Name: 설치류 모델에서 신경근 접합 전달을 평가하기 위한 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 배우세요 설치류에서 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG)를 이용해 신경근 접합 전달을 평가하는 방법을. 쥐 비복근에서 전달 장애를 정량화하여 임상 연구로의 전환을 지원합니다.

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모든 프로토콜은 미주리 대학교의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 정한 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 동물 준비 및 마취 투여
<ol><li>적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
	<li>시술 전에 쥐의 체중을 측정하여 체중 기반 약물 및 인공호흡기 설정에 적합한 복용량을 결정하십시오.</li>
	<li>3%-5% 흡입 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 적절한 수준의 마취가 이루어지면 쥐를 엎드린 자세로 놓고 1%-3% 흡입 이소플루란으로 마취를 유지합니다.</li>
	<li>뒷다리 발패드를 집게로 부드럽게 눌러 금단 반응이 없는지 관찰하여 마취 깊이의 적절성을 확인합니다.</li>
	<li>체온을 37 °C로 유지하십시오.</li>
	<li>수의사가 승인한 석유 성분의 연고를 눈에 바르면 눈이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다. 호흡수를 관찰하고 집게를 사용하여 발패드에 압력을 가할 때 금단 반응을 평가하여 마취 깊이를 모니터링합니다.</li>
	<li>이발기를 사용하여 평가할 뒷다리를 면도합니다. 제모를 충분히 한 후 접착 테이프를 사용하여 발목을 약 90° 배측굴곡으로, 무릎을 펴고, 엉덩이를 외전으로 고정하여 연구할 팔다리를 배치합니다.</li>
	<li>전체 실험 동안 쥐의 호흡과 심박수를 지속적으로 모니터링합니다. 알림: 심박수의 증가는 일반적으로 부적절한 마취 깊이의 지표로 사용됩니다.</li>
	<li>최소 3분 동안 호흡이 멈출 때까지 5% 이상의 용량으로 쥐를 안락사시키기 위해 이소플루란을 투여합니다. 참수로 안락사를 확정한다.</li>
</ol>2. 전극 배치 및 설정
참고: 좌골 신경과 비복근의 NMJ 전달은 근전도(EMG) 시스템을 사용하여 평가됩니다. 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>음극이 있는 좌골 신경을 근위 뒷다리 영역으로 자극하기 위해 절연된 28G 단극 바늘 한 쌍을 삽입하고, 양극은 천골을 덮고 있는 피하 조직 내에 더 근접하게 있습니다.</li>
	<li>좌골 신경이나 기타 인접 구조물에 직접적인 해를 입히지 않도록 자극 전극이 좌골 신경에 바로 근접하거나 과도하게 깊게 배치되지 않도록 하십시오.</li>
	<li>반대쪽 뒷다리 또는 꼬리에 일회용 접지 전극을 놓습니다.</li>
	<li>백금-이리듐 소재로 만들어진 기록 표면이 있는 단일 섬유 EMG용으로 특별히 설계된 27게이지, 25mm 바늘 전극을 오른쪽 비복근에 조심스럽게 배치합니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 매번 사용하기 전에 SFEMG 전극을 고압멸균해야 합니다.</li>
	<li>SFEMG 바늘 전극을 비복근 섬유와 평행하게 삽입하여 단일 섬유 활동 전위(SFAP)를 캡처합니다.</li>
	<li>근육 내에 SFEMG 바늘을 삽입하고 조작하는 동안 근육 손상을 피하십시오.</li>
</ol>3. 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG) 절차
<ol><li>0.3-10mA의 강도 범위와 0.1ms의 펄스 지속 시간을 사용하여 10Hz 주파수로 오른쪽 좌골 신경에 정전류 자극을 적용합니다.</li>
	<li>1kHz의 저주파 필터와 10kHz의 고주파 필터 내에서 필터 설정을 구성합니다. 전위의 시각화를 용이하게 하기 위해 분할당 200 μV에서 1000 μV로 이득을 조정합니다. 스윕 속도를 분할당 500μs로 설정합니다.</li>
	<li>자극 강도를 조정하여 기록 및 후속 분석을 위해 SFAP를 트리거하고 격리합니다.<ol><li>응답을 SFAP로 식별하고 분석하려면 아래에 언급된 특정 기준이 충족되는지 확인하십시오. 기준선 피크에서 음의 위상까지의 상승 시간이 500μs 미만이고, 최소 진폭(기준선 피크에서 음수까지)이 200μV 이상이며, 응답이 일관되게 전부 또는 전무 동작(응답 간의 안정적인 크기 및 모양)을 나타내는지 확인합니다. 참고: 반복되는 응답은 노치나 변곡점 없이 일관된 상승 단계를 나타내는 것이 중요합니다. 마지막 기준은 여러 신호의 합과 품질 신호를 구별하는 데 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>최소 50번의 자극(50-100번의 자극) 후 연속 방전 사이의 SFAP 대기 시간(SFAP의 음의 피크 자극과 상승 단계 사이의 시간) 지터 또는 변동성을 계산하고 차단을 평가 및 정량화합니다. 참고: 차단은 각 시냅스의 존재 또는 부재 또는 단일 섬유 활동 전위 생성을 트리거하지 못하는 자극의 백분율로 평가할 수 있습니다. 지터는 다음 방정식7 을 사용하여 계산됩니다(지터는 일반적으로 클리닉 근전도 시스템에 의해 자동으로 계산됨). <img alt="MCD 지터 공식 다이어그램; 펄스 간 간격을 사용하여 마이크로초 단위로 지터를 계산하는 방법." src="/files/ftp_upload/66452/66452eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> MCD = 연속 차이의 평균값 IPI = 전위 간격</li>
	<li>추가 SFAP 응답에 대해 프로세스를 반복합니다. 평균적으로 각 동물에서 10개의 시냅스를 평가하여 지터를 계산한 다음 동물당 평균값을 결정합니다.</li>
	<li>직접적인 근육 자극에 의해 유발되었을 수 있는 전위가 포함되지 않도록 하기 위해 지터가 4μs 미만인 SFAP를 분석에서 제외한다11.</li>
	<li>간헐적 차단을 나타내는 전위를 기록할 때 자극 강도를 높여 SFAP 실패가 최대값 이하의 자극에 기인하지 않는지 확인합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>설치류의 SFEMG : 건강 및 질병에서 NMJ 기능 평가

<ol><li>Stalberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+velocity+in+human+muscle+fibers+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Propagation velocity in human muscle fibers in situ.</a> Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 27G 재사용 가능한 단일 섬유 바늘 전극</td><td>Technomed</td><td>202860-000</td><td>단일 섬유 기록 전극</td></tr><tr><td>2mL 유리 주사기</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>분리형 케이블</td><td>레코더 전극을 전기 진단 기계에 연결하기 위해</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td></tr><tr><td>리드가 있는 일회용 2" x 2" 디스크 전극</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>접지 전극</td></tr><tr><td>일회용 단극 바늘 28 G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>음극 및 양극 자극 전극</td></tr><tr><td>EMG 바늘 케이블 (암페어/스티임 스위치 박스)</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>은 단극 전극을 전기 진단 자극기에 연결합니다</td></tr><tr><td>. 철제 베이스가 있는 Helping Hands 악어 클립</td><td>Radio Shack</td><td>64-079</td><td>녹음 전극 배치 유지&nbsp;</td></tr><tr><td>이소플루란 (250 mL 병)</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>모노젝트 곡선 팁 관개 주사기</td><td>Covidien</td><td>81412012</td><td>전극 젤</td></tr><tr><td>PhysioSuite 생리학적 모니터링 시스템과 RightTemp Homeothermic Warming</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td><td>적외선 온난화 패드, 직장 프로브, 패드 온도 프로브</td></tr><tr><td>포함 Pro trimmer Pet 그루밍 키트</td><td>Oster</td><td>078577-010-003</td><td>제모용 가위</td></tr><tr><td>쥐 기관내관(16g)</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로코로늄 브로마이드</td><td>시그마</td><td>PHR2397-500MG</td><td>신경근 차단제</td></tr><tr><td>Sierra Summit EMG 시스템</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td>NA</td><td>휴대용 전기 진단 시스템</td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flow 디지털 마취 시스템</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO</td><td>유출 방지, 증기 방지 병 상단 어댑터 포함; Y 어댑터 튜브; 숯 청소 필터</td></tr><tr><td>수의사 석유 기반 안과 연고&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td>은 <td>각막 손상을 피하기 위해 마취 중에 적용됩니다</td></tr></tbody></table>.

설치류 모델에서 신경근 접합 전달을 평가하기 위한 자극 단일 섬유 근전도(sfemg)

Stimulated Single Fiber Electromyography (SFEMG) for Assessing Neuromuscular Junction Transmission in Rodent Models

NMJ 전송 실패의 맥락에서 증가된 지터 및 차단을 입증하기 위해, 자극 SFEMG는 로쿠로늄의 정맥 투여 유무에 관계없이 수행되었습니다. 로쿠로늄(Rocuronium)은 수술 또는 의료 시술 중 근육 마비를 유발하기 위해 임상 환경에서 널리 사용되는 중간 작용, 비분극 신경근 차단제입니다. NMJ19에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 경쟁적으로 결합하여 작동합니다. 로쿠로늄을 투여하기 전에, 성체 야생형 쥐(Sprague Dawley)를 제제하고 섹션 1에 기술된 바와 같이 마취시켰다. 로쿠로늄(rocuronium)에 의해 유발된 마비로 인해, 대표 데이터를 얻기 위해 침습적 인공호흡 지지대가 사용되었다(섹션 1에서 설명한 SFEMG 기록 중 마취에 대한 일반적인 접근법과 대조). 기관내관을 삽입하고 2%-3% 이소플루란을 전달하면서 17mmHg의 압력 및 3cmH2O의 양호기말 압력으로 압력 제어 모드를 사용하여 환기를 60회/분으로 유지했습니다. 인공호흡 지원 및 마취가 달성되면 로쿠로늄 처리(0.05mg/kg 로쿠로늄 브로마이드 정맥 주사)를 사용한 경우와 사용하지 않은 상태에서 단일 섬유 활동 전위를 기록했습니다. 그림 1은 성체 쥐에서 동일한 NMJ의 세 가지 대표적인 단일 섬유 활동 전위 기록을 보여줍니다. 그림 1A는 기준선에서 음의 피크까지 상승 시간이 500μs 미만이고 최소 진폭(피크 대 피크)이 200μV 이상인 단일 파이버 활동 전위(단일 자극 후)의 일반적인 형태를 보여줍니다. 그림 1B는 rocuronium 주입 후 증가된 지터 및 간헐적 차단의 특징을 보여줍니다. 그림 1C는 NMJ 블록의 분해 후 동일한 시냅스에서 지터와 블로킹의 정규화를 보여줍니다. 보기 편하게 하기 위해 그림 1B,C는 9개의 연속 자극 후의 반응만 보여줍니다. 더욱이, 더 나은 이해를 위해 그림 2는 10번의 연속 자극 후 관찰된 3개의 중첩된 단일 섬유 활동 전위의 추가 예를 보여주며, 이는 고조된 지터 및 차단을 보여줍니다.
자극 SFEMG를 사용하여 로쿠로늄이 NMJ 전송에 미치는 영향을 정량화하기 위해 아무런 처리 없이 5 NMJ에서 그리고 로쿠로늄 전달 후 5 NMJ에서 기록을 만들고 지터 및 차단을 분석했습니다(그림 3). 로쿠로늄에 이어 지터(그림 3A)와 블로킹(그림 3B)이 크게 증가했습니다.
<img alt="대기 시간 및 진폭 추세를 보여주는 단일 섬유 활동 전위 그래프; 지터 분석 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 동일한 신경근 접합부(NMJ)의 3가지 대표적인 단일 섬유 근전도 기록. (A) 단일 신경 자극 후 단일 광섬유 활동 전위의 예는 진폭(기준선에서 음의 피크 진폭 최소 200μV) 및 상승 시간(기준선에서 음의 피크까지 500μs 미만) 단일 광섬유 전위로 승인되기 위한 기준을 보여줍니다. (B) 로쿠로늄 투여 후 NMJ 전달 장애가 발생하여 지터가 증가하고 차단이 증가된 9회 연속 자극 후 중첩된 단일 섬유 활동 전위의 예(지터: 68.35μs). (C) 9회 연속 자극 후 중첩된 단일 섬유 활동 전위의 예는 지터가 감소하고 차단이 없음을 나타내며, 이는 로쿠로늄 처리(지터: 21.7μs) 분해 후 NMJ 전송이 정상화됨을 나타냅니다. 대표적인 SFEMG 트레이스는 중첩 시야에서 차단이 없고 정상적인 지터가 있는 건강한 시냅스에서 기록된 단일 근섬유 활동 전위를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="단일 섬유 활동 전위 진폭 그래프; 대기 시간 대 진폭; 차단된 자극 이벤트." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 로쿠로늄 투여 중 연속 자극 후 기록된 3개의 중첩된 단일 섬유 활동 전위(SFAP). 로쿠로늄 투여 중 10회 연속 자극 후 3개의 중첩된 단일 섬유 활동 전위(SFAP)가 기록되었으며, 이는 지터 및 차단이 증가했음을 나타냅니다. A, B 및 C의 지터 값은 각각 24.3μs, 46.9μs 및 88.7μs였습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="NMJ 지터 및 전송 차단 막대 그래프; 평균 지연, 자극 비율; 연구 데이터." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 비탈분극 NMJ 차단제로 처리한 후 신경근 접합 전달(NMJ)에 대한 단일 섬유 근전도 평가. (A) 로쿠로늄 투여(0.05mg/kg) 동안, SFEMG는 건강한 상태(미처리: 12.9 μs, 95% CI [7.2-16.9 μs] 대 로쿠로늄: 40.70 μs, 95% CI [34.7-70.7 μs]) 대비 투과(지터)의 변동성이 증가한 것으로 나타났습니다(Mann Whitney 테스트: p = 0.0079). (B) SFEMG에서 각 시냅스에서 NMJ 차단을 통한 자극의 비율은 건강한 상태에 비해 증가했다(미처리: 0%, 95% CI[0-0%] 대 로쿠로늄: 31%, 95% CI[14.0-59.0%]) (Mann Whitney 테스트: p= 0.0079). 모든 측정(NMJ 차단을 통한 자극의 지터 및 백분율)은 단일 쥐, n = 처리되지 않은 5개의 시냅스 및 rocuronium 처리 후 n = 5개의 시냅스에서 얻었습니다. 데이터는 중앙값 ± 95% 신뢰 구간으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

설치류 모델에서 신경근 접합 전달을 평가하기 위한 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG)

As the final connection between the nervous system and muscle, transmission at the neuromuscular junction (NMJ) is crucial for normal motor function. ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

앞부분 구획 근육에 신경근육학 전기 자극을 murine 모델 (NMES), 안전하고 저렴한 임상 양상은 설명되어 있습니다. 이 모델은 마우스로 타겟 및 특정 근육의 수축을 도출하도록 의도하기위한 목적으로 즉시 사용할 임상 장치 수정의 장점이 있습니다.

신경근육학 전기적 자극에 의​​해 근육 트레이닝의 Murine 모델

이 새로운 방법은 하나의 성인 마우스 motoneuron과 근육 섬유에 의해 생성 된 힘의 측정의 동시 세포 녹음을 할 수 있습니다. 정상과 유전자 변형 동물의 모터 장치의 전기 및 기계적 성질의 결합 조사 신경 근육 시스템의 연구를위한 돌파구이다.

성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화<em&gt; 생체에</em

이 동영상은 기능적 신경근 접합부를 평가하는 방법을 보여줍니다. 근육 조직과 운동 뉴런을 포함하는 생물반응기와 형광 현미경을 사용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 자극하여 전기 신호를 생성하여 근섬유 수축을 일으킵니다.

동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

출처: Marinello, M., et al. 결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 시각화하고 분석하기 위해 공초점 및 초고해상도 현미경을 사용하여 쥐 근육 조직의 신경근 접합부의 준비, 면역염색 및 이미징을 보여줍니다.

결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화

신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

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신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

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상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.

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설치류 모델에서 신경근 접합 전달을 평가하기 위한 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG)

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