Name: Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: 배우세요 진핵생물 세포 주기 조절 메커니즘을 이해하기 위한 Yeast Two-Hybrid Assay 방법입니다. 이 기술은 상호 작용-null 또는 손상된 돌연변이를 효율적으로 분리하여 단백질 상호 작용의 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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Y. Tanaka는 Y2H의 기술 개선을 수행했습니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI 그랜트 넘버 JP22K06336와 오사카 발효 연구소의 지원을 받고 있습니다.

1. 돌연변이 도서관의 구축
<ol><li>중합효소 연쇄 반응(PCR)을 설정합니다(아래 예시 참조). 일반적으로 50 μL의 반응액을 50 μL의 10개 부분 표본으로 나누어 PCR 기계에서 표적 유전자 절편을 증폭한다4. 참고: 사용자는 돌연변이를 효율적으로 도입하기 위해 적절한 중합효소를 선택해야 합니다. 증폭할 DNA 단편이 짧으면 교정 활성이 부족한 Taq 중합효소와 같이 오류율이 더 높은 중합효소가 필요합니다. 증폭할 DNA 단편이 길면 돌연변이의 수를 줄이기 위해 더 높은 충실도의 중합효소가 필요합니다. 돌연변이는 일반 Taq 중합효소4로 30 사이클의 증폭 후 백 염기쌍마다 발생합니다. 대표적인 결과에서는 일반 Taq 중합효소보다 충실도가 높은 다른 Taq 중합효소를 사용하였으며( 재료 표 참조), 돌연변이율은 600 염기쌍 중 1개였습니다. PCR 혼합물의 예, 프라이머 세부 정보 및 반응 조건은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.</li>
	<li>PCR이 완료되면 반응의 모든 부분 표본을 결합하고 아가로스 겔 전기 영동 등을 사용하여 관심 DNA 단편이 증폭되었는지 확인하고 DNA5를 정제합니다.</li>
	<li>'seamless' 클로닝 전략을 사용하여 1.2단계에서 생성된 DNA 단편을 적절한 Y2H 벡터와 조립합니다(그림 1). 참고: Gibson assembly6과 같은 Seamless cloning 시스템은 self-ligation을 통해 생성된 빈 벡터에 의한 구성된 mutant library의 오염을 최소화합니다. Y2H 벡터 목록은 표 1에 나와 있습니다. 조립 전에 BamHI 소화로 준비할 수 있습니다. 모든 플라스미드는 National BioResource Project - yeast에서 구할 수 있습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>단계 1.3에서 생성된 반응 혼합물을 고효율 E. coli 형질전환 프로토콜(예: Inoue et al.7)에 따라 제조된 Escherichia coli 유능한 세포에 도입합니다. 적절한 항생제가 포함된 여러 LB 플레이트(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 1%, 한천 2%)에 모든 유능한 세포를 펴 바릅니다(재료 표 참조). 이 시점에서 소량(전체 반응의 ~1/100)을 동일한 선택 플레이트에 펴서 라이브러리 역가를 계산합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>많은 수의 대장균 군집이 나타나면 일회용 플라스틱 고리를 사용하여 플레이트 표면의 모든 세포를 긁어냅니다. 알칼리 용해8과 같은 널리 사용되는 방법을 사용하여 이러한 세포에서 플라스미드 DNA를 회수합니다. 동시에, 변형 혼합물의 작은 부분 표본을 플레이트에 펴 넣은 후에 나타나는 콜로니의 수를 계산하십시오. 이 숫자를 사용하여 라이브러리에 있는 독립 클론의 총 수를 추정합니다. 참고: 이 시점에서, 형질전환 반응의 작은 부분 표본이 퍼진 플레이트에 나타나는 몇 개의 독립적인 콜로니(4-6)를 선택하여 별도로 배양하고 플라스미드를 분리하여 거의 모든 클론이 원하는 DNA 단편을 운반하는지 확인합니다5. E. coli에서 플라스미드를 분리하기 위해 많은 상용 키트를 사용할 수 있습니다. 작은 부분 표본을 퍼뜨린 후 플레이트에 나타나는 콜로니의 수는 수동으로 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>라이브러리 DNA 풀의 농도를 측정합니다. 보통, 라이브러리 DNA의 백 나노그램은 다음 단계에서 수 천 개의 형질전환체를 수득하기에 충분하다. 참고: A260 의 측정은 종종 부정확하기 때문에 DNA에 결합하는 형광 염료를 사용하여 DNA 농도를 측정하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. mutant library 및 replica plating을 이용한 효모의 형질전환
<ol><li>약 100ng의 DNA를 사용하여 Y2H 분석을 위해 돌연변이 라이브러리를 숙주 효모 균주(TAT-7(L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ)에 도입합니다. 'bait' plasmid로 숙주 세포를 pre-transto-transform 합니다.<ol><li>형질전환 절차 후, 효모 세포를 멸균수에 현탁시키고 적절한 플레이트에 다른 양의 분취액을 펴 바릅니다(일반적으로 류신 및 트립토판이 부족한 SC 배지: SC-LW[0.67% 효모 질소 염기, 2% 포도당, 1.546g/L SC 이중 탈락 혼합물-Leu -Trp, 2% 한천, 재료 표 참조]). 이 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다. 참고: ~5 × 106개의 대수적으로 성장하는 세포가 있는 리튬 아세테이트-PEG 방법11과 같은 표준 프로토콜은 효모의 변형에 충분합니다. electroporation과 같은 높은 변형 효율을 가진 다른 방법도 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음 날 작은 콜로니가 나타나면 적절한 수의 세포(500-2000)가 있는 플레이트를 선택하고 다음과 같이 복제합니다.</li>
	<li>복제본 블록에 두 장의 여과지를 놓고 여러 복제본을 만듭니다(매체는 카나마이신을 함유한 SC-LW 및 SC-LW임)( 재료 표 참조). 30 °C에서 1-2일 동안 배양합니다. 참고: 카나마이신(G418)의 농도는 600μg/mL입니다. 콜로니의 해상도가 손실되기 때문에 복제 도금에 벨벳을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>군체가 자라면 접시를 비교하고 후보를 선택하십시오. lacZ 가 리포터로 사용되는 경우 Y2H 색상 분석(3단계 참조)을 수행합니다. 참고: Y2H 리포터의 경우 lacZ 는 일반적으로 HIS3보다 약한 상호 작용을 더 잘 감지합니다.</li>
</ol>3. Y2H 색상 분석
<ol><li>2단계를 사용하여 준비한 복제 플레이트에 적절한 크기로 미리 자른 여과지 한 장을 놓습니다. 여과지와 플레이트 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하세요. 알림: No. 4A 여과지 또는 50등급 여과지를 사용하십시오( 재료 표 참조). 복제 도금으로 만들어진 카나마이신 플레이트를 포함하는 모든 SC-LW 또는 SC-LW를 색상 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트의 여과지가 완전히 젖었을 때(여과지의 색이 완전히 변할 때) 종이 타월 여러 장을 위에 놓고 여과지에 닿게 하여 과도한 수분을 제거합니다. 종이 타월이 물을 흡수하여 색이 변하면 제거하십시오. 이 과정을 두세 번 반복합니다.</li>
	<li>여과지의 가장자리를 핀셋으로 잡아 플레이트에서 빠르게 벗겨내고 액체 질소에 담가 얼립니다. 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 콜로니 면이 위로 향하게 하여 여과지를 플라스틱 트레이에 놓고 즉시 냉동고(-20 °C에서 -80 °C)에 넣어 완전히 얼립니다.</li>
	<li>얼린 여과지를 제거하고 콜로니 면이 위로 향하게 하여 마른 종이 타월에 올려 해동합니다. 해동 직후 플라스틱 트레이 또는 밀봉 가능한 용기에 놓고 X-gal(5-브로모-5-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드) 및 2-메르캅토에탄올9(재료 표 참조)를 포함하는 Z-버퍼(60mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl 및 1 mM MgSO4, pH 7.0)에 담근 다른 여과지 위에 여과지를 놓습니다). 상단과 하단 여과지 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>여과지가 들어있는 플라스틱 트레이를 덮고 밀폐 용기나 비닐 봉지에 넣습니다. 밀폐 용기나 비닐 봉지를 닫고 파란색이 나타날 때까지 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>파란색이 나타나면 깨끗한 플라스틱 트레이에 놓인 약 500μL의 정지 용액(1M Na2CO3)에 콜로니 면이 위로 향하게 하여 여과지를 놓습니다. 용액이 빠르게 스며드는 것을 중지하십시오. 따라서 필터를 즉시 제거하고 콜로니 면이 위로 향하게 하여 새 종이 타월에 놓고 건조시키십시오.</li>
	<li>종이 타월을 교체하고 필터를 충분히 건조시킨 후 스캐너나 다른 장치를 사용하여 데이터를 캡처합니다.</li>
</ol>4. 후보 클론의 회수 및 확인
<ol><li>복제본의 원래 플레이트(또는 색상 분석에 사용되지 않는 복제된 플레이트)에서 흰색 및 KanR 후보 클론을 선택합니다. 그림 1C에 예가 나와 있습니다. 카나마이신이 함유된 SC-LW 배지에 작은 패치로 다시 스트리킹하고 30°C에서 1-2일 동안 배양하여 후보 클론이 흰색이고 KanR 인지 확인합니다. 적어도 두 세트를 만들거나 다음 날 반복하십시오. 참고: 옅은 파란색 콜로니는 상호 작용을 유지할 수 있으므로 흰색 콜로니를 선택해야 합니다.</li>
	<li>후보 클론이 다시 잘 성장하면 3단계에서 설명한 대로 4.1단계에서 생성된 플레이트를 하나 이상 사용하여 색상 분석을 반복하고 플레이트가 흰색으로 유지되고 파란색으로 변하지 않는지 확인합니다(그림 2A). 참고: 후보를 다시 스트리킹할 때 많은 양의 셀을 이월하지 마십시오. 세포가 너무 많으면 KanR 과 KanS 클론을 구별할 수 없습니다.</li>
	<li>플레이트 잔재에서 4.2단계에서 생성된 여전히 흰색이고 KanR 인 클론을 취하고 30°C에서 하룻밤 동안 1mL의 선택 배지(라이브러리 구성에 사용되는 벡터에 따라 SC-L 또는 SC-W)에서 독립적으로 성장시킵니다.</li>
	<li>배양액을 마이크로튜브로 옮기고 원심분리(~15,000 × g, 실온에서 10-30초 동안)로 세포를 수집합니다. 다음과 같이 세포 펠릿에서 전체 DNA를 분리합니다.</li>
	<li>2-메르캅토에탄올 각각 1μL와 20mg/mL Zymolyase 100T( 재료 표 참조)를 함유한 400μL의 용해 완충액(2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-Cl(8.0) 및 1mM EDTA)에 세포 펠릿을 현탁시키고 37°C에서 30분 동안 배양하여 세포벽을 분해합니다. 이때 5-10분마다 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>세포 현탁액이 불투명해지거나 반투명해지면 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1)의 혼합물을 동일한 부피로 추가하고 10-20초 동안 적당한 속도로 소용돌이치면서 잘 혼합합니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기에서 마이크로 튜브를 최고 속도(실온에서 ~15,000 × g)로 5분 동안 원심분리하고 새 마이크로튜브에서 DNA가 포함된 수성상을 복구합니다. 0.8 부피의 이소프로판올을 넣고 튜브를 뒤집어 잘 섞는다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 2-3분 동안 방치한 다음 마이크로 원심분리기에서 최고 속도(실온에서 ~15,000× g)로 4-5분 동안 원심분리하여 DNA를 침전시킵니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 약 500μL의 70% 에탄올로 침전물을 세척합니다. 에탄올을 완전히 제거하고 침전물을 잠시 건조시킵니다.</li>
	<li>20μL의 TE 완충액(10mM Tris-Cl(8.0) 및 1mM EDTA)을 침전물에 넣고 짧게 혼합한 다음 튜브를 실온에서 밤새 방치하여 침전물을 용해시킵니다. 알림: 사용자가 급한 경우 튜브를 37-50 °C로 유지하십시오. DNA 침전물은 몇 시간 안에 용해됩니다.</li>
	<li>펠릿이 완전히 용해되면 소량의 이 DNA 용액으로 E. coli 를 형질전환시킵니다. NOTE: 형질전환 효율이 높은 E. coli 를 사용하는 경우 약 0.5μL의 DNA 용액으로 충분합니다.</li>
	<li>E. coli colony가 나타나면 여러 개의 독립적인 colony를 선택하여 배양하고 알칼리 용해와 같은 표준 방법으로 플라스미드를 회수합니다.</li>
	<li>단계 4.12에서 얻은 플라스미드 DNA를 bait 플라스미드를 품고 있는 Y2H 숙주 세포에 도입합니다. 형질전환체가 나타나면 color assay(흰색으로 보여야 함) 및 western blotting4 (원하는 크기의 단백질을 발현해야 함)로 확인합니다. 참고: 포스트 알칼리성 방법12 는 효모에서 전체 세포 추출물을 준비하는 쉽고 빠른 방법입니다.</li>
	<li>위의 두 가지 기준이 충족되면 뉴클레오티드 시퀀싱4에 의해 클론의 돌연변이 부위를 결정합니다.</li>
</ol>

Yeast Two-Hybrid 기법을 이용한 생체 분자 상호 작용 연구 

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 문서에서는 Y2H 분석을 사용하여 interaction-null/impaired mutant를 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 돌연변이는 관심 단백질의 기능을 분석하는 강력한 도구입니다. 이러한 돌연변이를 분리하기 위해, rY2H 분석은 이전에 Y2H 숙주 균주 2,3을 변형하여 개발되었다. 그러나 그들은 노동의 양을 크게 줄이지는 않았습니다. 대조적으로, 돌연변이는 상당한 양의 노력 없이 이 방법으로 분리할 수 있습니다. 이 방법에서 Y2H 벡터를 수정하면 이론적으로 모든 후보가 야생형 또는 미스센스 돌연변이가 됩니다. 또한 이 방법은 후보에서 빈 벡터를 효율적으로 제거할 수 있습니다. 이러한 바람직한 특성으로 인해 이 방법은 interaction-null/impaired mutants를 분리하는 표준 방법이 될 수 있습니다.
방법은 간단하고 간단하지만 좋은 결과를 ...

생체 분자 간의 상호 작용은 생물학적 현상의 가장 기본적인 부분입니다. 단백질-단백질 상호 작용은 이러한 상호 작용의 중요한 부분을 구성합니다. 따라서 관심 단백질의 상호 작용 파트너를 식별하는 것은 관심 단백질/유전자의 기능을 추가로 설명하는 데 중요합니다. Y2H(yeast two-hybrid) 분석법은 생체 내단백질-단백질 상호작용을 식별하는 데 널리 사용되는 기법입니다 1. 이 시스템에서는 상호 작용을 테스트해야 하는 두 개의 단백질(X 및 Y)이 각각 DNA 결합(DB) 도메인과 전사 활성화 도메인(AD)에 융합됩니다. DB-X 융합 단백질은 DB 도메인의 인식 서열에 결합합니다. 따라서 단백질 X와 Y가 상호 작용할 때 AD-Y 융합 단백질은 인식 시퀀스의 근접성으로 들어옵니다. 결과적으로, 인식 서열의 다운스트림에 있는 리포터 유전자의 전사가 활성화됩니다. 따라서, 리포터 유전자 활성의 존재 또는 부재는 단백질-단백질 상호작용의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수있다 1.
관심 단백질의 특정 상호작용 파트너가 확인되면 상호작용의 생물학적 기능을 규명하기 위해 추가 분석을 수행해야 합니다. 이를 위해 특정 단백질-단백질 상호 작용을 손상시키거나 제거하는 단백질의 돌연변이를 분리할 수 있다면 강력한 도구가 될 것입니다. Y2H 시스템은 야생형 '상호작용 양성' 클론을 시작으로 '상호작용 음성' 클론을 스크리닝하여 이러한 돌연변이를 직접 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 과정을 가속화하기 위해 '역' Y2H(rY2H) 시스템이 개발되었습니다 2,3. rY2H 시스템에서 숙주 효모 균주는 리포터 유전자로 역선택 가능한 마커 유전자를 보유하며, 이는 효모 세포가 AD-Y 및 DB-X 단백질이 상호 작용하지 않을 때만 성장한다는 것을 의미합니다.
Y2H 및 rY2H 시스템 모두 상호 작용 음성 돌연변이의 분리를 허용하지만, 스크리닝을 통해 얻은 모든 후보 물질이 원하는 유형의 돌연변이(일반적으로 미센스 돌연변이)를 가지고 있지 않기 때문에 돌연변이를 분리하는 과정은 힘들다. 가장 심각한 문제는 후보 물질의 상당수가 프레임시프트 또는 말도 안 되는 돌연변이를 가지고 있다는 것이며, 원치 않는 클론을 배제하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행해야 한다는 것입니다. 이 문제를 극복하기 위해 새로운 플라스미드 벡터가 개발되었다4. 이러한 벡터에서 약물 내성 마커인 KanMX는 DB 도메인 또는 AD의 프레임 밖 다운스트림에 위치합니다. marker gene은 관심 유전자가 삽입된 경우에만 DB domain 또는 AD와 함께 in-frame이 됩니다. 관심 유전자에 무작위 돌연변이가 도입되면 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이와 같은 바람직하지 않은 돌연변이는 약물 내성 선별을 수행하여 쉽게 제거할 수 있으며, 바람직한 미센스 돌연변이를 가진 후보 물질은 Y2H 스크리닝4으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 기사에서는 이 전략을 사용하여 관심 단백질의 interaction-null/impaired 돌연변이를 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (8.0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS 솔루션</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>키시다 화학(주)</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>의료 & 생물학 실험실 Co. 주식 회사.</td>연어 고환의 <td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>머크 KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>콜로니 리프트용 여과지(50학년)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>콜로니 리프트용 여과지(No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>복제용 여과지 (No.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>G-418 황산염</td><td>후지 필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>키시다 화학 주식회사</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&황소; 12H2O</td><td>나칼라이 테스크</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai 테스크 Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; 2H2O</td><td>나칼라이 테스크</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 DNA</td><td>: 국가 생물 자원 프로젝트 - 효모(https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 분리 키트</td>, <td>Nippon Genetics Co., Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 #4,000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC 더블 드롭아웃 믹스 -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Seamless 클로닝 키트(In-Fusion 어셈블리)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트</td><td>후지필름 Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합 효소 (GoTaq 그린 마스터 믹스)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS의 (히드록시메틸) 아미노메탄</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>나칼라이 테스크</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>211705 트윈 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 염기 (YNB)</td> <td>Formedium</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>제07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>호

yeast two-hybrid assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

단백질-단백질 상호 작용은 생물학적 현상의 기초가 되는 가장 기본적인 과정 중 하나입니다. 특정 단백질-단백질 상호 작용의 역할과 기능을 이해하는 가장 간단하고 좋은 방법 중 하나는 야생형(관련 단백질-단백질 상호 작용 포함)의 표현형과 관련 상호 작용이 없는 돌연변이의 표현형을 비교하는 것입니다. 따라서 이러한 돌연변이를 분리할 수 있다면 관련 생물학적 과정을 설명하는 데 도움이 될 것입니다. Y2H(yeast two-hybrid) 절차는 단백질-단백질 상호작용을 검출할 뿐만 아니라 상호작용-null/손상된 돌연변이를 분리하는 강력한 접근법입니다. 이 기사에서는 Y2H 기술을 사용하여 상호 작용 null/손상된 돌연변이를 격리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, polymerase chain reaction과 효율적인 seamless cloning 기술을 결합하여 mutation library를 구성하며, 이는 library에서 빈 vector를 효율적으로 제외합니다. 둘째, interaction-null/impaired mutants는 Y2H assay에 의해 스크리닝됩니다. Y2H 벡터의 속임수로 인해 프레임시프트 및 넌센스 돌연변이와 같은 원치 않는 돌연변이가 스크리닝 프로세스에서 효율적으로 제거됩니다. 이 전략은 간단하, 그러므로, 그의 상호 작용이 2 잡종 체계에 의해 검출될 수 있는 단백질의 어떤 조합든지에 적용될 수 있다.

최근에는 Pol2 단백질(Pol2-C)의 C-말단 절반이 MCM10과 상호 작용하는 것이 밝혀졌습니다. 두 단백질 모두 DNA 복제의 시작에 필수적이며, 따라서 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae 13,14,15의 세포 성장에 필수적입니다. 이 상호 작용의 생물학적 중요성을 이해하는 데 도움이 되도록 MCM10과 상호 작용이 없거나 감소한 Pol2-C 돌연변이를 여기에 설명된 방법을 사용하여 분리했습니다.
돌연변이 라이브러리는 1단계에서 설명한 방법에 따라 구성되었습니다. Pol2-C DNA 단편을 GoTaq 중합효소로 증폭하고 In-Fusion 효소를 사용하여 Gal4AD(pST2525) 벡터로 클로닝했습니다. 라이브러리에 있는 독립적인 클론의 수는 5000개로 추정되었습니다....

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

우리는 진핵생물에서 세포 주기의 조절 메커니즘, 특히 DNA 복제, 안정적인 생식 유지 및 세포 증식 간의 관계를 이해하는 데 관심이 있습니다. 세포 주기의 진행은 진핵생물에서 cyclin-dependent kinases 또는 CDKs에 의해 조절됩니다. 이것은 DNA 복제의 시작에 대한 경우입니다.우리는 CDK의 기질에서 DNA 복제를 시작하는 방법을 확인했습니다. 관심 있는 단백질의 기능을 이해하려면 야생형과 돌연변이를 비교하는 것이 직접적이고 효과적인 방법입니다. 효모 2 하이브리드 분석은 간단한 검출이며 상호 작용 null 돌연변이를 분리하는 과정을 향상시킵니다.이는 해당 분야의 연구 발전에 기여할 것입니다.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

이 동영상은 특정 단백질 자가 상호작용을 검출하기 위한 효모 2-하이브리드 분석을 보여줍니다. 이 분석에서 관심 단백질은 β-갈락토시다아제 효소를 암호화하는 전사 인자의 두 도메인에 태그가 지정됩니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 전사와 번역이 효소를 형성하게 된 다음 생화학적 분석을 사용하여 검출됩니다.

효모 세포에서 단백질 자가 결합을 결정하기 위한 Yeast Two-Hybrid Assay

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

케토코나졸은 프레그난 X 수용체(PXR) 활성화에 결합하고 길항합니다. PXR 돌연변이의 효모 고처리량 스크리닝은 케토코나졸 결합을 위한 고유한 영역을 정의합니다. 이 효모 기반 유전 방법은 표면 결합 부위와 관련된 리간드와 새로운 핵 수용체 상호 작용을 발견합니다.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 &gt; 1000 TFs 단일 실험에서.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

배우세요 진핵생물 세포 주기 조절 메커니즘을 이해하기 위한 Yeast Two-Hybrid Assay 방법입니다. 이 기술은 상호 작용-null 또는 손상된 돌연변이를 효율적으로 분리하여 단백질 상호 작용의 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

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