Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

Russell Spencer-Smith

doi:10.3791/66436

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET...

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Biochemistry

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Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

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06:44 min

March 1, 2024

DOI: 10.3791/66436-v

Russell Spencer-Smith^1,2,3

¹Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics,Medical University of South Carolina, ²Hollings Cancer Center,Medical University of South Carolina, ³Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research,National Cancer Institute-Frederick

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.

우리 연구의 주요 초점은 희귀 질환 관련 돌연변이 연구를 통해 Ras-MAPK 키나아제 경로의 새로운 취약성을 발견하는 것입니다. 최근에는 살아있는 세포에서 RAF 키나아제의 자동 억제 활성을 측정하기 위한 또 다른 BRET 기반 분석을 개발했습니다. 중요한 것은 이 분석이 BRAF 시스테인이 풍부한 도메인에서 희귀 생식세포 돌연변이 그룹을 특성화하는 데 필수적이었다는 것이며, 이는 BRAF 자동 억제를 유지하고 구성적 BRAF 생물학적 활성을 방지하는 데 이 도메인의 중요한 중요성을 입증했습니다.

이 분석은 1433 단백질과 RAF kinase CRAF의 상호 작용을 측정하며, 이러한 상호 작용은 발병 및 질병 모두에서 RAF 기능을 매개하는 데 필수적인 역할을 합니다. 또한 이 분석은 RAF 자동 억제 및 RAF-RAF 상호 작용을 측정하기 위해 이전에 확립된 분석과 결합되어 살아있는 세포에서 RAF 키나아제의 조절 메커니즘을 분석하기 위한 툴킷의 기초를 형성합니다.

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