Name: 철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위한 정량화 가능하고 저렴한 cell-free 형광 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 발견하세요 철 킬레이트화 화합물을 선별하기 위한 저렴한 형광 분석법을. Calcein 형광 프로브를 사용하여 철 결합 경쟁을 측정하고 암 대사 교란 연구에 활용할 수 있는 정량적 결과를 제공합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>새로운 철 킬레이트 검출을 위한 형광 분석

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>암모늄 철 (II) 황산염 육수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>215406</td><td>FAS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>시그마 알드리치</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Deferiprone</td><td>시그마 알드리치</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco & 프라임; s 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>마그네슘 및 칼슘 프리</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>광학적으로 투명한 96 웰 플레이트가 작동합니다</td></tr></tbody></table>.

철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위한 정량화 가능하고 저렴한 cell-free 형광 방법 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

2단계에 표시된 방법의 경우, 이 첫 번째 실험(그림 1)은 Calcein 형광 방출을 감지할 때 마이크로타이터 형광 플레이트 리더의 선형 범위를 설정했습니다. 당사의 대표적인 결과는 0-100 μM의 광범위한 Calcein 형광 범위를 보여줍니다. LSD 사후 분석을 통한 ANOVA는 0 μM의 Calcein 대조군과 비교할 때 모든 Calcein 농도에 대한 평균 RFU에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보여줍니다. 추가 실험에서는 1μM Calcein이 사용되었는데(단계 3 및 4), 이는 0μM 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 생성하고 유세포 분석법(13)에서 Calcein AM 형태로 세포에 일반적으로 적용되는 범위 내에 속합니다.
3단계에 표시된 방법의 경우 Fe2+ 형태의 철을 0-1000μM(FAS)에서 1μM Calcein 범위에 첨가하면 Fe2+ 이온이 Calcein 형광(RFU)이 선형 감소함을 보여줍니다. 이를 통해 Calcein 형광의 Fe2+ 기반 퀜칭을 관찰할 수 있습니다. 약한 철 킬레이트제인 칼세인은 철과 결합하여 형광 출력을 감소시킵니다. 그림 2에서 8.9μM FAS 이상의 농도는 1μM Calcein 단독과 비교할 때 Calcein 형광에서 p&lt;0.001로 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 8.9μM의 FAS를 사용하면 Calcein 형광(평균 RFU)이 33% 감소했습니다. 추가 실험(단계 4)을 위해 10μM FAS가 Calcein의 형광 소광 범위 내에 있으므로 사용되었습니다.
4단계에서 보여준 방법의 경우, 철 킬레이터에 의한 Fe2+ 이온에 대한 Calcein의 경쟁을 그림 3에서 관찰할 수 있습니다. Fe2+ 형태의 철은 1μM 대조군에서 Calcein 형광을 감소시키고 철 킬레이터 deferiprone은 이 형광을 피크까지 증가시켜 Calcein의 철 소멸을 방출하고 형광(평균 RFU)을 증가시킵니다. 0.97-512 μM 범위의 농도에서 Deferiprone(예시로 사용됨)은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(p&lt;0.001)에서 관찰된 바와 같이 형광의 통계적으로 유의한 증가를 초래했습니다. 가장 큰 폴드 변화는 1μM calcein AM 및 10μM FAS의 대조군과 비교할 때 62.5μM의 킬레이터에서 평균 RFU의 3배 변화였습니다. 512μM 이상의 deferiprone에서는 킬레이터와 1μM의 Calcein 및 10μM의 FAS의 대조군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> 그림 1: 형광 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 측정한 칼세인 농도 및 형광(RFU). 30분 동안 배양하고 측정된 형광(RFU)을 0-100μM의 Calcein 농도가 여기에 나와 있습니다. 데이터는 실험당 8번의 반복실험과 3번의 독립적인 실험의 평균을 보여주며, 오차 막대는 평균에 대한 95% 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p&lt;0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 결정됩니다. 각 농도의 평균 Calcein RFU는 PBS 및 0μM Calcein의 대조군과 비교됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> 그림 2: FAS 농도가 증가하면 Calcein 형광이 선형적으로 감소합니다. FAS의 농도는 0-1000 μM에서 증가하여 PBS에서 30 분 배양 후 1 μM Calcein 형광의 선형 감소를 초래했다 표시된 데이터는 실험 당 5 회 반복 및 3 개의 독립적 인 실험의 평균이며, 오차 막대는 평균에서 95 % 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p&lt;0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 결정됩니다. FAS와 Calcein 1μM의 각 농도의 평균 Calcein RFU는 PBS에서 1μM Calcein 0μM의 FAS 대조군과 비교됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> 그림 3: 데페리프론의 농도 증가. deferiprone의 농도는 PBS에서 1 μM Calcein, 10 μM FAS의 배양으로 0-1000 μM에서 증가시켰다. 형광은 멀티모달 마이크로플레이트 리더에서 측정했습니다. 표시된 데이터는 실험당 5번의 반복실험과 3번의 독립적인 실험의 평균이며, 오차 막대는 평균에서 95% 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p&lt;0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 측정됩니다. 10 μM FAS 및 0 μM Deferiprone이 있는 PBS의 1 μM Calcein과 비교한 평균 RFU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>농도 (μm)</td>
			<td>부피 (1 mM 재고)</td>
			<td>PBS의 볼륨</td>
			<td>총 볼륨</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 마이크로리터</td>
			<td>200 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 마이크로리터</td>
			<td>600 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 마이크로리터</td>
			<td>800 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>900 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 마이크로리터</td>
			<td>950 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 마이크로리터</td>
			<td>975 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 마이크로리터</td>
			<td>990 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 마이크로리터</td>
			<td>994 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 마이크로리터</td>
			<td>1mL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Calcein 2차 스톡 준비.

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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