A workflow for the quantitative assessment of the endophytic and epiphytic bacterial microbiomes of the Bark of Populus trichocarpa(Populus trichocarpa 껍질의 내생식물 및 착생식물 세균 마이크로바이옴의 정량적 평가를 위한 워크플로우)

[발표자] Populus trichocarpa 껍질의 내생 및 상피 박테리아 미생물 군집의 정량적 평가를 위한 워크플로. 여기에서 우리는 Populus trichocarpa의 내부 조직이나 껍질 표면에 식민지화하는 마이크로바이옴을 연구하기 위한 상세한 워크플로를 설계하고 테스트했습니다. 이 워크플로는 Populus trichocarpa 껍질의 내생 및 상피 미생물 군집의 샘플링, 수집된 물질의 처리, 게놈 DNA 추출, 표적 영역의 PCR 증폭, DNA 라이브러리 준비 및 차세대 시퀀싱 기술을 통한 내생 및 상피 박테리아 미생물군집의 시퀀싱. 또한 얻은 시퀀싱 데이터에 대한 간단한 분석 절차를 제공합니다. 이 입증된 워크플로는 Populus trichocarpa 및 기타 임업 종의 껍질의 내생 및 상호 미생물군집 군집을 경험적으로 조사하기 위한 효과적인 접근 방식을 제공할 것입니다. 성장실에서 3개월 된 Populus trichocarpa 묘목을 키우고 멸균된 가지치기를 사용하여 멸균된 토양 표면에서 2cm에서 12cm 사이의 Populus trichocarpa 줄기 부분을 자릅니다. 줄기 부분을 멸균된 정사각형 페트리 접시에 넣습니다. 멸균된 정사각형 페트리 접시에서 줄기의 표피를 0.1%의 멸균 면을 사용하여 반복적으로 닦습니다. 트윈 20. 미생물이 포함된 각 면화 조각, 상호 샘플을 섭씨 영하 80도의 멸균 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 보관합니다. 줄기 표면을 닦은 후 멸균 메스로 껍질을 자르고 껍질을 벗겨 정사각형 페트리 접시에 담습니다. 줄기에서 벗겨낸 나무 껍질을 멸균 메스로 약 1cm 조각으로 자릅니다. 세그먼트 표면을 70% 알코올에 2분 동안 담가 살균한 다음 세그먼트를 0.1%가 함유된 차아염소산나트륨, 트윈 80에 5분 동안 담그십시오. 마지막으로 세그먼트를 70% 알코올로 30초 동안 멸균합니다. 그런 다음 모든 샘플을 멸균 증류수로 세 번 세척하고 깨끗한 벤치에 놓아 공기 건조시킵니다. 멸균된 각 줄기 껍질 내생 샘플을 섭씨 영하 80도의 멸균 2밀리리터 원심분리기 튜브에 보관합니다. 줄기 껍질 부분을 멸균된 5밀리리터 단단한 튜브에 넣고 각 튜브에 멸균된 강철 구슬 3개를 추가합니다. 샘플이 들어 있는 단단한 튜브를 액체 질소에 10분 동안 동결합니다. 비드 비터로 5분 동안 나무 껍질 샘플을 분쇄합니다. 그런 다음 하드 튜브를 액체 질소에 1분 동안 다시 얼리고 비드 치기 단계를 5분 동안 반복합니다. Populus trichocarpa의 으깬 줄기 껍질과 면화 부착 접시 박테리아 군집을 각 비드 튜브에 각각 0.25g씩 첨가한 다음 상용 키트에서 공급되는 60마이크로리터의 용액 C1을 추가하고 반전시켜 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 비드 비터를 사용하여 내생 및 상피 샘플을 1분 동안 4회 균질화합니다. 각 실행 후 샘플을 얼음 위에 30초 동안 놓습니다. 튜브를 10,000배 중력에서 1분 동안 원심분리하고, 제조업체의 지침에 따라 키트를 사용하여 내생 및 상피 샘플을 추출한 다음 백색 필터 멤브레인 중앙에 30마이크로리터의 용액 C6을 첨가하고 섭씨 25도에서 5분 동안 배양합니다. 실온에서 10,000배의 중력으로 1분 동안 원심분리합니다. 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 상피 및 내생 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 농도를 측정합니다. 각 DNA 샘플을 멸균 ddH2O로 마이크로리터당 2나노그램으로 희석하여 PCR 증폭을 위한 DNA 주형을 얻습니다. 순방향 프라이머 799F 및 역방향 프라이머 1193R을 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자의 V5 내지 V7 영역을 증폭합니다. 한편, 정방향 프라이머 5115F 및 역방향 프라이머 806R을 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 증폭한다. 모든 샘플을 철저히 혼합하고 원심분리하여 기포를 제거합니다. 열 순환기에서 박테리아 16S rRNA 유전자의 V5에서 V7 또는 V4 영역의 증폭을 수행합니다. 각 샘플 앰플리콘 5마이크로리터를 1% 아가로스 겔에 로드하고 120볼트에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다. 성공적인 PCR 증폭을 검증하기 위해 UV 조명 아래에서 겔을 봅니다. 각 샘플에 대해 PCR 튜브에 PCR 증폭 산물의 3회 반복을 혼합합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 증폭된 제품의 농도를 결정하십시오. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다. 표준 DNA 곡선을 그려 증폭된 산물의 DNA 농도를 계산하는 데 사용합니다. 측정된 농도에 따라 Populus trichocarpa 껍질에서 얻은 내생 또는 착생 샘플의 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합하여 Amplicon 라이브러리를 구축합니다. 전기영동 장치를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행합니다. 1.3% 아가로스 겔, 1.3g의 아가로스 분말을 100밀리리터의 1배 TAE 완충액에 간단히 준비합니다. 겔 응고 후 빗을 제거하고 GEE를 TAE 완충액 1배가 있는 전기영동 탱크에 넣습니다. 다음으로, 각 웰에 100마이크로리터의 사다리를 로드한 상태에서 각 PCR 산물의 5개 부피 단위에 6배 주황색 로딩 버퍼 1개의 부피 단위를 추가합니다. 30마이크로리터의 DNA 사다리를 하나의 웰에 추가합니다. 양극선과 음극선을 연결한 후 80볼트에서 50분 동안 전기영동을 수행합니다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 아가로스 겔에서 DNA 단편을 절제합니다. 젤 조각의 무게를 측정하고 무색 튜브에 옮깁니다. 젤 슬라이스를 담그기 위해 완충액을 첨가합니다. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔 추출을 수행합니다. 시퀀싱 프로파일링을 위한 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 형광계에서 정제된 Amplicon 라이브러리의 농도를 결정합니다. 형광계를 사용하여 표준 및 샘플 분석 튜브를 읽고 단일 밴드를 시각화하여 라이브러리의 품질을 확인합니다. CHAM II를 사용하여 16S rRNA 유전자 서열을 분석하고 주석을 달 수 있습니다. 참조 서열에 따라 Silver Database를 사용하여 분류학적 주석을 작성합니다. R의 ggplot2 패키지를 사용하여 이러한 결과를 시각화합니다. Populus trichocarpa 껍질의 내생 및 상피 박테리아 미생물군집의 고품질 게놈 DNA를 얻었습니다. 12개 샘플 모두의 PCR 증폭은 올바른 크기의 단일 강 밴드를 산출했습니다. Amplicon 라이브러리는 사전 시퀀싱 요구 사항을 충족하는 단일 피크로 추가로 구축되었습니다. 내생 마이크로바이옴의 경우, 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R을 각각 사용하여 고품질 판독값을 얻었습니다. 프라이머 쌍 799F/1193R은 증폭된 식물 판독값이 훨씬 적었습니다. Populus trichocarpa 껍질의 상피 마이크로바이옴에서 나온 ASV의 수는 515F/806R 프라이머에 비해 799F/1193R을 사용할 때 유의하게 더 높았습니다. Shannon Index는 프라이머 쌍 799F/1193R을 사용하여 내생 박테리아 군집보다 나무 껍질의 착생 박테리아 군집에서 더 낮은 것으로 추정되었습니다. Populus trichocarpa의 내생 및 착생 껍질 부분에서 박테리아 군집의 분류학적 특성은 프라이머 쌍 799F/1193R을 사용하여 추가로 조사되었습니다. Populus trichocarpa 껍질의 내생 및 상피 박테리아 미생물군집의 구성과 다양성을 정량화하기 위해 샘플 수집에서 데이터 분석에 이르기까지 신뢰할 수 있고 효율적인 워크플로우가 구축되었습니다. 우리의 프로토콜은 목본 식물 종의 나무 껍질 미생물군집을 연구하는 경로 역할을 하여 다른 목본 식물에 서식하는 박테리아 군집의 특성을 더 잘 이해할 수 있습니다.