선충 Caenorhabditis elegans의 화학주축에서 연관 학습 측정

신경과학에서 가장 흥미로운 질문 중 하나는 학습 기억이 뉴런의 가소성에서 어떻게 나타났는가 하는 점입니다. 가소성과 학습 모두 나이가 들수록 감소합니다. 하지만 왜 이 감소의 원인을 조사하는지는 대체로 불분명합니다.

신경염 엘레간스에서 선충 모델 생물을 이용하는 과정. C. elegans의 거의 모든 행동이 맥락과 경험에 의존하며, 다른 생물과 연관 학습 및 비연상 학습 메커니즘을 공유한다는 점이 명확해졌습니다. 놀랍게도 신경 활동과 인슐린 신호 전달 같은 C. elegans 학습의 핵심 결정 요인들은 뇌와 심지어 전체 유기체의 가려움 조절에도 관여하고 있습니다.

이 기본 기술은 현미경을 통해 분리된 페트리 접시를 연구하는 데 사용됩니다. 또한 추적 소프트웨어가 탑재된 카메라와 맞춤형 행동 챔버를 사용해 궤적 추적과 미세유체 분석을 이용한 칼슘 이미징을 통해 페트리 접시에서 관찰되는 행동의 생리학적 메커니즘을 시각화합니다. 현재 C. elegans 종류 화학주성 검사는 그라디언트 플레이트 또는 사분면 플레이트에서 수행되고 있습니다.

그라디언트 플레이트는 시간이 지남에 따라 변하기 때문에 작업이 까다로울 수 있으며, 쿼드런트 플레이트는 두 가지 다른 염 농도만 비교하는 데 사용되었습니다. 그래서 이번 분석에서 흰색 플레이트를 도입했습니다. 우리는 신경 가소성에 의존하는 학습 능력이 나이가 들수록 왜 감소하는지 이해하고자 합니다.

우리는 화학주성 검사를 사용하여 특정 신호 전달 경로가 이 감소에 책임이 있는지 검증하는 것을 목표로 합니다. 이를 바탕으로 우리는 이 연령 관련 인지 저하를 겨냥한 치료법 개발을 목표로 합니다. 선충 성장을 시작하려면 생 대장균 OP 50을 공급한 중간 오거 플레이트를 사용하세요.

Caenorhabditis elegans N 2를 접시에 넣고 밤새 20도 섭씨에서 거꾸로 보관해 수분 손실을 최소화하세요. 다음 날, 30마리의 젊은 성체 Caenorhabditis elegans를 선충 성장판으로 옮깁니다. 동물들이 약 8시간 동안 섭씨 20도에서 알을 낳도록 허용하세요.

정해진 시간 산란 후에는 모든 성충 벌레를 접시에서 제거하세요. 플레이트를 거꾸로 세워 20도 섭씨에서 3일간 배양합니다. 분석에서는 원하는 조절판 그룹 배치의 절반에 각 플레이트당 200마이크로리터의 OP 50을 시드링합니다.

씨앗이 박힌 판은 씨앗이 없는 판과 함께 인큐베이터에서 20도 온도에서 하룻밤 말리세요. 유리병에 원하는 농도의 1리터 염화나트륨 용액을 준비하세요. 병을 121도 섭씨에서 15분간 오토클레이브하세요.

그 후 병을 55도 섭씨에서 물에 담가 30분간 식히세요. 한편, YP 나무 접시 바닥에 해당 염화나트륨 농도를 표시하고, 벽이 만나는 접시 중심 주위에 5밀리미터 반경의 원을 그립니다. 각 병을 한 번에 하나씩 가열된 자기 교반기에 올려놓으세요.

각 병에 pH 6의 몰 인산칼륨 용액 25밀리리터를 추가하세요. 2분간 충분히 섞습니다. 그 다음 차례로 저으면서 염화칼슘, 콜레스테롤, 황산마그네슘을 첨가합니다.

다음으로, 0밀리몰라 매체를 Y 페트리 접시의 한 칸에 넣어 내부 벽 상단까지 도달시킵니다. 그리고 매체를 약 5분간 굳히세요. 100밀리몰라 매체를 Y 페트리 접시의 두 번째 구획에 분할 배치하여 인접한 고체 제로 밀몰라 구간과 접촉하게 합니다.

그 다음 멸균된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용해 Y자벽을 따라 표면 장력을 깨고 0밀리몰라 염화나트륨 섹션에 연결하세요. 매체를 5분간 굳히세요. 50밀리몰라 매체를 Y 페트리 접시의 남은 구획에 알리코트하여 고체화된 0밀리몰라와 100밀리몰라 구간에 닿게 합니다.

그 다음 멸균된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용해 Y면을 따라 표면 장력을 깨고 50밀리몰라 염화나트륨 섹션을 나머지 두 섹션에 연결하세요. 매체를 5분간 굳힌 후, 플레이트를 20도 섭씨에서 하룻밤 보관합니다. 시작하기 위해 멸균 M 9 완충제 1밀리리터를 Caenorhabditis elegans가 포함된 성장판에 피펫 투여합니다.

플레이트를 부드럽게 휘두르면 OP 50 박테리아 잔디와 오거에서 벌레가 분리되어 현탁 역할을 합니다. 플레이트를 기울여 M 9 버퍼에 웜 현탁액을 모으세요. 상단 부분이 잘린 1밀리리터 플라스틱 피펫 팁을 사용하세요. 현탁을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮기세요.

미세 원심분리기 튜브 바닥에 웜이 약 60초간 머물면서 펠릿을 형성합니다. 그 후 1밀리리터 피펫으로 펠릿을 방해하지 않고 상정액을 제거하세요. 펠릿을 멸균 M 9 완충제 1밀리리터로 두 번 세척하세요.

잔여 OP 50을 제거하기 위해서입니다. 리스는 펠릿을 300마이크로리터의 M 9 버퍼에 부유합니다. 마지막 세탁 후에.

서스펜션을 돌려 웜의 고르게 분포시키고, 약 200에서 300마리의 웜이 포함된 50마이크로리터의 웜 현탁액을 각 조절판에 천천히 옮깁니다. op 50이 시딩된 플레이트의 경우, 벌레 방울을 박테리아 먹이 잔디밭에서 떨어뜨리고 오거에 흡수되도록 하세요. 접시를 인큐베이터에서 20도 온도에서 4시간 동안 거꾸로 보관하세요.

조절 후에는 멸균 M 9인 버퍼 1밀리리터를 조절판에 피펫 주입하고 부드럽게 휘두어 벌레를 제거하여 현탁액을 형성합니다. 그 후 1밀리리터 플라스틱 피펫 팁을 사용해 판을 기울여 웜 현탁액을 수집한 후 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 60초 후, 벌레들은 진정되어 펠릿을 형성합니다.

상청액을 제거한 후, 멸균 M 9 완충액 1밀리리터로 벌레를 두 번 세척합니다. 그 다음 마이크로 원심분리기 튜브에 M 9 버퍼를 1밀리리터까지 채웁니다. 웜 펠릿이 형성되면 펠릿을 방해하지 않고 상청액 960마이크로리터를 제거하세요.

이제 튜브를 부드럽게 돌리거나 흔들어 벌레를 다시 떠올려 주세요. 약 100에서 150개의 웜을 포함한 이 현탁액 20마이크로리터를 분석 플레이트 중앙, y형 벽 세그먼트가 만나는 지점으로 옮깁니다. 벌레들이 20도 섭씨에서 30분간 돌아다니게 하세요.

그 후 검사판의 각 구간에서 벌레 수를 세고 30분 후에 다시 세어보세요. 지정된 공식을 사용하여 시간대별 피판당 화학주성 지수를 계산합니다. 야생형 Caenorhabditis elegans의 행동은 음식 유무와 관계없이 염화나트륨 수치가 다른 접시에서 4시간 조건화에 의해 유의미하게 영향을 받았습니다.

분석판에서 30분 후, 높은 염화나트륨 농도와 음식을 조건한 벌레, 그리고 염화나트륨 없이 음식을 섭취하지 않은 벌레들은 항화성 지수가 양성으로 나타났으며, 이는 염화나트륨 농도를 선호함을 나타냈다. 반대로, 높은 염화나트륨 농도와 먹이가 없는 상태, 중간 정도의 염화나트륨 농도, 음식 없이 먹이와 염화나트륨을 섭취하지 않은 상태에서 조성된 벌레는 낮은 염화나트륨 농도를 선호하는 음의 주화 지수를 보였다. 염화나트륨 식품 협회는 60분 후에도 화학주성 지수를 유지했으며, 음식에 조건화된 벌레에서 자주 변화하여 동물들이 돌아다니며 먹이를 찾는 동안 이 연관성을 업데이트하는 동적 연상 학습을 나타냈다.