위를 표시하고 표시하는 것입니다. 이 기술은 매크로 분자 시각화를위한 네 가지 인기있는 무료 프로그램을 사용하여 입증된다 : iCn3D, Jmol, PyMOL, UCSF ChimeraX.

분자 시각화 프리웨어를 사용하여 효소 활성 사이트 모델링

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

이 프로토콜은 알레르겐에서 내인성 지질의 제거를 설명하고, 열 어닐링과 결합 된 역단계 HPLC를 통해 사용자 지정 리간드로 교체. 31 P-NMR 및 원형 이크로이즘은 리간드 제거/로딩의 신속한 확인과 토착 알레르겐 구조의 회복을 허용한다.

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

여기에서는 미세 결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 결정 분말을 준비하기 위해 실험실에서 개발된 절차를 설명합니다.

작은 분자의 미세 결정 전자 회절

배우세요 단일입자 전자극저온현미경을 활용하여 고분자 복합체의 리간드를 모델링하는 방법을. 이 기술은 막단백질 구조 분석과 신약 개발 연구에 필수적인 고해상도 구조 정보를 제공합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

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